Knockout(基因敲除) - ES细胞囊胚显微注射
基因敲除技术
基因敲除技术gene knockoutgene knockout简介基因敲除技术是一种通过破坏特定基因来研究该基因在细胞或生物体中功能的实验方法。
这项技术在基础研究、疾病模型构建以及药物开发等领域中起着重要作用。
通过敲除特定基因，我们可以揭示该基因在生物体中的功能，对其与相关疾病的关联进行研究，并探索其在生物学过程中的作用机制。
基因敲除技术的原理基因敲除技术是通过引入特定的DNA片段使目标基因发生突变或被删除，从而破坏目标基因的功能。
常用的基因敲除技术包括CRISPR/Cas9、转座子、RNA干扰等。
CRISPR/Cas9CRISPR/Cas9是目前应用最广泛的基因敲除技术之一。
它基于细菌和古菌的天然免疫系统中的一种防御机制。
CRISPR （Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是一种由短重复序列和变异序列组成的DNA片段。
Cas9是一种具有核酸内切活性的酶。
CRISPR/Cas9技术利用RNA导向的Cas9酶靶向识别和切割特定的DNA序列。
在细胞中引入含有目标基因的RNA分子和Cas9酶后，Cas9酶会与RNA分子结合形成复合物，通过RNA分子的导向，使Cas9酶与目标基因特异性结合，并切割目标基因的DNA序列，导致基因发生突变或敲除。
转座子转座子是一种能在基因组中移动的DNA片段。
转座子可以在基因组中发生插入、删除或重排等事件，从而导致基因的敲除和突变。
转座子技术通过引入含有转座子序列的DNA片段来实现基因敲除。
在细胞中，转座子序列会与基因组发生重组，导致目标基因的敲除或突变。
RNA干扰RNA干扰是一种通过介导靶向特定mRNA分解的机制来抑制基因表达的方法。
在RNA干扰中，特定的siRNA（small interfering RNA）或shRNA（short hairpin RNA）分子与目标mRNA相互作用，导致mRNA的降解，从而抑制特定基因的表达。
基因编辑细胞实验，看这篇就够了！
基因编辑细胞实验，看这篇就够了！相信在科研上默默努力的小伙伴一定听过或被安利过CRISPR-Cas9基因编辑技术，小编在初次了解到这个技术时，感觉它太强大了！特别是在基因功能研究中，常常会用到CRISPR-Cas9技术，例如构建基因敲除、基因定点突变和基因敲入的细胞等，方便和高效的标签已经牢牢贴在它的身上。
今天带大家一起回顾CRISPR-Cas9在细胞实验上的帮助吧！1.基因敲除基因敲除（Knock out，KO）是基因功能研究中的“减法”套路，也就是基因功能缺失的研究思路，当目的基因被敲除，基因功能丧失后，所出现的细胞表型变化我们便认为与该基因相关。
同时，这个“减法”套路可以用RNAi技术在转录水平上实现，但RNAi技术的调控原理是靶向mRNA，与CRISPR-Cas9技术的KO在效果上存在差异。
那么，下面给大家回顾一下整个敲除实验的流程和注意细节！首先，使用CRISPR-Cas9进行敲除基因有两种策略——移码敲除和片段敲除。
两种策略各有优缺点，需根据敲除细胞的类型和目的基因信息来综合选择。
设计合理有效的sgRNA是我们最终成功实现基因编辑的重要前提。
这里需要注意的是要尽可能选择切割效率高效和特异性好的sgRNA，避免影响其他基因和脱靶等情况。
获取sgRNA后，我们需要将其和Cas9转导到细胞内，常用的方法有RNP法、质粒法和慢病毒法。
三种方法都各具特点，RNP法简便、快捷和敲除效率较好；慢病毒法的敲除效率高，但存在影响其它基因和脱靶的风险；质粒法方便、简易，但效率较低。
编辑过后的混合细胞池存在各种细胞类型，可通过稀释等方法获得单克隆细胞，然后再通过PCR和测序鉴定基因型，筛选目标基因型的单克隆。
如果使用片段敲除的策略（敲除200bp以上），可通过PCR扩增敲除片段附近的区域，通过比较与野生型的电泳结果，能直观地知道敲除结果。
当然也需要对扩增的PCR产物进行测序，进一步明确基因型。
如果是移码突变策略，则需要扩增靶区域进行测序，明确基因型。
基因敲出技术
基因敲出技术研究进展：
1956年，Whitten成功地使单细胞的受精卵在体外发育到囊胚 阶段。 1958年，诺贝尔奖得主Joshua Lederberg在细菌中首先证实 同源基因间重组的原理。 1965年，Brinster建立了微滴培养技术，用于着床前小鼠胚 胎的培养。 1970年，Stevens作为先驱者成功分离了小鼠畸胎瘤细胞并将 其作为模式体系研究胚胎细胞的全能性。 1975年，Gardner建立了将分离的细胞注射人宿主囊胚获得嵌 合体小鼠的方法。 1980年，Capecchi报道用玻璃针将DNA直接注射人细胞核可以 显著提高基因转移的效率。
Gene Knock-out
2007年诺贝尔生理学或医学奖颁给了在小鼠基因组建立 基因靶向改造技术的三位科学家:
美国科学家马里奥·卡佩奇 奥利弗·史密西斯
英国科学家马丁·埃文斯
该技术的诞生和发展，为人类攻克某些遗传因素引发的疾 病提供了药物试验的动物模型，因此它已成为了功能基因组 研究的核心方法。
基因敲除技术的过程 ①基因载体的构建 ②ES细胞的获得 ③同源重组 ④选择筛选已击中的细胞
⑤表型研究：
⑥得到纯合体
基因敲除技术的应用
