国内外狂犬病毒实验室检测与诊断技术的研究及进展
狂犬病病毒检测历史及研究进展
狂犬 病病毒检测历史及研究 进展
卢彦 欣ｈ ， 。 王 雷。扈 荣 良 ，
中 图 分 类 号 ：８ ４ ４ 文 献 标 识 码 ： ￥５ ． Ａ
狂 犬 病 （ ａ ｉ ） 由 狂 犬 病 病 毒 （ ｂｅ ｉｕ） 染 温 Ｒ ｂｅ 是 ｓ Ｒａｉｓｖｒｓ 感 血 动 物 和人 的 中枢 神 经 系 统 后 引 发 急 性 致 死 性 脑 脊 髓 炎 的 一Biblioteka 为六边形蜂房状结构“ 。
２ 组 织 病 理 学 检 测
种 人 兽 共 患 传 染 病 。狂 犬 病 是 迄 今 为 止 人 类 病 死 率 最 高
本 方 法 是 在 现 代 诊 断 方 法 建 立 以前 的 通 用 检 测 方 法 。
的急 性 传 染 病 之 一 ，无 特 效 的 治 疗 药 物 ， 旦 发 病 ， 亡 率 一 死
引起狂犬病的病原是一 种原虫 ， 最后将 狂犬 病命 名为“ 并 神
经 元 中 。 内 基 小 体 呈 嗜 酸 性 染 色 ， 用 姬 姆 萨等 染 色 法 区分 可
内基 小 体 ， 内基 小 体 呈 品 红 色 ， 内有 小 的 深 蓝 或 淡 紫 色 嗜 碱
颗粒 。在人工感染 的病例 中， 的脑 组织 含有 内基小 体， 有 有 的则没有 。临床 病例 的组 织学 检查 中 ， 现 ５ 发 Ｏ％样 品含 有
内基 小 体 ， 以 内 基 小 体 的 检 测 仅 作 为 狂 犬 病 的辅 助 诊 断 所
方法 。
经细胞恐水病” 。尽 管 如 此 ， 年 后 ， 种 Ｎｅｒ 小 体 （ 伊 数 这 ｇｉ 嗜
红 包 含 体 ） 为 狂 犬 病 的一 种 重 要 的 诊 断 特 征盛 行 起 来 。 作 １２ ９ ６年 超 速 离 心 技 术 、 ９ ８年 超 滤 技 术 的 出 现 以 及 １２ １３ ９ ０年 电 子显 微 镜技 术 的 引 人 进 一 步 促 进 了人 类 对 病 毒 及
狂犬病病毒实验室检测方法
狂犬病病毒实验室检测方法摘要：狂犬病（Rabies）是一种重要的人兽共患传染病，由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）感染温血动物和人后引起，近年来又有感染上升的趋势。
一种准确、灵敏、快速的实验室检测诊断方法就显得极为重要。
现就酶联免疫吸附试验（ELISA）、荧光抗体方法（FAT）、快速荧光抑制灶技术（RFFIT）、反转录－聚合酶链反应（RT-PCR）、荧光定量RT-PCR，基因芯片技术和恒温扩增技术等狂犬病病毒实验室诊断方法做一综述。
关键词：狂犬病狂犬病病毒检测方法狂犬病（Rabies）是一种重要的人兽共患传染病，由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）感染温血动物和人后引起，以恐水、畏光、吞咽困难、狂躁、急性致死性脑脊髓炎，进行性麻痹和最终死亡为主要临床特征。
RV可感染多种温血动物引起死亡，表现为高度嗜神经性。
脑组织感染RV后遭到破坏，使得狂犬病感染的病死率几乎100%。
据WHO数据显示狂犬病在全世界150个国家和地区出现过狂犬病病例。
尽管狂犬病可以通过疫苗免疫进行预防，全世界每年仍有超过5.5 万人死于该病，主要集中在亚、非、拉等发展中国家[1]。
中国狂犬病疫情较严重，居世界第2位[2~3]，近年来，狂犬病疫情呈现回升的趋势[4]。
检测狂犬病抗原抗体、分析狂犬病的流行特点，并建立高效、快速、可靠的实验室检测方法可以有效控制此病的流行。
下面主要针对RV的形态特征和分子结构及主要的检测技术进行概述。
1、狂犬病病毒形态特征RV属于弹状病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病病毒属（Lyssavirus）血清/基因1 型，单股负链RNA病毒。
电镜下观察病毒粒子直径为70～80nm，长160～240nm，一端钝圆，另一端平凹，整体呈子弹状[5]。
病毒有双层脂质外膜，其外面镶嵌有1072-1900个8-10nm长的纤突(spike)，为糖蛋白，每个糖蛋白呈同源三聚体形式，电镜还显示了糖蛋白具有“头”和“茎”结构。
狂犬病病毒实验室检测方法
狂犬病病毒实验室检测方法摘要：狂犬病（Rabies）是一种重要的人兽共患传染病，由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）感染温血动物和人后引起，近年来又有感染上升的趋势。
一种准确、灵敏、快速的实验室检测诊断方法就显得极为重要。
现就酶联免疫吸附试验（ELISA）、荧光抗体方法（FAT）、快速荧光抑制灶技术（RFFIT）、反转录－聚合酶链反应（RT-PCR）、荧光定量 RT-PCR，基因芯片技术和恒温扩增技术等狂犬病病毒实验室诊断方法做一综述。
关键词：狂犬病狂犬病病毒检测方法狂犬病（Rabies）是一种重要的人兽共患传染病，由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）感染温血动物和人后引起，以恐水、畏光、吞咽困难、狂躁、急性致死性脑脊髓炎，进行性麻痹和最终死亡为主要临床特征。
RV可感染多种温血动物引起死亡，表现为高度嗜神经性。
脑组织感染RV后遭到破坏，使得狂犬病感染的病死率几乎 100%。
据WHO数据显示狂犬病在全世界150个国家和地区出现过狂犬病病例。
尽管狂犬病可以通过疫苗免疫进行预防，全世界每年仍有超过 5.5 万人死于该病，主要集中在亚、非、拉等发展中国家[1]。
中国狂犬病疫情较严重，居世界第2位[2~3]，近年来，狂犬病疫情呈现回升的趋势[4]。
检测狂犬病抗原抗体、分析狂犬病的流行特点，并建立高效、快速、可靠的实验室检测方法可以有效控制此病的流行。
下面主要针对RV的形态特征和分子结构及主要的检测技术进行概述。
1、狂犬病病毒形态特征RV属于弹状病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病病毒属（Lyssavirus）血清/基因 1 型，单股负链RNA病毒。
