非无菌药品微生物限度标准
版药典非无菌药品微生物限度检查操作规程
版药典非无菌药品微生物限度检查操作规程Revised on July 13, 2021 at 16:25 pm1.目的：建立非无菌药品微生物限度检查检验标准操作规程;规范检验操作;确保检验结果准确..2.适用范围：适用于本公司所有采用非无菌药品微生物限度检查法测定的供试品..3.责任者：QC检验员、QC经理..4.正文：4.1非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法4.1.1简述微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数..当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合规定的微生物限度标准时;应按下述规定进行检验;包括样品的取样量和结果的判断等..除另有规定外;本法不适用于活菌制剂的检查..本检查法可采用替代的微生物检查法;包括自动检测方法;但必须证明替代方法等效于药典规定的检查方法..微生物计数试验应在受控洁净环境下的局部洁净度不低于B级的单向流空气区域内进行..检验全过程必须严格遵守无菌操作;防止再污染;防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出..单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测..如供试品有抗菌活性;应尽可能去除或中和..供试品检查时;若使用了中和剂或灭活剂;应确认其有效性及对微生物无毒性..供试液制备时如果使用了表面活性剂;应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性..4.1.2计数方法计数方法包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法Most-Probable-NumberMethod;简称MPN法..MPN法用于微生物计数时精确度较差;但对于某些微生物污染量很小的供试品;MPN法可能是更适合的方法..供试品检查时;应根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择计数方法;所选的方法必须具备检测充足样品量的能力;以保证所获得的试验结果能够判断供试品是否符合规定..所选方法的适用性须经确认..4.1.3计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性试验供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查..供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验;以确认所采用的方法适合于该产品的微生物计数..若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时;计数方法应重新进行适用性试验..表1试验菌液的制备和使用注：当需用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌和酵母菌总数时;应进行培养基适用性检查;检查方法同沙氏葡萄糖琼脂培养基..4.1.4菌种及菌液制备菌种试验用菌株的传代次数不得超过5代从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0代;并采用适宜的菌种保藏技术进行保存;以保证试验菌株的生物学特性..计数培养基适用性检查和计数方法适用性试验用菌株见表1..菌液制备按表1规定程序培养各试验菌株..取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的新鲜培养物;用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液；取黑曲霉的新鲜培养物加入3～5ml含0.05％聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液;将孢子洗脱..然后;采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内;用含0.05％聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液..菌液制备后若在室温下放置;应在2小时内使用；若保存在2～8℃;可在24小时内使用..稳定的黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃;在验证过的贮存期内使用..4.1.5阴性对照为确认试验条件是否符合要求;应进行阴性对照试验;阴性对照试验应无菌生长..如阴性对照有菌生长;应进行偏差调查..4.1.6培养基适用性检查微生物计数用的成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基适用性检查..按表1规定;接种不大于100cfu的菌液至胰酪大豆胨液体培养基管或胰酪大豆胨琼脂培养基平板或沙氏葡萄糖琼脂培养基平板;置表1规定条件下培养..每一试验菌株平行制备2管或2个平皿..同时;用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验..被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.5-2范围内;且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致；被检液体培养基管与对照培养基管比较;试验菌应生长良好..4.1.7计数方法适用性试验⒈供试液制备根据供试品的理化特性与生物学特性;采取适宜的方法制备供试液..