（1)建立人类疾病的转基因动物模型,为医学研究提供材料 ： 如1992年成功建立了CFTR基因的基因敲除的CF(囊性 纤维化疾病)小鼠模型, (2)治疗遗传病，即基因治疗： 包括去除多余基因或修饰改造原有异常基因以达到治 疗的目的，如AD。 (3)改造动物基因型,鉴定新基因和/或其新功能,研究发育 生物学： 目前已报道了多种学习、记忆以及一些有缺陷的基因 敲除动物，发现多种基因在学习、记忆的形成过程中必不 可少。 (4)改造生物、培育新的生物品种： 定点改造原有的基因功能,使生物获得优良的性状， 并且可以避免由于外基因在基因组中随机整合可能带来 源 的不利影响。对动植物生殖细胞或早期胚胎干细胞的基因 进行修饰改造，可以产生一些人类需要的新品种。
分子生物学课件：基因敲除
Neo gene Neor基因进入ES细胞的基因组 在G418、单核苷酸类似物的培养 基中，可以存活。
P53 gene Neo gene HSV-Tk
Neor基因和HSV-TK基因同时进入ES 细胞的基因组 在G418培养基中存活，但是含有单核苷 酸类似物培养基中死亡。
2
3A
3B
嵌合体
与阴性小鼠 交配
1
3D
基因敲除的 纯合子小鼠
杂合子小鼠
3C
扩展知识：
上述基因打靶策略虽然实现了目标基因的特异失活， 但基因组中引入了一个外源标记的基因（NeoR), 该基因会 影响机体正常的功能。怎么改进？
有些基因是胚胎生长发育过程中非常重要的基因，一旦被 敲除可导致胚胎发育受损甚至不能发育为一个个体, 针对这 类基因如何采用基因敲除技术进行研究呢？
➢ 如果Tk 基因进入细胞，在含单核苷酸类似物的培养基中生长时会 因为以上分解反应产生的有毒物质而死亡
筛选标志在这个过程中如何发挥作用的？
正负筛选系统பைடு நூலகம்作原理
1. 同源重组
10-5-10-6
Neo HSV-Tk P53 gene
ES cells
P53 gene P53基因被替换
2. 随机插入，非同源重组
如果基因组序列是：
123
待敲除基因
4
基因敲除载体的结构是：
LoxP
TK
4
LoxP
LoxP
Neo
•使待敲除基因位于两个LoxP位点之间
基本流程：
•条件性基因敲除载体的构建 •在ES细胞中进行第一次常规性基因敲除
Genomic DNA:
123
基因敲除型小鼠缩写
基因敲除型小鼠缩写基因敲除型小鼠（Knockout Mouse）是一种在实验室中经过基因编辑技术制造的小鼠模型。
通过敲除特定基因，科学家可以研究该基因在生物体发育、生理功能和疾病发展中的作用。
基因敲除型小鼠的出现为生命科学研究提供了重要工具，有助于我们更深入地理解基因对生命活动的影响。
在基因敲除型小鼠的制备过程中，科学家会选择目标基因，并使用基因编辑技术（如CRISPR/Cas9技术）将其敲除。
通过这种方式，小鼠的基因组中将不再包含目标基因的正常拷贝，从而使得该基因无法正常表达。
这样一来，科学家便可以观察到在缺失该基因的小鼠体内所产生的生理和行为变化。
基因敲除型小鼠的制备需要经过一系列复杂的实验操作。
首先，科学家需要设计合适的引物和合成寡核苷酸，用于引导CRISPR/Cas9系统精确剪切目标基因。
然后，利用载体将CRISPR/Cas9系统导入小鼠的受精卵中，使其在早期胚胎发育阶段就发挥作用。
经过一段时间的培养和发育，科学家便可以获得具有基因敲除突变的小鼠。
基因敲除型小鼠的制备不仅需要技术娴熟的实验操作，还需要对基因功能和细胞生物学等领域的深入理解。
科学家需要充分了解目标基因在生物体中的作用机制，以及其与其他基因的相互作用关系。
只有在对基因功能有清晰认识的基础上，才能准确选择目标基因，并制备出具有特定基因敲除突变的小鼠模型。
基因敲除型小鼠的应用范围非常广泛。
它们可以用于研究基因在发育过程中的作用，探究基因在特定组织和器官中的功能，以及揭示基因与疾病之间的关联。
通过对基因敲除型小鼠进行行为学、生理学和病理学等多方面的分析，科学家可以获取大量关于基因功能的宝贵信息。
基因敲除型小鼠是生命科学研究中的重要工具，为我们研究基因功能和疾病发展提供了有力支持。
通过制备基因敲除型小鼠模型，科学家可以更深入地了解基因的作用机制，从而为疾病的诊断和治疗提供新的思路和方法。
基因敲除型小鼠的研究将继续推动生命科学领域的发展，为人类健康做出更大的贡献。
creloxp基因敲除系统
Loxp site
34bp反向重复序列
Flp/Frt重组系统
P1噬菌体
（1）重组方式
（2）基因敲除机理
Offspring：50% heterozygous knockout after 1 generation
基因敲除机理 （续）
诱导性组织特异性Cre工具鼠的载体构建
MHC (cardiac-specific a-myosin heavy chain) Mer (mutated murine estrogen receptor ligand-binding domain amino
acids 281 to 599, G525R)
D.S. Sohal, M. Nghiem. Temporally regulated and tissue-specific gene manipulations in the adult and embryonic heart using a tamoxifen-inducible Cre protein. Circ Res. 89:20-25 (2001).
