慢病毒包装操作方案

v1.0 可编辑可修改

慢病毒包装操作流程

一、材料

1 细胞培养试剂

试剂名称终浓度试剂品牌

DMEM/High glucose基础培养基90%Invitrogen

胎牛血清10%Invitrogen/Gibco

丙酮酸钠1mM Invitrogen

DMSO（冻存用）10%

2 慢病毒包装试剂

试剂名称浓度试剂品牌

Lipofectamine 2000Invitrogen

Opti-MEM基础培养基Invitrogen

PEG6000溶液50%Wako

NaCl溶液40 mM

HBSS溶液Invitrogen

3 耗材

50 mL离心管

15 mL离心管

10 cm细胞培养皿

μm过滤器

2 mL EP管

二、操作流程

1细胞培养

1.1293T/293FT细胞的复苏

1)将完全培养液从4°C中取出放置到室温预热30 min左右。在超净台内，用吸管吸取6~7mL

完全培养液至15 mL离心管中；

2)快速将冻存的细胞从液氮中取出，并迅速用镊子夹住盖子放入37°C水浴中快速晃动（水不

要没到盖子），使其在1~2分钟内完全融化；

3)在超净台内，用酒精棉球擦拭冻存管外壁消毒，用吸管吸取所有融化的细胞悬液至装准备好的

完全培养液中，轻轻吹打混匀，使冻存液分散开（目的是让DMSO分散，降低恢复室温的DMSO

对细胞造成的毒性作用）。

4)在室温条件下，250 g离心4分钟。

5)离心后，在超净台内小心倒去上清，用吸管吸取 2 mL新鲜完全培养液重悬细胞至单细胞悬液，

再转移已经加好培养基的培养瓶/培养皿中，写上细胞名称、日期，放置 37°C、5% CO2饱和

湿度培养箱内培养。（首次复苏细胞时，离心重悬后需取样计数，根据细胞数选择面积合适的

培养容器。）

6)复苏翌日，给复苏的293T细胞更换新鲜的完全培养基。

1.2293T/293FT细胞传代

1)待细胞长至60%-70%融合度即可传代。将培养瓶里的所有培养液全部移去，用1×PBS洗涤细

胞两次（洗涤速度要快，避免细胞干涸时间过长），以去除残余的培养液和血清（血清含有胰

酶的抑制因子）；

2)加入适当的胰酶溶液，能使其完全浸过细胞即可，室温孵育1-2分钟。在显微镜下观察，可看

到大部分细胞变圆不贴壁，拍打培养瓶两侧会有大量细胞脱离，此时应立即终止消化，若细胞

仍然有大部分贴壁，可适当延长孵育时间；

3)加入等体积完全培养液终止消化，并用吸管吹打培养瓶底2-3次使所有细胞彻底脱壁。用吸管

转移细胞悬浮液到15 mL 离心管中，用吸管吸取2-3 mL的PBS将残余细胞冲洗下来，一并加

到15mL离心管中，混匀吹打10次使细胞分散；

4)在室温条件下，250g离心4分钟。离心后，倒去上清，用2 mL完全培养液重悬细胞，取样计

数；

5)根据计数结果，按照2×104～5×104/cm2的细胞密度接种细胞；写上细胞名称、日期，放置

37°C、 5% CO2饱和湿度培养箱内培养。

注1：T75培养瓶建议293FT细胞接种×106；293T 接种×106细胞量。

注2：293T细胞生长达70%-80%融合度即可传代；293FT细胞生长达到60%融合度即可传代，不可生长过密；

1.3293T/293FT细胞冻存

1)待细胞长至 70%-80%融合度即可传代。消化过程可参照相关步骤。

2)消化后，取样待计数。计数同时，将细胞于室温条件下，250g离心4分钟。

3)离心后，倒去上清（上清需吸取干净），根据计数结果，按×106细胞量/mL的密度，用冻存液

进行重悬，并将悬液平均分至事先做好标示的冻存管中，旋紧盖子，按所使用的冻存仪器操作步骤进行冻存。

注：冻存管标示内容包括：细胞名称，细胞代次，以及冻存批号（批号标示：时间+人员代码+批次流水号）。2慢病毒包装

2.1慢病毒包装前的准备工作

1)包装培养皿的处理

病毒包装前的细胞需要接种在有明胶包被的培养皿上。接种细胞前，吸取%明胶加至培养皿中，能完全覆盖表面即可，室温静置包被30分钟。30分钟后吸走明胶，使其晾干液体即可。

2)准备293FT/293T细胞。

细胞的生长状态影响病毒的生产。应使用复苏后传代培养至少两代的细胞包装慢病毒，但不能使用超过10代的细胞。将细胞传到包被了明胶的直径10 cm培养皿中。

2.2慢病毒包装过程（脂质体转染法）

1）转染前一天，接种293T细胞到一个直径10 cm培养皿中，接种细胞数量应以转染当天的细胞生长达到90%~95%融合为佳（一个直径10 cm培养皿，如在上午接种×106个细胞，下午接种×106个细胞为宜；加10 mL含丙酮酸钠的血清培养基）；

2）转染当天，观察细胞能否包装病毒。主要观察的指标是：细胞是否接种均匀，细胞的融合程度是否达到 90%~95%。若细胞的状态合适，则从细胞中去除培养液，加入5 mL病毒包装用培养液，为了避免细胞脱壁，培养液应沿培养皿壁缓慢加入。

注：包装培养基不能含有抗生素，而且在每次使用前，培养基应37°C、5% CO2培养箱中平衡pH值。

3）准备 DNA-Lipofectamine2000复合物，以一个直径10 cm培养皿的用量为示范：

A. 准备一支无菌的5 mL离心管加入 mL无血清Opti-MEM培养液、辅助质粒和慢病毒表达质

粒，充分颠倒混匀；

注：表达质粒用量(μg) =质粒大小(kb)×；无血清Opti-MEM培养液需预热至37°C。

B. 准备另外一支无菌的 5 mL离心管里，加入 mL无血清Opti-MEM培养液和68μL的

Lipofectamine2000，轻轻颠倒混匀，室温孵育30分钟；

C. 30分钟后，把含有质粒DNA的无血清Opti-MEM培养液加入到含Lipofectamine2000的无

血清Opti-MEM培养液，轻轻颠倒混匀，室温孵育 30 分钟；

D. 30分钟后，DNA- Lipofectamine2000 复合物形成；溶液有可能变混浊，但是不会影响转

染效果。

4）把 DNA- Lipofectamine2000 复合物一滴一滴地添加到293T细胞中，轻轻地前后摇晃培养皿以混匀复合物。放置 37°C、5% CO2 饱和湿度培养箱中培养。转染后的 4-6 小时内每隔 30 分钟需观察细胞毒性反应，当出现可观察的毒性反应时，应立即吸除原培养液，加入8 mL病毒包装用培养液，放置 37°C、5% CO2 饱和湿度培养箱中继续培养。

2.3慢病毒收集和浓缩（PEG浓缩法）

1)转染后48小时，收集含有病毒的培养液。把培养液吸到一支无菌的有盖 50 mL 离心管中，再