1.2基因工程的基本操作程序

PCR仪
微量离心管
推动按钮
微量移液器
调节轮
一 次 性 吸液枪头 卸枪头器
卸枪头按钮
利用PCR技术扩增目的基因
PCR技术
相 原理 同 原料 点 条件
解旋 方式
DNA复制
碱基互补配对 四种脱氧核苷酸 模板、能量、酶
DNA在高温下变性解旋 解旋酶催化 细胞核内 细胞内的DNA聚合酶 形成整个DNA分子
例：用棉铃饲喂棉 铃虫，如虫吃后不出现 中毒症状，说明未摄入 目的基因或摄入目的基 因未表达。如虫吃后中 毒死亡，则说明摄入了 抗虫基因并得到表达。
(四)目的基因的检测与鉴定 ——检查是否成功
①检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因 分子 检测
方法—— DNA分子杂交
②检测目的基因是否转录出了mRNA 方法—— 分子杂交 ③检测目的基因是否翻译成蛋白质
—— 核心
DNA连接酶
3.将切下的目的基因片段插入载体的______处，再加入适量 切口 DNA连接酶 ___________，形成了一个重组DNA分子
基因表达载体的组成：
a、复制原点 b、启动子
c 、目的基因
d 、终止子
e、标记基因
启动子：位于基因的首端的 一段特殊的DNA片断，它是 RNA聚合酶识别和结合的部 位，有了它才能驱动基因转 录出mRNA，最终获得蛋白质。
终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断， 能终止mRNA的转录。
三、将目的基因导入受体细胞 • 常用的受体细胞：
动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌、枯草杆菌等。
• 将目的基因导入受体细胞的原理：
借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。
受体细胞 转化——目的基因进入_________内，并且在 稳定 表达 受体细胞内维持_____和_____的过程
目前被广泛提取使用 的目的基因有：苏云金 杆菌抗虫基因、植物抗 病基因（抗病毒、抗细 菌)、种子贮藏蛋白基 因及人胰岛素基因等。
获得目的基因的方法
未知目的基因的核苷酸序列 1）从基因中获取目的基因 已知目的基因的核苷酸序列 且基因比较大 2）利用PCR技术扩增目的基因 且基因比较小 3）人工合成
6、结果：
PCR扩增仪
使目的基因的片段在短时间内大量 地扩增
扩增过程
a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板 氢键 断裂，形成_______ 在热作用下， 单链DNA b、复性（55℃-60℃）：系统温度降低，引物 双链 与DNA模板结合，形成局部________。 c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从 引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补 的________。 DNA链
基因工程的基本操作程序
目的基因的获取
基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定
一、目的基因的获取
为什么要有“目的基因的获取”这一步？
有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生 物的遗传特性。
什么是“目的基因” ？
原核细胞的基因结构
真核细胞的基因结构
目的基因主要是______________________，也可以 编码蛋白质的结构基因 是一些具有调控作用的因子
3、前提：已知目的基因的核苷酸序列
4、条件：
模板DNA( 需含有目的基因 ) 四种脱氧核苷酸(dNTP) 热稳定DNA聚合酶(Taq酶） 温度控制 一对引物：一小段单链DNA或RNA，一般 20～30个碱基，能与DNA母链 的一段碱基序列互补配对。
5、方式：
指数 2n 以_____方式扩增，即____ （n为扩增循环的次数）
2.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你能 分析出不能导入单子叶植物的原因吗?若将一个抗病基因 导入小麦中,理论上讲你应该怎样做?