电镜下观察病毒粒子直径为70～80nm，长160～240nm，一端钝圆，另一端平凹，整体呈子弹状[5]。
病毒有双层脂质外膜，其外面镶嵌有1072-1900个8-10nm长的纤突(spike)，为糖蛋白，每个糖蛋白呈同源三聚体形式，电镜还显示了糖蛋白具有“头”和“茎”结构。
2狂犬病实验室检测技术指南
附件2 狂犬病实验室检测技术指南1、实验室条件及生物安全操作要求（1）从事狂犬病临床和实验室的工作人员需要暴露前免疫，所有意外暴露于狂犬病毒时必需立即报告本部门负责人。
（2）操作所有潜在狂犬病感染的材料均应在P2或P3（实验室固定毒在P2，病人或动物分离的街毒在P3）生物安全实验室内进行。
（3）当实验室对接收到的动物标本进行操作时，必须在P3以上条件的专业实验室中进行。
没有安全实验室（P3级）的单位，严禁从事病毒分离工作。
（4）实验前要穿戴好防护服装、眼镜、手套，作好技术上的准备。
（5）由于空气传播狂犬病毒已经得到证实，因此高速混悬或离心操作应在密闭状态下进行。
（6）实验后要作好善后消毒处理,狂犬病毒对脂溶剂（肥皂水、醚、氯仿、丙酮），45～70%乙醇，碘制剂和四铵化合物敏感，操作完毕对操作台、实验材料等要用相应的消毒剂或高压蒸汽进行消毒处理。
2、实验室检测网络组成及职责（1）中国疾病预防控制中心牵头，全国各省级疾病预防控制中心及所辖区域内的各级疾病预防控制中心组成实验室检测网络。
（2）中国疾病预防控制中心职责A.诊断试剂的研制、标准化，并推荐质量稳定可靠的诊断试剂；B.负责毒株的鉴定和病毒变异性调查；C.对各级实验室检测人员进行技术培训。
D.协助省级疾病预防控制中心完成标本的实验室检测。
（3）省级疾病预防控制中心职责A.收集、保存辖区内各监测点的各种待检测标本。
B.辖区内各种标本的实验室检测。
C.对本省监测点标本采集和运送给与技术指导和协助。
（4）县级监测点疾病预防控制中心职责采集病例标本，运送病例标本至省级疾病预防控制中心。
3、实验室检测方法（1）病原检测：A.免疫荧光法检测抗原：病人的脑脊髓液或唾液直接涂片、病人的角膜印片或咬伤部位皮肤组织或脑组织印片或冷冻切片，丙酮固定，抗狂犬病毒特异性荧光抗体染色检测狂犬病毒抗原。
B.快速狂犬病酶联免疫吸附法检测抗原：用pH 9.6的碳酸盐缓冲液稀释的抗狂犬病毒核衣壳IgG包被96孔酶标板，4℃过夜；用含0.3％牛血清白蛋白和5% 蔗糖的pH9.6碳酸盐缓冲液封闭30分钟；将采集到的标本研磨，用pH 7.4 PBS 制成30％的悬液，离心取上清加入酶标板孔内，同时设阴性、阳性对照，200 µl/孔，37℃孵育1小时；洗板四次后加入纯化的酶标记抗狂犬病毒抗体200μl/孔，37℃l小时后洗板，加入酶反应底物，室温作用30分钟，2M H2SO4终止反应，肉眼观察或酶标仪测定结果。
狂犬病疫苗研究进展
狂犬病疫苗研究进展马君1*，王栋2（1.北京海淀中海动物保健科技公司，北京，100081；2.中国兽医药品监察所，北京，100081）［摘要］接种狂犬病疫苗是目前防治狂犬病的唯一有效措施。
根据狂犬病疫苗发展的不同阶段，从巴斯德首次研制的狂犬病神经组织疫苗到高度纯化的细胞疫苗，将狂犬病疫苗进行了分类，并对各类狂犬病疫苗的作用机理、生产应用以及优缺点分别予以了阐述。
［关键词］狂犬病，疫苗，进展狂犬病是由狂犬病病毒（Rabies Virus）引起的一种人畜共患传染病。
全世界每年约有6万人死于狂犬病［1］。
我国每年狂犬病发病人数在印度之后，居世界第二位，近几年每年约1000～1200万人接受狂犬病暴露后接种［2］。
目前本病几乎无有效的治疗办法，只能通过接种疫苗来预防。
从巴斯德首次制成狂犬病弱毒疫苗以来，各国不断完善并研制了更加安全有效的人、兽狂犬病疫苗，主要有以下几种。
1．弱毒疫苗1885年，法国科学家巴斯德首次用兔脑脊髓制备成狂犬病弱毒疫苗，应用于人体治疗获得了成功［3］。
目前弱毒疫苗仅在少数发展中国家用于人体免疫，而更多用于欧美等国野生动物及发展中国家的家养动物。
弱毒疫苗所使用的毒株主要为SAD衍生株，如SAG1和ERA等［4］。
其中欧洲应用SAG1株接种野生动物［5］。
我国目前生产ERA株活疫苗，最近又重新修订了用Flury株生产活疫苗的制造及检验试行规程，对于已取得GMP认证的企业可申请产品的批准文号。
狂犬病弱毒疫苗在体内的增殖过程与病原感染机体的过程相似，能诱导产生细胞免疫和体液免疫，且产生的免疫反应较强，持续时间较长，在我国狂犬病防制工作中曾起到一定的积极作用。
但由于我国目前对活疫苗安全监测与监管制度尚不完善，狂犬病毒流行毒株与疫苗株之间分子流行病学的亲缘性研究尚不充分，对于活疫苗的安全性尚存在争论。
周桂兰等对2种国产狂犬病活疫苗（ERA株）的免疫抗体监测结果表明，对6月龄以上、5岁以内的成年健康犬1次接种后6个月和8个月，分别有28.57%和5. 71%的犬抗体水平高于0.5IU/mL（WHO确认的抗体保护水平），半年后再进行2次接种，有81.82%的犬抗体水平达到0.5IU/mL［6］。
狂犬病病毒培养技术研究进展
狂犬病病毒培养技术研究进展第一篇：狂犬病病毒培养技术研究进展狂犬病病毒培养技术的研究进展狂犬病作为一种几乎100%致死的人兽共患传染病，对人类的危害已经存在了4000多年，至今仍无有效的治疗药物，可行的控制策略只有暴露前免疫和暴露后预防。
其中暴露前免疫主要是针对动物而言，因为人的狂犬病来源于动物，只要动物的狂犬病免疫预防有效，可完全控制人狂犬病的发生；而暴露后预防主要用于人，因为人一旦被带毒动物咬伤，必须及时进行全程的暴露后预防才能防止感染狂犬病病毒。
不论是暴露前免疫，还是暴露后预防，都离不开安全、有效、廉价的疫苗。
人和兽用狂犬病疫苗的发展，都依赖于病毒培养技术的不断进步，尤其是微载体、发酵技术和无血清培养基的广泛应用，把狂犬病病毒的增殖滴度提高到了一个新的水平，同时降低了生产成本，从而使高质量的细胞纯化疫苗逐渐占领市场。
无论是传统的体内培养技术，还是现在的细胞培养技术，以及新型的细胞发酵和生物反应器，目前都广泛应用于狂犬病病毒的实验室研究或疫苗生产。