（3）阳性克隆筛选
随机整合 定点整合 没有整合
DTA(白喉毒素A亚基）
（4）囊胚注射
小鼠的遗传背 景取决于ES和 囊胚细胞
（5）嵌合体小鼠
（6）品系纯化
纯合突变小鼠用来和Cre小鼠杂交，杂合突变小鼠保种 Loxp2小鼠品系建立完成
三、Cre工具鼠的构建
DNA显微原核注射，是指将外源DNA通 过显微注射的方法注射到受精卵的原 核内，注射DNA整合到小鼠受精卵的 基因组中，并稳定遗传给后代。
MerCreMer融合蛋白
基因敲除2
PCR法
PCR方法可以用来筛选基因打靶操作中的阳性克隆。
选择性地扩增发生同源重组的 DNA片段。先在靶载体 中插入neor基因使其突变，然后合成两个引物，它们分别 位于外源靶载体和与靶载体相接处的内源非同源序列上。 将G-418 抗性细胞克隆分别进行PCR。发生同源重组时， 由于两个引物分别从相对的两个方向同时扩增，结果是 DNA片段的拷贝数以指数式增加，得到已知长度DNA双链 片段。与之相反，在随机整合中，由于只有一个引物且为 单方向，所以扩增的片段拷贝数呈线性比例，片段为单链， 长度不定。
正相选择法
在基因敲除载体的目的片段中插入启动子缺失的正向选 择基因neor ，目的基因片段也不包含该基因的启动序列，再 嵌合入打靶载体中与靶位点同源的序列内，将打靶载体转染 进靶细胞，可能出现下面几种情况： 打靶载体不整合入靶细胞基因组，将随传代而丢失； 随机整合，由于neor基因缺失了其自身的启动子和起始码，整 合位点周围亦无启动子，使neor基因的表达受阻； 虽是随机整合，但其整合位点侧翼序列在其它基因的启动子 能启动neor基因的表达； 外源打靶载体与靶位点发生了同源重组，则neor基因可借助靶 基因自然存在的其和起始密码的作用而呈现表达活性。 用G418筛选，则抗性细胞中将只包含③④，根据基因组DNA 酶切图谱的不一致，用Southern印迹杂交可检测出同源重组的 克隆。
筛选方法的特点
PNS及PCR法是对任何靶基因的定点敲除都适用的两 种重要的方法，但它们都有不足之处。 PCR法缺乏直接的选择标记，运用PCR 法进行筛选 时，必须对每个细胞克隆分别进行扩增，因此较为费时费 力，工作量非常大。 PNS法可能是目前应用最广泛的方法，但PNS法要经 过2种药物筛选，有可能对ES细胞产生潜在的影响。 正向选择法适合于敲除那些在细胞中良好表达的基因。
基因敲除
RANi的特点
1 高效性 注入细胞内的siRNA的量比细胞内的 mRNA量要少得多。 但因为其自身的循环 放大机制仍可对目的基因产生有效的阻断。
2 高特异性 由dsRNA降解成的小的干扰RNA，除其 正义链3’-端的两个碱基在序列识别中不起 主要作用以外，其余碱基在序列识别中都 是必需的。单个碱基的改变即可以使RNAi 失效，RNAi能特异性降解mRNA，针对同 源基因共有序列的RNAi则可使同源基因全 部失活。
讨论：
1. 各种方法的优缺点。 2. 发展前景。
基因敲除技术已从最初简单的完全敲除 发展到条件敲除阶段，现正朝着特定组织基 因敲除、特定时间基因敲除的可调控敲除方 向发展。完全基因敲除是通过同源重组直接 将靶基因在细胞或者动物个体中的活性完全 消除；而条件基因敲除则是将某个基因的修 饰限制于特定类型的细胞或个体发育特定的 阶段，即通过位点特异的重组系统实现特定 基因敲除。
3 种属时效应 发现在低等生物中RNAi可持续存在， 但RNAi在哺乳动物细胞中只能维持一段时 间，一般注入dsRNA后的2～3 d，RNAi的 作用最明显，而后1～2 d内，靶mRNA的丰 度就能恢复到注射dsRNA之前的水平。这 可能是由于RNA依赖的核苷脱氨酶脱氨基 活性的逐步增高，导致siRNA的生成减少而 受到抑制。
Dicer先将dsRNA解旋，接着在内切酶的作用 下将其切割为2l～23个核苷酸小片段，其3’-端 为羟基，且有2个突出的单核苷酸，5’-端为磷 酸基团，这些小片段RNA称为小干涉RNA (small interfering RNA，siRNA) 。此结构对于 siRNA行使其功能非常关键，剪切位点一般在 U处，具特异性。
RNA单链作为选择目标的向导，并与靶 mRNA的同源序列互补结合，然后由活化的 RISC（ RNA介导的沉默复合体）中的核酸 内切酶在互补区的中间距siRNA反义链3’-末 端l2 bp处切断靶mRNA序列 ，切割成很多 的具有21～23 nt的siRNA片段。RISC犹如 一个mRNA降解平台，可与不同的siRNA结 合，并在不同的情况下结合不同的调节分 子，实现对不同的靶mRNA的切割与降解 。
基因敲除的方法
基因敲除的方法
基因敲除是一种实验手段，通过干扰或删除某个基因来研究其对生物体的功能和表达的影响。
以下是常见的基因敲除方法：
1. RNA干扰（RNAi）：通过引入特定的双链RNA分子，可以在细胞中诱导RNA干扰复合物（RISC），使其与特定的mRNA序列结合并导致其降解或抑制翻译。
这种方法可以通过合成小分子RNA片段作为外源性RNAi分子，或者通过转染质粒表达RNAi分子来实现基因敲除。
2. 质粒介导的基因敲除：通过构建质粒载体，将基因的反义序列整合到质粒中，并将其导入到目标细胞中。
