1.2基因工程的基本操作程序

种 类
3、基因文库的构建
（1）基因组文库的构建
提取某生物 全部DNA
用适当 限制酶切割
许多 DNA片段
与载体连接 导入受体菌群
该生物基 因组文库
（每个受体菌含有一段不同的DNA片段）
（2）cDNA文库的构建——mRNA反转录形成
逆转录酶 核酸酶H DNA聚合酶 与载体连接 导入受体菌群 mRNA 杂交双链 单链DNA 双链DNA (cDNA)
（2） 通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子， 只将编码序列导入受体生物中无法转录；
（3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛 选标记； （4） 为了增强目的基因的表达水平，往往还 要增加一些其他调控元件，如增强子等； （5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在 于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在 部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融 合基因），如绿色荧光蛋白基因等。
—— 核心
DNA连接酶
3.将切下的目的基因片段插入载体的______处，再加入适量 切口 DNA连接酶 ___________，形成了一个重组DNA分子
基因表达载体的组成：
a、复制原点 b、启动子
c 、目的基因
d 、终止子
e、标记基因
启动子：位于基因的首端的 一段特殊的DNA片断，它是 RNA聚合酶识别和结合的部 位，有了它才能驱动基因转 录出mRNA，最终获得蛋白质。
构建表达载体 的目的是为了使目 的基因在受体细胞 中稳定存在，并且 可以遗传给下一代， 同时使目的基因能 表达和发挥作用。
二、基因表达载体的构建
限制酶 1.用一定的_______切 割载体，使其出现一 黏性末端 个切口，露出_______ 。 同一种限制酶 2.用___________切断 目的基因，使其产生 相同的黏性末端 __________。
农杆菌转化法
导入植物细胞 基因枪法
方法
花粉管通道法 导入动物细胞 ——显微注射法
导入微生物细胞 —— 感受态细胞吸收 DNA分子
农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物。Ti
质粒的T-DNA可转移至受体细胞的染色体上
基因枪法
基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力， 将包裹在金属颗粒表面的表达载体-DNA打入受体细胞中，使目 的基因与其整合并表达的方法。
基因工程的基本操作程序
目的基因的获取
基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定
一、目的基因的获取
为什么要有“目的基因的获取”这一步？
有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生 物的遗传特性。
什么是“目的基因” ？
原核细胞的基因结构
真核细胞的基因结构
目的基因主要是______________________，也可以 编码蛋白质的结构基因 是一些具有调控作用的因子
花粉管通道法
植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。 花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合 前，剪去柱头，然后，滴加表达载体-DNA ，使目的基因借助 花粉管通道进入受体细胞。