本文主要就狂犬病病毒培养技术的发展和新技术的应用现状综述如下。
体内培养技术体内培养技术利用了狂犬病病毒的嗜神经特性，具有敏感性好的优点，可以提高病毒检测的阳性率，而且易于操作，适用于不具备组织培养条件的实验室。
其中，小鼠脑内接种是实验室最常用的狂犬病诊断和病毒培养技术之一，其他动物如大鼠、羊、兔等，过去主要用于狂犬病神经组织疫苗的生产。
禽胚胎培养技术主要是利用鸭胚和鸡胚进行狂犬病病毒培养，如鸡胚传代致弱的Flury-HEP、Flury-LEP和Kelev毒株。
1.1 脑内培养技术小鼠脑内接种是最常用的狂犬病病毒脑内培养技术，最早用于狂犬病野毒株的分离培养是在1925年[5]。
1955年，该技术开始用于疫苗生产，Fuenjalida和Palacios用新生鼠脑制备出人用组织疫苗（SMBV），该疫苗曾在南美洲使用了40多年，最终因使用后会引起严重的神经综合症而被迫停产[1]，但是小鼠脑内接种技术却一直延用至今。
狂犬病诊断技术研究进展
Ｋ ｙ ｏ ｄ ｒ ｉ ； ｕ ｎ ａｎ ｓ ； ｉ ｏ ｃｌ ｉ ｎ ｓ ； ｒｌ ｉ ｌ ｉ ｎ ｓ ； ｏ ｃ ｌ ｂｏ ｇ ａ ｄ ｇ ｏ ｓ ｅ ｗ ｒ ｓ ａ ｅ ｒ ｔ ｅ ｉ ｏｉ ｅ ｏ ｇ ａ ｄ ｇ ｏｉ ｓ ｏ ｇ ａ ｄａ ｏｉ ｍ ｌ ｕａ ｉ ｏｉ ｌ ｉ ｓ ｂ ｓ ｏ ｉ ｄ ｇ ｓ ｔｌ ｉ ａ ｓｅ ｏｃ ｇ ｓ ｅ ｒ ｌ ｃ ａ ｉ ｎ
狂犬病的实验诊断方法
狂犬病的实验诊断方法狂犬病是一种由狂犬病病毒引起的致命的神经系统疾病。
早期的病毒检测方法依赖于动物的大脑组织或脊髓液样本，但这些方法不仅需要病毒在大脑中进行复制，而且也有传播病毒的风险。
因此，近年来，研究人员已经发展出一些实验室诊断方法来检测狂犬病病毒。
目前，主要的实验室诊断方法包括直接免疫荧光试验（Direct Immunofluorescence Assay，DFA）、滴度测定法（VirusNeutralization Test，VNT）、聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）和免疫组织化学染色（Immunohistochemistry，IHC）。
直接免疫荧光试验是一种常用的狂犬病病毒检测方法。
它使用特异性单克隆抗体来识别狂犬病病毒的抗原。
通过在疾病动物的脑组织切片上施加单克隆抗体并且经过染色，病毒抗原会与抗体结合形成荧光染色，并通过荧光显微镜观察。
这种方法的优点是快速和准确，可以在病毒分离和动物死亡之前得出结果。
然而，它需要经过训练的实验室技术人员进行操作，并且有时可能出现假阴性结果。
滴度测定法是通过将狂犬病病毒与病毒中和抗体混合来测定病毒的滴度。
该方法基于当病毒与病毒中和抗体结合时，不能侵入新宿主细胞。
这种方法需要一定时间，通常需要3-5天才能得到结果。
这种方法的优点是可以测定病毒的效价，并且可以用于评估深度冷冻疫苗的效果。
然而，该方法需要繁琐的操作步骤，并且对实验室条件要求较高。
聚合酶链式反应是一种在检测狂犬病病毒中应用广泛的方法。
它通过扩增病毒RNA或DNA的特定区域来检测病毒。
首先，通过提取样品中的RNA或DNA，然后进行逆转录反应（对于RNA）或核酸扩增反应（对于DNA）以合成相应的cDNA或DNA，并最后通过PCR扩增目标区域。
这种方法极其敏感，可以检测到非常低浓度的病毒，但在操作过程中需要谨慎处理以避免污染。
此外，PCR方法已经逐渐从传统的实验室检测中发展到快速诊断方法，如实时定量PCR。
狂犬病病毒实验室检测方法研究进展
狂犬病病毒实验室检测方法研究进展杨妍梅;冯若飞;马忠仁【摘要】狂犬病病毒(RV)属于人畜共患的急性直接接触性传染病病毒,近年来又有感染上升的趋势.因此,急需一种快速、准确、灵敏的检测RV的实验室诊断方法.现就酶联免疫吸附试验(ELISA)、荧光抗体方法(FAT)、快速荧光抑制灶技术(RFFIT)、反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、荧光定量RT-PCR,环介导等温扩增技术(LAMP)和基因芯片技术等狂犬病病毒实验室诊断方法做一综述,为更好地开展实验室诊断提供参考.【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2013(034)008【总页数】5页(P102-106)【关键词】狂犬病病毒;检测方法;研究进展【作者】杨妍梅;冯若飞;马忠仁【作者单位】西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州730030;西北民族大学生物工程与技术国家民委重点实验室,甘肃兰州730030;甘肃省动物细胞工程技术研究中心,甘肃兰州730030;甘肃省动物细胞工程技术研究中心,甘肃兰州730030【正文语种】中文【中图分类】S852.659.5狂犬病（Rabies）俗称疯狗病，又称恐水症，是由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）引起的一种人畜共患的急性接触性传染病，发病后病死率几乎为100%。
我国是狂犬病的高发地区，感染狂犬病死亡人数居世界第二，仅次于印度。
当今世界，狂犬病仍然是一种高发的人畜共患病，无论在发达国家［1］，还是发展中国家［2］，都是重点防控的传染病。
狂犬病在我国曾一度得到有效控制，值得关注的是我国城乡养犬、猫等宠物的家庭迅速增加，野犬、猫的数量均呈现增多趋势［3］，使该病的发病率近年有上升趋势。
狂犬病病毒是弹状病科（Rhabdoviridae）狂犬病病毒属的成员，为不分节段的单股负链RNA病毒，基因组长度为11 928nt～11 932nt，编码5种结构蛋白，顺次为核蛋白（N）、磷酸蛋白（M1）、基质蛋白（M2）、糖蛋白（G）和 RNA聚合酶（L），分别由对应的5种结构基因编码，其中N基因具有毒株间相对保守和高拷贝复制的特点，成为病毒分型、系统发生分析和分子诊断的目标序列［4］。
狂犬病毒实验室检测方法综述
实验室诊断的常规技术进行 了浅述，包括 ＦＴ Ａ、 Ｒ—Ｃ 、ａＭ ｎ ＴＰ ＲＴｑａ 试验， 从敏感、 快速、 简便等几方面