质粒中的反义序列可以与目标基因的mRNA互补配对，形成双链结构，从而抑制基因的翻译或引起mRNA降解。
3. CRISPR/Cas9系统：CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）/Cas9
（CRISPR-associated protein 9）系统是一种常用的基因敲除技术。
它利用Cas9酶与特定的单链RNA（sgRNA）结合，形成复合物，该复合物可以与目标基因的DNA序列互补配对，并导致DNA双链断裂。
当细胞修复这些断裂时，可能会引入错误的碱基，导致基因的敲除或功能丧失。
4. 胚胎干细胞敲除：通过基因敲除技术，可以在胚胎干细胞中敲除特定的基因，从而生成敲除该基因的小鼠模型。
这种方法可以用于研究特定基因的功能和生理学过程。
这些基因敲除方法可以在体外或体内进行，并根据具体研究需求
选择最适合的方法。
课题 基因敲除小鼠的pcr鉴定
基因敲除小鼠pc鉴一、技术介绍与研究进展敲除动物技术已经/ 基因、基因敲入转该技术从上世成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，原核显史，经典技术如DNA纪七八十年代诞生以来，至今已有近四十年的历在小鼠模型构建方面日趋微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，制备技术一样，逐渐从完善，并且如同剪切酶和抗体等常规分子生物学试剂的催生了数以百基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业，然存在一些难以计的创新药物和数以千计的优秀文章。
尽管如此，传统技术仍TALEN和费用高昂等，而ZFN克服的缺陷，如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、等新技术的出现，或有可能将这一局面彻底改变。
二、同源重组技术原理同源重组的原理发展起来的，年代中后期基于DNA基因敲除鼠技术是上世纪80）homologous recombination1987年根据同源重组（在Capecchi和Smithies），这的外源基因的定点整合（EStargeted integration的原理，首次实现了），gene knockout（基因敲除）或gene targeting（基因打靶一技术称为利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由于这一工作，Capecchi和Smithies于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。
同源重组（homologous recombination）定义：是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。
在基因敲除小鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异性片段设计带有相同片段的重组载体，将重组载体导入到胚胎干细胞后外源的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组，如图1所示：1.基因敲除鼠制作同源重组原理示意图图制作流程三、．基因敲除鼠制作过程示意图图2. 载体设计与构建1. Knockout根据研究项目具体情况和要求把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的的载体上，成为重基因等TK )基因，如片段都重组到带有标记基因DNA (neoKnockout组的载体。
基因功能研究方法
反义技术的两种技术路线:
将表达与体内基因或mRNA互补序列的基因转入体内， 使细胞表达与目标基因互补的mRNA失活，从而阻断目 标基因的表达；
体外合成mRNA互补的核苷酸类似物，通过静脉注射等 途径进入细胞，特异性的与目标mRNA作用。
反义寡聚核苷酸 与mRNA特异性结 合，阻断翻译过 程。
的部位，如球形或纤维状结构，他们介于二级结构和三级结构之间。
激活结构域:指转录因子中与转录起始复合体接触与互作的结构部
位。
优势：
它可应基因序列，它检测的相互作用在体 内发生，无需额外的纯化步骤。
删除、置换、修饰等手段重建DNA序列,使之成为靶载体； (2)将靶载体导入小鼠的胚胎干细胞中,使外源DNA与胚胎干
细胞基因组相应部分发生同源重组,将靶载体的DNA 序列 整合到内源基因组中；
(3)将胚胎干细胞受体细胞注入小鼠的囊胚，将这些囊胚 导入假孕母鼠子宫中，产生的雄性嵌合鼠子代与正常 的雌鼠交配即可获得生殖系统携带该基因的纯合鼠， 进而分析被剔除基因的功能。
优点： 可使导入基因的水平与内源基因相当,并且具有类似 于天然的剪接机理,适用于复杂的基因功能分析。
YAC要具备的主要功能成份
1）着丝粒：mitosis姊妹染色单体和减I同源染色体分离之必需。 2）端粒：保护染色体末端免受核酸酶的侵袭。 3）自主复制序列（ARS）元件：是染色体自主复制的复制起点。 构建YAC需要4个短序列：2个端粒，着丝粒，ARS元件
4.2 基因敲入 基因敲除技术已经成为研究基因功能的强有力手段，但对