显微注射法
取受精卵 显微注射 移植到子宫 受精卵发育
提纯含目的基 因表达载体
新性状动物
将目的基因导入微生物细胞
3.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关 细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路， 思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？
有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些 糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的， 内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠 杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中 生产这种糖蛋白是不可能的。
终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断， 能终止mRNA的转录。
三、将目的基因导入受体细胞 • 常用的受体细胞：
动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌、枯草杆菌等。
• 将目的基因导入受体细胞的原理：
借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。
受体细胞 转化——目的基因进入_________内，并且在 稳定 表达 受体细胞内维持_____和_____的过程
3、前提：已知目的基因的核苷酸序列
4、条件：
模板DNA( 需含有目的基因 ) 四种脱氧核苷酸(dNTP) 热稳定DNA聚合酶(Taq酶） 温度控制 一对引物：一小段单链DNA或RNA，一般 20～30个碱基，能与DNA母链 的一段碱基序列互补配对。
5、方式：
指数 2n 以_____方式扩增，即____ （n为扩增循环的次数）
1.下表关于基因工程中有关基因操作的名词及对 应的内容，正确的组合是
2、下列属于获取目的基因的方法的是( ) ①利用mRNA反转录形成②从基因组文库中提取 ③从受体细胞中提取 ④利用PCR技术 ⑤利用DNA转录 ⑥人工合成 A.①②③⑤ B.①②⑤⑥ C.①②③④ D.①②④⑥
3.细菌的质粒分子带有一个抗菌素抗性基因，该抗 性基因在基因工程中的主要作用是 A．提高受体细胞在自然环境中的耐药性 B．有利于对目的基因是否导入进行检测 C．增加质粒分子的分子量 D．便于与外源基因连接
4.β-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异 常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如 让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的β-珠蛋白， 想一想，应如何进行设计？ （1）从小鼠中克隆出β-珠蛋白基因的编码序列（cDNA）。 （2）将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加 上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。 （3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含 有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠 杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养 基上长出大肠杆菌菌落，则表明β-珠蛋白基因已进入其中。 （4）培养进入了β-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎 后从中提取β-珠蛋白。
该生物 cDNA文库
基因组DNA文库
cDNA文库
真核生物转录过程
基因组DNA文库与cDNA文库的比较
文库类型 基因多少 文库大小 cDNA文库
某种生物 部分基因
基因组文库
某种生物 全部基因
小 无 无 可以
大 有 有 部分基因可以
启动子
内含子 物种间的基因 交流
村长, 为什么要 构建基因文库？直接 从含有目的基因的生 物中提取不行吗？？？
利用PCR技术扩增目的基因
聚合酶链式反应 1、 概念：PCR全称为_______________，是一项 在生物____复制___________的核酸合成技术 体外 特定DNA片段 通过这项技术可在短时间内大量扩增目的基因 因为整个过程是在体外进行，所以又叫做体外 DNA扩增技术。 2、原理： DNA复制
不 体外复制 同 场所 点 酶 热稳定的DNA聚合酶
结果
大量的DNA片段
通过DNA合成仪用化学方法人工合成
当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷酸 序列已知时，可采用此种方法。
蛋白质的氨 推 基酸顺序 测
推 基因DNA的 合 mRAN 核苷酸序列 测 核苷酸序列 成
目的 基因
DNA合成仪
为什么要有“表达载体的构建”这一步？ 单独的DNA片段── 目的基因是不能稳定遗传 的。
6、结果：
PCR扩增仪
使目的基因的片段在短时间内大量 地扩增
扩增过程
a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板 氢键 断裂，形成_______ 在热作用下， 单链DNA b、复性（55℃-60℃）：系统温度降低，引物 双链 与DNA模板结合，形成局部________。 c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从 引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补 的________。 DNA链
思考：1.作为基因工程表达载体，只需含有目的基
因就可以完成任务吗？为什么？ 不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达 并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、 终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理 由是：
（1） 生物之间进行基因交流，只有使用受体生物 自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；
4.基因文库的目的
当然行啊。构建基因文库只 是获取目的基因的方法之一。但 是，有时我们完全不知道目的基 因序列，或者想从一种生物体内 获得许多基因，或者想知道几种 生物之间有哪些基因不同，或者 想知道一种生物在不同的发育阶 段都表达哪些基因，或者想得到 一种生物的全部基因序列，往往 就需要构建基因文库。
目前被广泛提取使用 的目的基因有：苏云金 杆菌抗虫基因、植物抗 病基因（抗病毒、抗细 菌)、种子贮藏蛋白基 因及人胰岛素基因等。
获得目的基因的方法
未知目的基因的核苷酸序列 1）从基因文库中获取目的基因 已知目的基因的核苷酸序列 且基因比较大 2）利用PCR技术扩增目的基因 且基因比较小 3）人工合成
)
(多选)采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导 入目的基因的做法正确的是 A.将毒素蛋白直接注射到棉受精卵中 B. 将编码毒素蛋白的DNA序列，直接注射到棉受 精卵中 C.将编码毒素蛋白的DNA序列，与质粒重组，导 入农杆菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行 组织培养 D.将编码毒素蛋白的DNA序列，与细菌质粒重组， 注射到棉子房并进入受精卵
4. 有关基因工程的叙述正确的是 A．限制酶只在获得目的基因时才用 B．重组质粒的形成是在细胞内完成的 C．质粒都可作为运载体 D．蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料
5.哪项不是基因表达载体的组成部分( A.启动子 B.终止密码 C.标记基因 D.目的基因
)
6.下列哪项不是将目的基因导入植物细胞的方法( A．基因枪法 B．显微注射法 C.农杆菌转化法 D．花粉管通道法
无表达产物
无表达产物
有表达产物
无表达产物
基因工程的基本操作程序
1. 获取目的基因
从基因文库 利用PCR 化学方法人工合成
2. 构建基因表达载体
目的基因、启动子、终止子、标记基因
3. 将目的基因导入受体细胞
农杆菌转化法、基因枪法、显微注射法
4. 目的基因的检测与鉴定
检测：是否插入、转录、翻译、个体水平鉴定
1.基因文库概念
将含有某种 生物不同基因的 许多DNA片段，导 入受体菌的群体 中储存，各个受 体菌分别含有这 种生物的不同基 因，称为基因文 库。
2.基因文库的分类:按外源DNA片段的来源分类
基因组DNA文库：含有一种生物的全部基因 部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因， 如：cDNA文库
1.常用菌： 大肠杆菌 2.微生物作受体细胞原因： 感受态大肠杆菌细胞 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少 3.转化方法： Ca2+处理
大肠杆菌
感受态 细胞
wk.baidu.com
表达载体 与感受态 细胞混合
感受态细 胞吸收 DNA
DNA分子导入受体细胞后就说明目的基因完 成了表达吗？
不能，受体细胞必须表现出特定的性状， 才能说明目的基因完成了表达。
方法—— 抗原-抗体杂交 个体 鉴定： 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
a
变性
DNA
b
附着在膜上
DNA杂交
（如检测SARS病毒等）
c
加探针
硝化纤维素
报告基因（含荧光素分子）
d

如果显示出杂交带，就表明待测样品含有 目的基因或目的基因已经转录。
细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成 菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。 淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一 步培养、研究。
PCR仪
微量离心管
推动按钮
微量移液器
调节轮
一 次 性 吸液枪头 卸枪头器
卸枪头按钮
利用PCR技术扩增目的基因
PCR技术
相 原理 同 原料 点 条件
解旋 方式
DNA复制
碱基互补配对 四种脱氧核苷酸 模板、能量、酶
DNA在高温下变性解旋 解旋酶催化 细胞核内 细胞内的DNA聚合酶 形成整个DNA分子
例：用棉铃饲喂棉 铃虫，如虫吃后不出现 中毒症状，说明未摄入 目的基因或摄入目的基 因未表达。如虫吃后中 毒死亡，则说明摄入了 抗虫基因并得到表达。
(四)目的基因的检测与鉴定 ——检查是否成功
①检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因 分子 检测
方法—— DNA分子杂交
②检测目的基因是否转录出了mRNA 方法—— 分子杂交 ③检测目的基因是否翻译成蛋白质
2.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你能 分析出不能导入单子叶植物的原因吗?若将一个抗病基因 导入小麦中,理论上讲你应该怎样做?
酚类化合物
①要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的 农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物； ②要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮 等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠 拢（趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱导） 的基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA 上。