进行 比较 ， 为狂犬病 实验 室诊断提供 参考 。
１ 实 验 室 诊 断 依 据
相 比具有灵敏度高、 特异性好、 操作简便等优点， 逐
渐被 广泛应用 ， 为检测 新鲜组织 中狂犬病病 毒抗 作 原的标准 方法和首选方法 。
２ 常用 的 实验 室 诊 断技 术
由于 狂 犬 病 毒 几 乎 可 以感 染 所 有 的温 血 动 物 ，所 以狂 犬病 毒 的实验 室诊断 首要 是考 虑安 全 问题 ， 疑感 染狂 犬病 的动物 不 能随便 解剖 ， 怀 应送
临床症状是 诊断人和动 物狂犬病 的重要 依据 ，
法 中，Ａ Ｆ Ｔ法是 ＷＯ和 Ｏ Ｅ共 同推荐 的方法 。 Ｈ Ｉ 该法 可直 接检 测涂 片 ，也能 用于检 测 细胞 培养 或被接
但单凭临床表现还不够 ， 还需通过狂犬病病毒的实 验 室 检 测 才 能 确 诊 人 和 动 物 狂 犬 病 。 １０ ９ ３年 ， Ａ ｏ ｃ ｉＮ ｇ ｉ ｄ ｌｈ ｅｒ 在狂犬病病毒感染组织细胞浆 内 发现 了嗜 酸性包 涵 体 一内基 氏小体 ，后被 命名 为 Ｎｇｉ ｅ ｒ 小体 。 此， ｅ ｒ 小体被认 为是狂 犬病病毒 从 Ｎｇｉ 感染 的特 征性病变 ， 将检 测 Ｎ ｇ ｉ小体作为狂 犬病 ｅｒ
中图 分 类 号 ：Ｒ ７ ． ３３９ 文献 标 识 码 ：Ａ 文 章 编号 ： １０－ ５ ７２ ０ ） ６ ０ ０ — ３ ０ ５８ ６ （０ ８ ０— ０ ３ ０
狂犬 病 是一种 由狂 犬病 病毒 引起 的人兽 共 患 传染 病 ，Ｉ 其列 为 Ｂ类疫 病 。我 国狂 犬病 发病 ＯＥ将 死亡人 数仅次于 印度，为世界 第二 ，从 １５ ９ ０年至 ２ ０ ， 国狂 犬病 共 出现 了 ５次 流行 高 峰 ， ４ ０ ５年 我 前 次高 峰约每 １ 年 流行一 次，流行 范 围几乎 遍及全 ０ 国。 从近年来 的流行情况 看 ， ５ 高峰正在形成 ， 第 次
狂犬病的实验室检测与诊断技术
生物安全级别＆对工作人员的要求
(Biological Safety Level, BSL ) (Protection, P ) BSL-1：实验人员在实验程序方面受过特殊训练，由受 过微生物学或相关科学一般训练的科学工作者监督实验。 BSL-2：实验人员均接受过病源处理方面的特殊培训， 并由有资格的科学工作者指导。 BSL-3：实验人员应在处理致病性的和可能使人致死的 病源方面受过专业训练，并由对该病源工作有经验的、 有资格的科学工作者监督。 BSL-4：实验室成员应在处理特别危险的传染源方面受 过特殊和全面的训练，应了解标准和特殊操作中一级和 二级遏制的作用、遏制设备、实验室设计性能。实验由 在有关病源方面受过训练、并有工作经验的、有资格的 科学工作者监督。
操作所有潜在狂犬病感染的材料均应在 P2或P3生物安全实验室内进行。
对狂犬病实验室诊断的安全性要求：
①一个封闭的环境，专作狂犬病感染性工作 ②通过缓冲更衣间并限制一定的专业人员进入； ③穿专用的实验室隔离无菌衣和鞋； ④操作完毕对操作台进行消毒(当材料偶然地溢出时应立即用3％的雷苏尔溶液或其他 相应的消毒剂消毒)； ⑤每日应至少消毒地板一次； ⑥所有用后剩余的标本，尸解工具，实验室材料在拿出实验室前应进行高压蒸气消 毒。
6. 快速狂犬病酶免疫诊断法
Rapid Rabies Enzyme Immunodetection (RREID
酶标抗狂犬病毒抗体
狂犬病毒样品 抗狂犬病毒单抗
6. 快速狂犬病酶免疫诊断法
技术特点：
——本试剂盒操作方便、快速灵敏，适于大量样本的检测。 ——本试剂盒中酶标板包被后需立即使用或保存于-20C备用。 ——肉眼观察：阳性对照显黄颜色，阴性对照完全无色。所有显 黄色样品，无论深浅均认为是阳性。这种肉眼观察已足够作出诊 断，非常经济，因为不需要昂贵的酶标仪，也最适合于作现场流 行病学调查。 ——酶标仪读数：仔细擦净平板底面，用450nm滤光片读数。阳 性对照光密度值（OD）必须大于1.0单位，阴性对照OD值须低于 0.1单位，判定值（CUT OFF）的确定：阴性对照OD值 0.008。 OD值等于或大于CUT OFF的标本均视为阳性。 ——福尔马林固定的样品不适宜作RREID。
重庆狂犬抗体检测：狂犬病实验室诊断
狂犬病实验室诊断泓域健康（MacroAreas Health）致力于健康管理模式的集成与创新，专注于“狂犬病中和抗体检测”、“HPV中和抗体检测”等疫苗接种后效果评价的管理与运营，利用“医疗服务+互联网、健康服务+大数据”平台，应用于各级公立医院及医疗机构，打造智慧健康管理服务产品体系，以传统医疗机构为基础，撬动医疗服务资源向健康管理服务延伸。
一、狂犬病实验室诊断病人发病后（死亡前）可采集其唾液（间隔3-6小时，至少采集3份）、脑脊液、血清及颈后带毛囊的小块皮肤；病人死后最好采集其脑组织标本（小脑和脑干）进行实验室检测。
直接免疫荧光法是狂犬病诊断的金标准，可以快速、敏感、特异地检测人和动物脑组织中的病毒抗原。
临床病例活体组织标本（如颈后部皮肤毛囊）亦可进行DFA检测。
直接快速免疫组化法及酶联免疫吸附测定法亦可特异检测狂犬病病毒抗原。
病毒核酸检测可用于早期诊断，以逆转录PCR法检测体液（唾液、血清等）和脑组织等标本，但需要严格的质量控制以保证结果的准确性。
脑组织及唾液等病毒含量高的样本还可进行病毒分离。
细胞培养分离所需时间（1-2天）远少于小鼠颅内接种分离法所需时间（10-21天），且前者的生物安全风险远小于后者。
未接种过疫苗的患者，发病早期几乎没有中和抗体产生，到发病晚期（通常在临床症状出现后7-8天），病毒在脑内大量增殖后突破血脑屏障进入血液，刺激机体产生低水平的中和抗体。
通过病毒中和试验检测病人血清或脑脊液中的中和抗体，可作为狂犬病诊断的依据之一。
世界卫生组织（WHO）推荐的抗狂犬病病毒中和抗体标准检测方法包括快速荧光灶抑制试验（RFFIT）和小鼠脑内中和试验（MNT）。
由于RFFIT法无需使用小鼠，所用时间短（24小时），目前已被广泛采用。
RFFIT方法也是我国现行药典规定的检测狂犬病病毒中和抗体的标准方法之一。