于许多基因来说，简单的失活常导致令人费解的无改变 的表型。最常见的解释是某些其它基因取代了靶基因的 功能，但要在普通基因敲除小鼠中证明这一点十分困难。 基因敲入即通过基因打靶用一种基因替换另一种基因以 确定它们是否具有相同功能。
基因敲除技术研究进展
兰州交通大学化学与生物工程学院综合能力训练Ⅰ——文献综述题目：基因敲除技术研究进展作者：王振宇学号：201207744指导教师：谢放完成日期：2014-7-16基因敲除技术研究进展摘要基因敲除是自20世纪80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。
在总结已有研究成果的基础上，本文对基因敲除技术的概况、原理方法应用以及近年来基因敲除技术的研究进展作一个简单的综述。
关键词基因敲除 RNA i生物模型基因置换基因打靶同源重组1. 基因敲除技术简介基因敲除(Gene knockout)是指一种遗传工程技术，针对某个序列已知但功能未知的序列，改变生物的遗传基因，令特定的基因功能丧失作用，从而使部分功能被屏障，并可进一步对生物体造成影响，进而推测出该基因的生物学功能。
它克服了随机整合的盲目性和偶然性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。
基因敲除借助分子生物学、细胞生物学和动物胚胎学的方法,通过胚胎干细胞这一特殊的中间环节将小鼠的正常功能基因的编码区破坏,使特定基因失活,以研究该基因的功能；或者通过外源基因来替换宿主基因组中相应部分,以便测定它们是否具有相同的功能，或将正常基因引入宿主基因组中置换突变基因以达到靶向基因治疗的目的。
基因敲除是揭示基因功能最直接的手段之一。
通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段(即基因打靶),从而达到基因敲除的目的。
随着基因敲除技术的发展,除了基因打靶技术外,近年来新的原理和技术也逐渐被应用,比较成功的有RNA干扰技术,同样也可以达到基因敲除的目的。
简单的说基因敲除是指将目标基因从基因组中删除。
基因敲除技术主要应用于动物模型的建立，而最成熟的实验动物是小鼠，对于大型哺乳动物的基因敲除模型还处于探索阶段。
这项技术的诞生可以说是分子生物学技术上继转基因技术后的又一革命。
尤其是条件性、诱导性基因打靶系统的建立，使得对基因靶位时间和空间上的操作更加明确、效果更加精确、修饰的时空范围上设置一个可调控的“按钮”，从而使对小鼠基因组的修饰的范围和时间处于一种可控状态。
基因敲除名词解释
基因敲除名词解释
基因敲除（Gene Knockout）是指采用某种技术，使特定基因失活，
以观察其可能产生的育种功能和特征。
基因敲除是利用载体技术（如质粒）把没有活力的基因掺入到某种物种中，从而把正常基因的活性抑制。
例如，载体技术可以将抗生素抗性基因组装在质粒上，然后将其植入生物体的某
个细胞中，以抑制蛋白质的表达。
此外，基因敲除也可以用于研究杂交种
的表现特性。
基因敲除技术的优势在于，可以有效地分离基因的功能，探究不同基
因的作用机制，对于推动生物育种也有重要意义。
其局限性在于，敲除无
关基因会影响细胞的正常功能，导致减弱效果，也可能引发其他不良反应，因此技术的使用需要谨慎。
虽然基因敲除技术被广泛应用，但其应用时常受到政策和法规约束，
监管规则会因不同国家而有所差别。
在国家有关法律法规出台以前，基因
敲除技术的研究者要仔细研究其伦理、法律和财务方面的实际问题，以确
保基因敲除技术的应用不会引发不良后果和负面影响。
基因敲除
基因敲除基因敲除（knockout）是指一种遗传工程技术，针对某个序列已知但功能未知的序列，改变生物的遗传基因，令特定的基因功能丧失作用，从而使部分功能被屏蔽，并可进一步对生物体造成影响，进而推测出该基因的生物学功能。
指外源DNA与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，从而代替受体细胞基因组中的相同/相似的基因序列，整合入受体细胞的基因组中。
此法可产生精确的基因突变，也可正确纠正机体的基因突变。
基因嵌入又称基因置换，它是利用内源基因序列两侧或外面的断裂点，用同源序列的目的基因整个置换内源基因。
用于基因敲除和基因嵌入的技术有Cre/Lox P系统、FLPI系统等。
步骤：获得干细胞基因敲除一般应用于鼠，而最常用的鼠的种系是129及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。
而其他遗传背景的胚胎干细胞系逐渐被发展应用，最来自于C57BL/6×CBN/JNCrjF1小鼠的胚胎干细胞系成功地用于基因敲除。
由于这些远交系遗传背景复杂，所得到的模式小鼠往往不能得到重复性好的实验结果，所以也需要在C57BL/6等近交系小鼠上做回交。
另一方面，因为回交次数不一样，也会造成实验结果重复性差。
这对生物科研，尤其是医药企业，安评中心，药检部门等，是一个很大的缺点。
这对开发制作标准模式动物也是一个很大的缺陷。
所以，如果能够直接用C57BL/6 ES细胞进行基因打靶，就将直接获得C57BL/6品系的模式小鼠。