酚类化合物
①要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的 农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物； ②要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮 等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠 拢（趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱导） 的基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA 上。
无表达产物
无表达产物
有表达产物
无表达产物
基因工程的基本操作程序
1. 获取目的基因 从基因 利用PCR 化学方法人工合成
2. 构建基因表达载体
目的基因、启动子、终止子、标记基因
3. 将目的基因导入受体细胞
农杆菌转化法、基因枪法、显微注射法
4. 目的基因的检测与鉴定
检测：是否插入、转录、翻NA与cDNA的比较类型 基因多少 大小 cDNA
某种生物 部分基因基因组某种生物 全部基因小 无 无 可以
大 有 有 部分基因可以
启动子
内含子 物种间的基因吗？？？
4. 有关基因工程的叙述正确的是 A．限制酶只在获得目的基因时才用 B．重组质粒的形成是在细胞内完成的 C．质粒都可作为运载体 D．蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料
5.哪项不是基因表达载体的组成部分( A.启动子 B.终止密码 C.标记基因 D.目的基因
)
6.下列哪项不是将目的基因导入植物细胞的方法( A．基因枪法 B．显微注射法 C.农杆菌转化法 D．花粉管通道法
农杆菌转化法
导入植物细胞 基因枪法
方法
花粉管通道法 导入动物细胞 ——显微注射法
导入微生物细胞 —— 感受态细胞吸收 DNA分子
农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物。Ti
质粒的T-DNA可转移至受体细胞的染色体上
基因枪法
基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力， 将包裹在金属颗粒表面的表达载体-DNA打入受体细胞中，使目 的基因与其整合并表达的方法。
)
(多选)采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导 入目的基因的做法正确的是 A.将毒素蛋白直接注射到棉受精卵中 B. 将编码毒素蛋白的DNA序列，直接注射到棉受 精卵中 C.将编码毒素蛋白的DNA序列，与质粒重组，导 入农杆菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行 组织培养 D.将编码毒素蛋白的DNA序列，与细菌质粒重组， 注射到棉子房并进入受精卵
方法—— 抗原-抗体杂交 个体 鉴定： 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
a
变性
DNA
b
附着在膜上
DNA杂交
（如检测SARS病毒等）
c
加探针
硝化纤维素
报告基因（含荧光素分子）
d

如果显示出杂交带，就表明待测样品含有 目的基因或目的基因已经转录。
细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成 菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。 淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产是获取目的基因的方法之一。但 是，有时我们完全不知道目的基 因序列，或者想从一种生物体内 获得许多基因，或者想知道几种 生物之间有哪些基因不同，或者 想知道一种生物在不同的发育阶 段都表达哪些基因，或者想得到 一种 的基因在受体细胞 中稳定存在，并且 可以遗传给下一代， 同时使目的基因能 表达和发挥作用。
二、基因表达载体的构建
限制酶 1.用一定的_______切 割载体，使其出现一 黏性末端 个切口，露出_______ 。 同一种限制酶 2.用___________切断 目的基因，使其产生 相同的黏性末端 __________。
利用PCR技术扩增目的基因
聚合酶链式反应 1、 概念：PCR全称为_______________，是一项 在生物____复制___________的核酸合成技术 体外 特定DNA片段 通过这项技术可在短时间内大量扩增目的基因 因为整个过程是在体外进行，所以又叫做体外 DNA扩增技术。 2、原理：导入受体生物中无法转录；
（3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛 选标记； （4） 为了增强目的基因的表达水平，往往还 要增加一些其他调控元件，如增强子等； （5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在 于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在 部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融 合基因），如绿色荧光蛋白基因等。
花粉管通道法
植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。 花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合 前，剪去柱头，然后，滴加表达载体-DNA ，使目的基因借助 花粉管通道进入注射 移植到子宫 受精卵发育
提纯含目的基 因表达载体
新性状动物
将目的基因导入微生物细胞种 类3、基因的构建（1）基因组的构建
提取某生物 全部DNA
用适当 限制酶切割
许多 DNA片段
与载体录酶 核酸酶H DNA聚合酶 与载体连接 导入受体菌群 mRNA 杂交双链 单链DNA 双链DNA (cDNA)
不 体外复制 同 场所 点 酶 热稳定的DNA聚合酶
结果
大量的DNA片段
通过DNA合成仪用化学方法人工合成
当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷酸 序列已知时，可采用此种方法。
蛋白质的氨 推 基酸顺序 测
推 基因DNA的 合 mRAN 核苷酸序列 测 核苷酸序列 成
目的 基因
DNA合成仪
为什么要有“表达载体的构建”这一步？ 单独的DNA片段── 目的基因是不能稳定遗传 的。
4.β-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异 常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如 让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的β-珠蛋白， 想一想，应如何进行设计？ （1）从小鼠中克隆出β-珠蛋白基因的编码序列（cDNA）。 （2）将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加 上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。 （3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含 有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠 杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养 基上长出大肠杆菌菌落，则表明β-珠蛋白基因已进入其中。 （4）培养进入了β-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎 后从中提取β-珠蛋白。