此外，常用的狂犬病病毒中和抗体检测方法还有荧光抗体病毒中和试验（FAVNT）。
狂犬病实验室检测技术研究进展
行检测 ， 结果证明脑 干是最适合用 Ｆ Ｔ检测的组织。 ａｉ等 Ａ Ｄｖ ｓ
利 用 家 用 微 波 炉 固定 ， 在 材 料 送 达 １ ｈ出结 果 ， 且 与 一 能 ． ５ 并 般 的 乙醇 固定 结 果 一 致 。 了减 少 非 特 异 性 ，ｋｚｎｃ ｉ 利 为 Ｓ ｒ ｅｋ 等 ｙ
抗原或抗体的检测方法。
关键词 ： 犬病 ， 狂 病毒 ， 抗体 ， 测方 法 检
Ｄ０Ｉ ０ ３ ６ ／ ． ： ． ９ ９Ｊ Ｉ １ ＳＳＮ．６ １ ６ ２ ． ０ ０ ０ ． １ １ ７ — ０ ７ ２ １ ．８ ０ ３
狂 犬 病 （ ａ ｉ ） 由狂 犬 病 病 毒 （ ａ ｉ ｉ ｓ Ｖ） Ｒ ｂｅ 是 ｓ Ｒ ｂｅ ｖ ｕ，Ｒ 引 ｓ ｒ 起 的人 兽 共 患 疾 病 ，人 和 所 有 温 血 动 物 对 狂 犬 病 病 毒 都 易
或 球 蛋 白处 理 后 ， 紫 外 线 激 发 下 ， 过 荧 光 显 微 的抗狂 犬病病毒核衣壳抗体来检测被捕获 的抗原 ， 加显色底物进行
酶 促 颜 色 反 应 。该 方 法 由 Ｐｒ ｎ Ｐ于 １８ 建 立 ， 经 欧 美 ｅｉ ｒ ９ ６年 后 ６个 实 验 室 试 验 ， 检 测 了 ３ ０ 个 样 品 ， 果 表 明 与 Ｆ Ｔ 共 ０ ０多 结 Ａ 有 很 好 的相 关 性 （６ ）灵 敏 度 略 低 于 Ｆ Ｔ， 检 测 到 的 基 ９％ ， Ａ 能 因 Ｉ 狂 犬 病病 毒最 小 核 衣 壳 抗 原 量 为 １０ ｇ Ｌ 本 方 法 具 型 ｎ／ 。 １ ｍ 有 灵 敏 度 高 、 异 性 好 、 作 简 单 、 复性 好 、 需 要 昂 贵 仪 特 操 重 不
专 论 与 综 述
狂 犬病 实验 室检 测技术 研究 进展
狂犬病病毒分子流行病学研究进展
狂犬病病毒分子流行病学研究进展冯烨;许炜迪;李文婧;涂长春【摘要】Rabies is a zoonotic disease. While China has made efforts in prevention and control of rabies over the past few years, the geographical distribution of the disease is widened annually. This review focuses on the genetic typing and molecular epidemiology of rabies virus isolates in order to better understand its genetic evolution, and then provide a scientific basis for formulating effective strategies for the prevention and control of human rabies.%狂犬病是一种重要的人兽共患传染病，虽然近年来我国在狂犬病防控方面采取了一定的措施，但狂犬病发病地区呈逐年增多趋势。
本文对狂犬病病毒最新分型以及近年来动物狂犬病病毒分子流行病学研究情况进行综述，为了解狂犬病病毒遗传演化趋势，制定有效的狂犬病防控策略奠定基础。
【期刊名称】《传染病信息》【年(卷),期】2015(000)001【总页数】4页(P45-48)【关键词】狂犬病病毒;分子流行病学;基因型【作者】冯烨;许炜迪;李文婧;涂长春【作者单位】130122 长春，军事医学科学院军事兽医研究所吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室;130122 长春，军事医学科学院军事兽医研究所吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室;130122 长春，军事医学科学院军事兽医研究所吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室;130122 长春，军事医学科学院军事兽医研究所吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室【正文语种】中文【中图分类】R373.9狂犬病是一种所有温血动物易感的烈性人兽共患病，一旦发病，病死率为100%。
狂犬病的实验室诊断
Ｇ Ｉ Ｃ Ａ ） 在病 原及 小 分子 物质 检 测领 域 的快 速 发 狂 犬 病 的 实 验 室诊 断／ 姚真蓝 （ 南 京农 业 大 学 动 物 医 学院 胶体 金 免疫 层析 法 （ 动 物 医学 系 江 苏南 京 ２ １ ０ ０ ９ ５ ） ，黄 国庆 ／ ／ 国外畜 牧学 展， 近年 还 出现 了该技 术用 于狂 犬 病抗 原检 测 的研 究 ， 且 取得 了较 好 效果 。此外 ， 小 鼠颅 内接种 （ Ｍ Ｉ Ｔ ） 和细 胞培 养分 离 （ Ｃ ｌ Ｔ ） 除了可 用 （ 猪 与禽 ） ． － ２ ０ １ ２ ， （ ７ ）． － ４ ９ ～５ ｌ
［ ３ 】 崔华敏 ，董兵 ，张芳 ，等． 河北部分地 区鸭新城 疫血清学调查［ Ｊ ］ ． 中国兽 医杂志 ，２ ０ ｏ ８ ，４ ＿ ４（ ７）：４ ０ — ４ １ ． ［ ４ 】 吴 峻华 ，福州市部分 鸭场新城疫感染 情况的调查 ［ Ｊ ］ ． 养 禽与禽病 防治 ，２ ０ ｏ ８ 。 （ ２ ）：４ ２ — ４ ３ ．
还可单 独作 为诊 断手 段， 或 者配 合Ｆ Ａ Ｔ 进行 病 狂犬 病 是 由弹状 病 毒科 、狂犬 病 病毒 属 的嗜 神经 病 毒 引起 的 于 狂犬病 病毒 培养 外，
一
种 世 界 性 的人 兽共 患病 。一 旦 出现 症 状 ， 病 死 率近 １ ０ ０ ％ 。 由于 原 诊 断 。新鲜 材料 得 到 的单份 阴性 结果往 往 需要 进 行 以Ｍ Ｉ Ｔ 和Ｃ Ｉ Ｔ