c57BL/6小鼠种系等已经广泛的应用于免疫学，神经学，癌症，等几乎所有研究领域。
已经有一些公司或科研机构已经开始用C57BL/6遗传背景的胚胎干细胞进行基因打靶。
载体构建把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA分子都重组到带有标记基因(如neo基因，TK基因等)的载体上，此重组载体即为打靶载体。
因基因打靶的目的不同，此载体有不同的设计方法，可分为替换性载体和插入型载体。
基因敲除的技术和应用
基因敲除的技术和应用随着现代生命科学技术的发展，人们逐渐感受到基因敲除技术的强大和对于生命科学研究的深刻影响。
基因敲除是一种迅速且精准的基因表达抑制技术，其引起的基因失活可以为许多生物学问题提供重要答案。
本文将介绍基因敲除技术的原理及其应用。
基因敲除技术的原理基因敲除（Gene Knockout）是通过基因转染、体外转录、酶联反应以及基因编辑等手段，将物种基因组DNA序列的一部分或全部突变或删去，以制造失活变异体，实现基因靶点的消除，从而破坏目标基因的功能。
这种技术需要在实验室内精准选择目标基因（受体、信号通路等）并引入外源DNA分子，以制造一定的突变或完全失活的生理状态。
国际上常用的基因敲除系统有Cre-LoxP系统、Flippase （Flp）/FRT系统、Tet-On/Tet-Off系统、RNAi系统等。
Cre-LoxP系统是基于一个菌群住在肠道内的细菌切割酶的作用。
LoxP位点为34个碱基的DNA序列，Cre为双链酶，可以识别该位点，同时发挥切割酶和粘接酶的作用，形成“切掉”或“加入”等效果，从而达到改变目标基因DNA序列的目的，进而实现基因敲除的作用。
而Flippase（Flp）/FRT系统则是以酵母菌的响应元件FRT为基础。
在这个系统中，与Cre-LoxP系统类似的重新组合酶Flp可以切割、粘接两个FRT位点，使相邻的基因模块（例如启动子和融合基因）被分离，实现目标基因失活。
Tet-On/Tet-Off系统则是利用反转录病毒的基因表达特性，通过快速手段改变靶向基因表达。
该系统中，编码反向反而使靶向基因表达迅速发生变化，在短时间内实现基因敲除，并进一步研究变化造成的生物学效应。
RNAi系统则是通过RNA 干扰技术实现目标基因敲除。
其中，siRNA技术主要包括设计合适的RNA序列，然后将其导入到靶向基因的mRNA中，促成靶向基因的特定片段丧失其生物学功能，达到敲除目标基因的目的。
基因敲除技术的应用基因敲除技术主要应用于以下两个方面：1.生命科学研究基因敲除技术在生物医学、基础研究和农业等领域的应用非常广泛。
对“基因敲除”(knockout)的肤浅认识
一、概述
基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。
通常意义上的基因敲除主要是应用DNA
同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA
，它们同样可以达到基因敲除的目的。
二、实现基因敲除的常见原理和方法
1．利用基因同源重组进行基因敲除的原理和方法
基因敲除是80年代后半期应用DNA
同源重组原理发展起来的。80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。
1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型。直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。
利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤：
（1）基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA
分子都重组到带有标记基因的载体上，成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。
（2）ES细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也技术可以确定特定基因的性质以及研究它对机体的影响。这无论是对了解疾病的根源或者是寻找基因治疗的靶目标都有重大的意义。
3．提供廉价的异种移植器官
众所周知，器官来源稀少往往是人体器官移植的一大制约因素，而大量廉价的异种生物如猪等的器官却不能用于人体。这是因为异源生物的基因会产生一些能引起人体强烈免疫排斥的异源分子，如果能将产生这些异源分子的基因敲除，那么动物的器官将能用于人体的疾病治疗，这将为患者带来具大的福音。
转基因与基因敲除knockoutmice
转基因 • 基因敲除• 表型分析 •影像分析• 慢病毒• 基因资源
1 of 10
MicroRNA载体
关键因素
• DNA concentration • Injection buffer • Visualizing pronuclei • Timing of injection • Size of DNA • Copy number ： 随机的 • Position Effect insulator