表现临 床症状 。但 自１ ９ ９ ７ 年 以来 ，国内不断 有水禽 感染Ｎ Ｄ Ｖ 发病 的 参 考 文 献 报道 ，特别近 两年来 某些鸭 源Ｎ Ｄ Ｖ 强 毒株对 鸭具有 明显的致 病性 。 ［ １ 】 陈伯伦． 鸭病【 Ｍ ］ ． 北京 ：中国农业 出版社 ，２ ０ ０ ８ ． ２ ２ ］ 周锦萍 ，孙 泉云 ，刘佩红 ，等 ． 上海地区近几年 鸭新发病毒性传 用禽 副黏病 毒 Ｉ 型 （ Ｎ Ｄ） 抗 原对 鸭 的Ｎ Ｄ 抗 体进 行检测 ，可以较好 『 染病的血清学调查 ［ Ｊ 】 ． 中国家禽． ，２ ０ ０ ５ ，２ ７（ ３ ）：９ － １ １ ． 的反 映鸭Ｎ Ｄ Ｖ 感染或 疫苗免 痰 隋况 ，这对 鸭新城疫 的研究 具有一定 的意义 。从 检测 结果 看 ，云南 省部 分 鸭场 的Ｎ Ｄ 抗 体 阳性 率较 高 ， 达６ ２ ． ８ ６ ％，检测 样 品 的 阳性率 ５ ０ ． ８ ９ ％，这 与 国 内周 锦 萍 ］ 、崔华 敏 ］ 、吴 峻华 ［ ４ 等在 上海 、河北 、福 州等 地对 鸭群 的Ｎ Ｄ Ｖ 血清 学调
狂犬病的实验室检测和诊断技术
生物安全级别＆对工作人员的要求
(Biological Safety Level, BSL ) (Protection, P ) BSL-1：实验人员在实验程序方面受过特殊训练，由受 过微生物学或相关科学一般训练的科学工作者监督实验。 BSL-2：实验人员均接受过病源处理方面的特殊培训， 并由有资格的科学工作者指导。 BSL-3：实验人员应在处理致病性的和可能使人致死的 病源方面受过专业训练，并由对该病源工作有经验的、 有资格的科学工作者监督。 BSL-4：实验室成员应在处理特别危险的传染源方面受 过特殊和全面的训练，应了解标准和特殊操作中一级和 二级遏制的作用、遏制设备、实验室设计性能。实验由 在有关病源方面受过训练、并有工作经验的、有资格的 科学工作者监督。
荧光标记抗 狂犬病毒抗体
狂犬病毒抗原
荧光抗体实验检测狂犬病毒抗原
FAT的技术要求：
—— 由于狂犬病毒多分布在动物脑海马回及脑干处， 因此合适的取样部位对抗原的检测很重要。 —— 脑样品印片必须用丙酮固定 5-10 分钟，因为丙酮 可去除细胞膜表面的脂类，以便抗体到达细胞内与狂 犬病毒结合。 ——脑样品必须保存在含50%甘油的生理盐水中，印片 染色前需用生理盐水洗涤数次。 ——荧光标记抗体需最大限度降低非特异性反应，因 此制备特异性、高效价的抗体是FAT的关键。
2) 唾液腺的获取
为取出颌下腺，在复盖于下颌骨间 的皮肤上作一切割，将皮肤往外侧翻， 两侧的颌下腺位于颌骨后部边缘表面。 在下颌下淋巴结的后面（这二种不要相 混淆）。
4. 标本的快速收集技术
在某些情况下可能难于或不可能尸解以便 打开颅骨取脑, 为减少这些困难已经设计出简 便的技术，即用塑料管插入颅骨采集一小块脑 组织体。 第一种技术是用吸管通过枕骨孔插入并往 前推至一眼睛部位，则吸管中的脑组织内含有 部分脑干，小脑，海马回和皮质。 第二种技术为将吸管通过眼窝后壁(用套管 穿孔)并推至枕部，脑组织内含有部分皮质、 海马回、小脑。
狂犬病病毒实验室检测方法研究进展
等 温扩 增技 术（ Ｌ ＡＭＰ ） 和基 因芯 片技 术等狂 犬病病 毒 实验 室诊 断方 法做 一 综述 ， 为 更好 地 开 展 实验 室诊 断
提供 参 考 。
关 键词 ： 狂 犬病病毒 ； 检 测方 法 ； 研 究进展
中 图分 类 号 ： ￥ ８ ５ ２ ． ６ ５ ９ ． ５ 文 献标 识 码 ： Ａ 文章编号 ： １ ０ ０ ７ — ５ ０ ３ ８ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ８ ～ ０ １ ０ ２ — ０ ５
狂 犬病 （ Ｒ ａ ｂ ｉ ｅ ｓ ） 俗 称 疯狗 病 ， 又 称恐 水 症 ， 是由 狂 犬病 病毒 （ Ｒａ ｂ ｉ ｅ ｓ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ， Ｒ Ｖ） 引 起 的一 种 人 畜 共 患 的急 性 接 触 性 传 染 病 ， 发 病 后 病 死 率 几 乎 为 １ ０ ０ 。我 国是狂 犬病 的高 发地 区 ， 感 染狂 犬 病死 亡 人数 居世 界第二 ， 仅次 于 印度 。当今 世界 ， 狂 犬 病仍 然是一 种 高发 的人 畜共 患病 ， 无 论在 发 达 国家 ］ ， 还 是 发展 中 国 家＿ ２ ］ ， 都 是 重 点 防控 的传 染 病 。狂 犬 病 在我 国 曾一度 得 到有 效 控 制 ， 值 得 关 注 的是 我 国城 乡养 犬 、 猫 等宠 物 的 家庭 迅 速 增 加 ， 野犬 、 猫 的数 量 均 呈现增 多趋 势 ［ ３ ］ ， 使该 病 的发 病 率 近 年 有 上 升趋
动物 医学进展 。 ２ ０ １ ３ ， ３ ４ （ ８ ） ： １ ０ ２ — １ ０ ６
狂犬病的实验室诊断在临床狂犬病诊断中应用的研究的开题报告
狂犬病的实验室诊断在临床狂犬病诊断中应用的研究的开题报告一、选题背景狂犬病是一种致死性极高的急性传染病，主要通过动物的咬伤或擦伤传播给人类。
其传播的主要途径是犬、猫、狼、狐狸、猪等多种哺乳动物的咬伤或擦伤，其中又以犬为主要传染源。
狂犬病毒在全球范围内普遍存在，虽然已有疫苗出现，但狂犬病对人类及家畜的危害依然很大。
狂犬病的病因及治疗机制一直是医学研究的热点之一，随着现代实验技术的发展，狂犬病的实验室诊断及治疗方法也得到了不断的完善。
本文旨在通过对狂犬病的实验室诊断在临床狂犬病诊断中的应用的研究，深入了解狂犬病的诊断方法和治疗进展，并对其未来的研究方向做出一定的探讨和展望。
二、选题意义1.科学研究意义狂犬病是一种病毒性传染病，其诊断及治疗一直是医学科研的热点。
研究狂犬病实验室诊断在临床狂犬病诊断中的应用，不仅可以进一步深入了解狂犬病的病因及发病机制，还能研究新型的狂犬病检测方法及治疗方案，促进狂犬病的诊断及治疗水平的提高。
2.社会意义狂犬病是一种高致死性疾病，狂犬病的发生和传播已成为全球范围内的公共卫生问题和动物防疫问题。
事实上，预防狂犬病的最好方法就是建立健全的检测体系，在发现病例的早期进行诊断治疗，才能及时控制疾病的传播。
因此，研究狂犬病的实验室诊断在临床狂犬病诊断中的应用，对于保障人民健康和动物防疫具有重要的现实意义。
三、研究内容1.狂犬病病因及病理机制的研究通过查阅国内外文献，详细介绍狂犬病病毒的结构、分类及其致病机理等，深入了解狂犬病的病理机制。
2.狂犬病实验室检测技术及应用研究介绍目前狂犬病实验室检测技术，包括传统的细胞培养、免疫荧光技术、PCR技术、核酸序列分析技术等，并对其应用前景进行分析和研究。
3.狂犬病的临床诊断与治疗介绍狂犬病疫苗的发展历程，以及目前常用的预防和治疗方法。
并探讨狂犬病的治疗问题，进一步研究和推广狂犬病的治疗方法，提高治疗狂犬病的效果。
四、研究方法1.文献分析法分析国内外文献，在探讨狂犬病的实验室诊断在临床狂犬病诊断中的应用方面，详细介绍狂犬病的传播途径、流行病学特征及病原学，阐述其临床表现，比较狂犬病的诊断方法及其特点。
狂犬病病毒检测历史及研究进展
狂犬病病毒检测历史及研究进展卢彦欣1王雷1 扈荣良2（1.吉林大学畜牧兽医学院，长春，1300622.军事医学科学院军事兽医研究所130062）狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies virus)感染温血动物和人的中枢神经系统后引发急性致死性脑脊髓炎的一种人兽共患传染病。
狂犬病是迄今为止人类病死率最高的急性传染病之一，无特效的治疗药物，一旦发病，死亡率几近100 %。
狂犬病主要分布在亚洲、非洲和拉丁美洲等发展中国家[1 ，2 ] 。
2000多年前，我国就有狂犬病的记载[3]，目前，我国是世界上受狂犬病危害最为严重的国家之一。
人类对狂犬病的认识曾经经历了漫长的历史过程，对其本质的认识也只是在近一百年内才完成的。
随着上世纪初期和中叶微生物尤其是病毒实验技术的不断发展，人类对狂犬病本质的认识逐渐深入。
在狂犬病认识史中具有里程碑意义的工作，是十九世纪八十年代法国科学家路易斯巴斯德（Louis Pasteur）及其同事发现狂犬病是由一种传染因子引起的，并且证明这种传染因子不但存在于唾液中，而且出现在整个神经系统，它的真正感染部位是在中枢神经部位。
巴斯德及其同事于1885年利用传代获得的固定病毒成功制备成了疫苗。
1903年，Negri发现了嗜伊红包涵体，但当时他错误地认为引起狂犬病的病原是一种原虫，并最后将狂犬病命名为“神经细胞恐水病”。
尽管如此，数年后，这种Negri小体（嗜伊红包涵体）作为狂犬病的一种重要的诊断特征盛行起来。
1926年超速离心技术、1930年电子显微镜技术的引入以及1928年超滤技术的出现进一步促进了人类对病毒及其本质的认识。
二十世纪六十和七十年代，狂犬病病毒的形态、化学组成、抗原特性和细胞培养等才有了一个清晰的轮廓。
狂犬病病毒属弹状病毒科(Rhabdoviridaes)狂犬病毒属(Lyssavirus)，有包膜，其基因组为单股负链RNA，编码N、P、M、G及L 5种结构蛋白。
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中国计划免疫A / / 1年?月第6 6卷第A期
・6 ? 7・ 实验中需要制备中和用狂犬病毒 + ， 病毒 < = : 6 6
8 荧光灶 滴度不得 "6 ／ 。另外还需要制备已知 / 3 4
性高。! 有非常 ! " # $ 试验是一个快速的诊断方法， 好的敏感性和特异性。跟 % 即使标本的运 & ’ 一样， 输条 件 不 太 好， 也 不 会 过 多 影 响 结 果。 另 外， ! ! " # $ 也与脑标本快速收集方法相适应。我们推 荐新狂犬病诊断的实验室使用 ! ! " # $。用 () *细 胞的狂犬病组织培养感染试验 （+ 非常敏感和特 # ’） 异， 由于能在短时间内得出结果， + # ’ 可替代动物 （成年或新生小鼠） 分离病毒的方法。 ! 狂犬病毒抗体的检测 滴定抗狂犬病抗体是为了测定接种对象在暴露 后治疗末期或暴露前免疫的抗体水平。世界卫生组 织 （,狂犬病专家委员会认为， 血清中的中和抗 .） 体! （ ／ / 0 1国际单位 # 2） 3 4才具有足够的保护性， 如果效价 "/ ／ ， 必须给予加强剂量， 直到抗 0 1 # 2 3 4 体达到要求的水平。也可在血库中进行抗体滴定以 筛选来自免疫供体的血浆样品， 用以制备治疗用人 狂犬病免疫球蛋白 （。特异狂犬病抗体的检测 ! # 5） 也有利于不明原因病毒性脑炎病人的病原学诊断。 6 7 8 9 年第七届 ,. 狂犬病专家委员会推荐 的标准检测方法有小鼠中和试验 （() 、 空斑减少 ’） 试验， 亦即随后发展成的快速荧光灶抑制试验 （! % : 。! 其敏感度 % # ’） % % # ’ 为现代实验室的首选方法， 至少与 () ’ 一致。 9 0 6 () ’ 毒， 与待滴定的系列稀释血清孵育， 试验中需设已知 效价的参照血清。然后将病毒 ／ 血清混合物经脑内 注射初成年小鼠， 计算死亡率和保护 1 / ; 动物的血 清稀释度， 根据参照血清的效价计算待检血清的效 价单位。 特点： !可定量检测狂犬病毒中和抗体效价； " 需预先制备中和用病毒 + ， 并滴定其半数致死剂 < = 量 （> ， 需专门技术培训， 操作较繁琐； $ #需6 ? @ 1 /） 出结果， 耗时长， 不利于快速诊断； $ 需较多试验小 鼠， 成本高； %动物间的个体差异会影响试验结果。 剂量固定、 已适应细胞 9 0 A ! % % # ’ 将预先滴定、 培养的标准攻击毒株 （+ ） ， 与 9 倍系列稀释的 < = : 6 6 待检血清9 ， 试验中需设已知效价的参照 8 B中和6 C 血清， 再加入敏感细胞悬液， 如果血清中抗体量少或 无， 则未 被 中 和 的 残 余 病 毒 感 染 细 胞， 经9 8 B1 ; ， 细胞单层用冷丙酮固定， 加荧 + . ? C A 环境中培养A 光标记的抗核衣壳抗体染色， 即可出现荧光灶。如 果血清中和抗体很多， 将病毒完全中和， 则无病毒感 染细胞， 荧光抗体染色为阴性。通过计算可得出待 检血清中和抗体效价。 将一定量预先滴定好的标准攻击病