• 1982年，Palmiter和Brinster，Nature，超级鼠
转基因动物研究历史
1. 20世纪60年代末和70年代初，John Gurdon向蛙卵和 小鼠胚胎注射mRNA，研究mRNA能否在动物卵细胞 和早期胚胎中翻译。
2. 1974年，Jaenisch和Mintz首次报道应用显微注射法 获得SV40DNA转基因小鼠。
Spontaneous P<0.0005%
Induced
Random （随机突变）
Targeted
（定向突变）
X-ray mutagenesis 0.05% Chemical mutagenesis 0.1%
Transgene（转基因）10% Homologous Recombination（同源重组）
转基因与基因敲除
-基因工程动物模型的构建
1. Overview.
（概述）
2. Transgenic technology
（转基因技术）
3. Gene targeting
（基因打靶技术）
4. Present
(动物模型的现状)
回顾
转基因动物(transgenic animal) • 概念：用人工方法将外源基因导入或整合到基因组内，并能
cre_loxp基因敲除系统
MerCreMer融合蛋白
该系统将雌激素受体(Estrogen Receptor,ER)的配 体结合区(ligand-binding domain,LBD)和Cre重组酶进
行融合，产生一种嵌合重组酶，该嵌合重组酶的表 达被置于特异启动子的调节之下，从而使其在特定 组织和器官或者特定发育阶段产生。但是只有该嵌
基因敲除 Knock Out
第一页，编辑于星期三：点 五十分。
背景介绍
1981 年Evans 等首次在体外分
离和培养ES，成功建立了小鼠 胚胎干细胞系
1985 年Smithies最早在哺乳动物细 胞中发现并实现了同源重组
第二页，编辑于星期三：点 五十分。
同源重组
Homologus Recombination
（1）重组方式
第五页，编辑于星期三：点 五十分。
（2）基因敲除机理
Offspring：50% heterozygous knockout after 1 generation
第六页，编辑于星期三：点 五十分。
基因敲除机理 （续）
Offspring: 25% homozygous knockout after 2 generation
同源重组
是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染
色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。在基因敲除小
鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异性片段设计带有相同片段的重组
载体，将重组载体导入到胚胎干细胞后外源的重组载体与胚胎干细胞中相同
的片段会发生同源重组
第十页，编辑于星期三：点 五十分。
（3）阳性克隆筛选
➢ 随机整合 ➢ 定点整合 ➢ 没有整合
敲除小鼠常见问题与回答
敲除小鼠常见问题与回答一、什么是ES细胞显微注射？答：胚胎干细胞显微注射是制作基因敲除小鼠的一个最常用的方法。
主要过程是将携带目的基因的胚胎干细胞注射到小鼠的囊胚腔中获得嵌合体小鼠。
所得嵌合体小鼠的组织，将同时含有来源于囊胚的细胞和胚胎干细胞。
嵌合体小鼠必须和野生型小鼠配种以决定遗传改变的生殖系能否传递，这样可能获得转基因或打靶基因（来源于胚胎干细胞）稳定的生殖系传递的小鼠。
一般情况下，大约能获得50%继承了目的基因的后代。
二、嵌合体遗传学上用以指不同遗传性状嵌合或混杂表现的个体。
免疫学上的涵义则指一个机体身上有两种或两种以上染色体组成不同的细胞系同时存在,彼此能够耐受,不产生排斥反应,相互间处在嵌合状态。
在基因敲除鼠中指通过向囊胚注射被外源基因转化了的胚胎干细胞，使得发育成为的个体中含有不同基因型的细胞，产生的个体也叫嵌合体，即该生物体中嵌合了两种不同遗传结构的细胞（一种是基因型被改变了的细胞，另一种是原来的基因型的细胞）。
三、条件性敲除的原理？答：Cre-LoxP系统是源于P1噬菌体的一个DNA重组体系,由Cre酶和相应的LoxP位点组成,它能导致重组发生在特定的DNA序列处(LoxP位点),该系统可以将外源基因定点整合到染色体上或将特定DNA片段删除。
基于Cre-LoxP的基因打靶要分两步来进行。
首先要在胚胎干细胞的基因组中引入LoxP序列，这一步可以通过打靶载体的设计和对同源重组子的筛选来实现。
下一步通过Cre介导的重组来实现靶基因的遗传修饰或改变。