［ ］ # ， 能检测到的基因
鼠脑组织中的狂犬病毒。 适于不具备组 L ; ( 法的特点： " 该方法敏感， 织培养条件的实验室分离狂犬病毒街毒； # 耗时较 长， 仅凭动物发病症状不足以确定为狂犬病毒， 需配 合免疫荧光法作特异性鉴定。 $ , # 细胞培养分离技术 （N 3 F F 7 ? < F > < B 3; 4 = F . > 0 = 6 ， 各实 ( 3 ? O 6 0 < 3 4 N ; (） $ ) 世纪 I ) 年代中期以来， P 验室相继用地鼠肾传代细胞 （M ） 、 鸡胚细胞、 小 Q R $ ! 鼠成神经瘤 （LS ） 细胞分离街毒狂犬病毒。与小 . 鼠颅内接种法相比所需时间大大缩短， 但M 细 Q R $ ! 胞分离街毒的敏感性比小鼠颅内接种法低。有人对 结果证明小鼠 N ; (、 L ; (、 & ’ ( 法做了大量的比较， LS .细胞分离街毒的敏感性不低于小鼠颅内接种
收稿日期： ； 修回日期： ( # # ! , ’ # , # * ( # # ! , ’ ( , " # 作者简介： 徐葛林 （ ， 女， 上海市人， 武汉生物制品研究所 ’ * $ " ,） 副研究员， 博士， 主要从事狂犬病病毒及其抗体的诊断及分子流行病 学研究。
制成脑印片， 室温干燥后浸入丙酮" ， 取出晾干 # 0 1 2 即可用于荧光抗体实验。取印片剩余的脑组织用含 ’ # 3灭活小牛血清的细胞培养液研磨成 " # 3 匀浆 （4 ／ ） ， ， 取上清用于狂犬病毒抗 5 (# # # # 0 1 2 6离心 " 原的其它检测方法。 ( 7 ’ 荧光抗体实验 （8 ， 9 : ; < = > ? = 2 @A 2 @ 1 B ; C = > @ DE 8 A E） 狂犬病毒感染的细胞内有由狂犬病毒核衣 壳聚集形成的包涵体。以提纯的狂犬病毒核衣壳免 疫实验动物制备的多克隆抗体， 或抗核衣壳单克隆 抗体 （单抗） 与异硫氰酸荧光素偶联后， 用直接免疫 荧光法可特异地与这些包涵体结合， 该方法是狂犬
［ ， ］ I C 法 。如果接种物中含有少量的街毒， 颅内接种
! 型狂犬病
毒最小核衣壳抗原量为) ／ , C ! ! , ) 6 : F E
［ ］ " 。
徐葛林等用抗狂犬病毒核蛋白的单抗建立了用 于检测狂犬病毒抗原的双抗体夹心酶联免疫吸附试 验 （5 G ; H ’ & ’ ( 法相比较， 检测了近!) 份动物脑组织， 结果完全 ) ) 一致。该试剂盒对基因!型的狂犬病毒检出灵敏度 达到 ) ／ ， 对狂犬病街毒 I 个基因型均 能 检 , C 6 : F E 出。 技术特点及要求： 本方法具有灵敏度高、 特异性 好、 操作简单、 重复性好、 不需要昂贵仪器等特点， 最 适合于作现场流行病学调查， 也可作为狂犬病疫苗 或狂犬病毒的鉴别诊断。本试剂盒中酶标板包被后 需立即使用或保存于J $ ) K备用。肉眼观察阳性对 照显黄颜色， 阴性对照完全无色。所有显色样品， 无 论深浅均认为是阳性。福尔马林固定的样品不适宜 作孵育及洗涤 5 ; @。使用酶标记抗体前的加样、 过程需要在 A %实验室中进行。 （L $ , % 小鼠颅内接种分离狂犬病毒法 ; (） 狂犬 病毒是嗜神经性病毒， 可采用颅内接种法分离后， 再 进行狂犬病特异性抗原的检查。可采用小白鼠接种 分离， 任何品种的实验用小白鼠均可使用， 一般选择 体重+!! 雌雄不限。如用 !!% ! E 的健康小白鼠， 日龄的乳鼠， 可提高病毒分离的阳性率。 可疑动物脑组织或唾液腺组织可用于病毒的分 离， 一般前者病毒检出率要高于后者， 但从流行病学 观点考虑， 检查唾液腺中的病毒更显重要。脑组织
・! # C・ 织， 结果发现在! 有"份为狂 " #份外观健康的犬中， 犬病毒抗原阳性， 通过乳鼠颅内接种已分离并证实
［ ， ］ $ % 为狂犬病街毒株 。
中国计划免疫$ ) ) "年#月第! !卷第$期
需要预先用含 ! * !" * 灭活牛血清的生理盐水或 A M H或 脱 脂 奶 研 磨 成 ! ) * 悬 液， ! " )!$ ) ) E离心 唾液腺需切碎后再研磨， " : 0 6去除粗颗粒； !!$ 层 无菌纱布过滤后， 颅内接种小鼠， ／ 只。 ) , ) % : F 逐日观察接种小鼠的体征， 小鼠颅内接种狂犬 病毒后潜伏期至少" ， 在此期间出现的死亡为非特 1 异性死亡， 主要原因是接种材料污染细菌、 接种时损 伤小鼠脑组织等。之后逐日记录小鼠正常、 发病、 死 亡数量及其病症， 其典型症状为竖毛， 镊子夹其尾部 倒提时出现震颤， 置于桌上时后腿运动失调、 麻痹、
中国计划免疫( # # &年!月第’ ’卷第(期
・’ ! .・
国内外狂犬病毒实验室检测与诊断技术的研究及进展
徐葛林
（武汉生物制品研究所， 湖北 武汉 ! ） " # # $ #
中图分类号： % & ’ ( ) * *
文献标识码： +
文章编号： （ ） ’ # # $ , * ’ $ ( # # & , # ( , # ’ ! . , # !
［ ］ D 直至死亡 。并用 & ’ ( 法检测所有死亡或发病小
对狂犬病疑似病人可取颈背部带有毛囊的皮 肤， 用& 抗原可在围绕毛囊的神经丛中 ’ ( 作活检， 找到， 皮肤活检的阳性率随病程而增多， 其敏感性为 特异性接近! " ) *! + # *， ) ) *。 （$ , $ 快速狂犬病酶免疫诊断法 . 0 1. 2 0 3 45 6 7 / ， 8 : 3 ; : : < 6 = 1 3 > 3 ? > 0 = 6 5 ; @） 5 ; @ 可通过检 9 测脑组织中的狂犬病毒核衣壳来诊断狂犬病。将标 本于缓冲液或组织培养液中研磨成匀浆， 离心取上 清， 置于微量反应板中孵育 （该板已用抗狂犬病毒核 衣壳抗体包被） ， 然后再用过氧化物酶标记的抗狂犬 病毒核衣壳抗体来检测被捕获的抗原， 加显色底物 进行酶促颜色反应。该方法由 A 3 B B 0 6A 于 ! + C D年 建立， 后经欧美 D 个实验室试验， 共检测了%) ) )多 个样品， 结果表明与 & （ ， ’ ( 有很好的相关性 + D *） 灵敏度略低于 & ’ (