Cre-LoxP系统既可以在细胞水平上用Cre重组酶表达质粒转染中靶细胞，通过识别LoxP位点将抗性标记基因切除，又可以在个体水平上将重组杂合子小鼠与Cre转基因小鼠杂交，筛选子代小鼠就可得到删除外源标记基因的条件性敲除小鼠。
四、如何鉴定和挑选嵌合体？答：动物只有部分组织细胞整合有外源基因，则称为嵌合体动物。
它的鉴定主要根据毛色去鉴定。
注射的ES和囊胚来源不同的小鼠品系。
细胞基因ko方式
细胞基因ko方式细胞基因KO（Knockout）方式是一种常用的基因遗传工程技术，用于研究基因对生物体功能的影响。
KO即破坏（knockout）的缩写，细胞基因KO是通过人工设计的方式，使细胞中某一基因的功能被完全破坏或失活。
这种方法可以使研究者更好地了解某一基因的作用、结构与功能，并揭示多种自身调节路径和信号途径及其复杂性。
一、基因KO的原理基因KO的原理是通过利用分子生物学技术人工对某一特定基因进行突变，使其功能失活或破坏，从而改变细胞的生理特性及生物行为，并观察变化效果，以揭示该基因的结构和功能。
基因KO通常包括两个步骤：首先设计适当的突变构建，然后透过遗传技术导入到细胞内，使该基因发生失活或功能破坏。
二、基因KO的方法和步骤1.基因敲除（Gene Knockout）基因敲除就是切除指定DNA序列的方法，通常通过质粒转染、基因转染、介导基因编辑等方法实现。
该方法根据研究对象的细胞类型和需求的变化来进行，比较常见的是利用介导的基因编辑方法如CRISPR/Cas9系统对目标基因进行突变敲除。
2. RNA干扰RNA干扰（RNAi）方法可以通过合成特定的小分子RNA，在细胞内靶向特定的mRNA序列，降低或抑制目标基因的表达量，这种方法通常产生比较快速的效果。
常常使用基因激活或低表达技术，通过选择干扰基因的特定新编码转录本或区段来实现。
3.基因点突变基因点突变是通过直接改变基因中的特定位点来实现该目标基因的失活或降解，目标基因从而破坏或结构变异。
这种方法特别适合于研究单个基因的特定结构和功能，但是无法反映细胞功能的整体变化。
4.遗传基因编辑技术遗传基因编辑技术（Genetic Editing Technology）可以实现同时编辑一连串RNA序列，在细胞的基因结构上生成一定的突变，从而破坏细胞基因的特定位置和结构。
该方法可以对细胞进行某些功能的调节和支配，从而更好的了解细胞基因与其复杂的生理过程。
三、细胞基因KO的应用1.基因功能和信号通路研究基因是细胞分子的最基本单元，具有依赖环境和遗传基础的复杂性。
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ES细胞囊胚显微注射
技术原理
囊胚。
将获得的嵌合体小鼠和野生型小鼠交配，以确定嵌合体小鼠的生殖系传递能力，
一般情况下，大约有一半左右的嵌合体小鼠具有生殖系传递能力
品系选择
囊胚品系：C57BL/6×C57BL/6
这是目前制备基因敲除鼠最常用品系，也是成功率最高的一敲除鼠需要转换成C57等品系
JM8A3(derived from C57BL/6N mice, Coat Color: Agouti
囊胚获取
2.5 d 培养到
3.5 d 囊胚期 3.5 d 囊胚期
ES 细胞打靶和筛选
1.同源重组臂构建：两侧同源
臂之和不小于5 kb, 单侧不
最好一长一短
是正筛选基因(neo)，在长
3.保持ES 细胞的分化全能性：
1.打靶载体转染ES 细胞：
2.电转后的ES 细胞接种到
性的细胞克隆
3.具有抗性的细胞克隆大多
的结果，只有及少部分发
服务描述
注射ES细胞制备
1. 胚胎干细胞在显微注射前必需通过MAP检测，无
结果
2. 早代数、培养在滋养层上的胚胎干细胞更易于产
3.用胰蛋白酶处理胚胎干细胞使细胞呈单细胞状态，
ES注射后代小鼠的鉴定
传统上最广泛利用的胚胎干细胞系来自129-亚系，具有浅有黑色的毛。
因此，所获得的嵌合体小鼠毛具有黑色和棕由于注射的胚胎干细胞（129）是XY基因型，虽然所获生殖系的传递，这样所获得的嵌合体小鼠将大部分是雄性
1.对于首建者小鼠：通常为杂合子，可以通过与野生型小
鼠交配，获得纯合转基因小鼠
获得该品系的转基因小鼠
获取到优良的基因敲除品系。
建系时的鉴定方法除了基表型及经验等方法进行鉴定，如有毛色差异的嵌合体如有生殖系传递的能力；通常情况下，具有低比列的来自ES细胞毛色的嵌合体是不贡献给生殖系的，一般都把它
ES注射一些进展
The information come from university of california.irvien
JM8囊胚注射
JM8A3囊胚注射
定点原核显微注射
谢谢！！！。