供试液制备若需加温时;应均匀加热;且温度不应超过45℃..供试液从制备至加入检验用培养基;不得超过1小时..常用的供试液制备方法如下..如果下列供试液制备方法经确认均不适用;应建立其他适宜的方法..⑴水溶性供试品取供试品;用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液;或pH7.2磷酸盐缓冲液;或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成1:10供试液..若需要;调节供试液pH值至6～8..必要时;用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释..水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液..⑵水不溶性非油脂类供试品取供试品;用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液;或pH7.2磷酸盐缓冲液;或胰酪大豆胨液体培养基制备成1:10供试液..分散力较差的供试品;可在稀释剂中加入表面活性剂如0.1%的聚山梨酯80;使供试品分散均匀..若需要;调节供试液pH值至6～8..必要时;用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释..⑶油脂类供试品取供试品;加入经过滤除菌的十四烷酸异丙酯使溶解;或与最少量并能使供试品乳化的无菌聚山梨酯80或其他无抑菌性的无菌表面活性剂充分混匀..表面活性剂的温度一般不超过40℃特殊情况下;最多不超过45℃;小心混合;若需要可在水浴中进行;然后加入预热的稀释剂使成1∶10供试液;保温;混合;并在最短时间内形成乳状液..必要时;用含适宜浓度的无菌聚山梨酯80或其他无抑制性无菌表面活性剂的稀释剂进一步10倍系列稀释..⑷需用特殊方法制备供试液的供试品膜剂供试品取供试品;剪碎;加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液;或pH7.2磷酸盐缓冲液;或胰酪大豆胨液体培养基;浸泡;振摇;制备成1∶10的供试液..若需要;调节供试液pH值至6～8..必要时;用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释..肠溶及结肠溶制剂供试品取供试品;加入pH6.8无菌磷酸盐缓冲液用于肠溶制剂或pH7.6无菌磷酸盐缓冲液用于结肠溶制剂;置45℃水浴中;振摇;使溶解;制备成1∶10的供试液..必要时;用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释..气雾剂、喷雾剂供试品取供试品;置冰冻室冷冻约1小时;取出;迅速消毒供试品开启部位;用无菌钢锥在该部位钻一小孔;放至室温;并轻轻转动容器;使抛射剂缓缓全部释出..用无菌注射器从每一容器中吸出全部药液于无菌容器中混合;然后取样检查..贴膏剂供试品取供试品;去掉防粘层;将粘贴面朝上放置在无菌玻璃或塑料器皿上;在粘贴面上覆盖一层适宜的无菌多孔材料如无菌纱布;避免贴膏剂粘贴在一起..将处理后的贴膏剂放入盛有适宜体积并含有表面活性剂如聚山梨脂80或卵磷脂稀释液的容器中;振荡至少30分钟..必要时;用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释..⒉接种和稀释按下列要求进行供试液的接种和稀释;制备微生物回收试验用供试液..所加菌液的体积应不超过供试液体积的1%..为确认供试品中的微生物能被充分检出;首先应选择最低稀释级的供试液进行计数方法适用性试验..1试验组取上述制备好的供试液;加入试验菌液;混匀;使每1ml供试液或每张滤膜所滤过的供试液中含菌量不大于100cfu..2供试品对照组取制备好的供试液;以稀释液代替菌液同试验组操作..3菌液对照组取不含中和剂及灭活剂的相应稀释液替代供试液;按试验组操作加入试验菌液并进行微生物回收试验..若因供试品抗菌活性或溶解性较差的原因导致无法选择最低稀释级的供试液进行方法适用性试验时;应采用适宜的方法对供试液进行进一步的处理..如果供试品对微生物生长的抑制作用无法以其他方法消除;供试液可经过中和、稀释或薄膜过滤处理后再加入试验菌悬液进行方法适应性试验..⒊抗菌活性的去除或灭活供试液接种后;按下列“微生物回收”规定的方法进行微生物计数..若试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值小于菌液对照组菌数值的50%;可采用下述方法消除供试品的抑菌活性..⑴增加稀释液或培养基体积..⑵加入适宜的中和剂或灭活剂..中和剂或灭活剂表2可用于消除抗菌剂的抑菌活性;最好在稀释剂或培养基灭菌前加入..若使用中和剂或灭活剂;试验中应设中和剂或灭活剂对照组;即取相应量稀释液替代供试品同试验组操作;以确认其有效性和对微生物无毒性..中和剂或灭活剂对照组的菌落数与菌液对照组的菌落数的比值应在0.5～2范围内..表2常见干扰物的中和剂或灭活方法⑶采用薄膜过滤法..⑷上述几种方法的联合使用..若没有适宜消除供试品抑菌活性的方法;对特定试验菌回收的失败;表明供试品对该试验菌具有抗菌活性;同时也表明供试品不可能被该类微生物污染..但是;供试品也可能仅对特定试验菌株具有抑制作用;而对其他菌株没有抑制作用..因此;根据供试品须符合的微生物限度标准和菌数报告规则;在不影响检验结果判断的前提下;应采用能使微生物生长的更高稀释级的供试液进行计数方法适用性试验..若方法适用性试验符合要求;应以该稀释级供试液作为最低稀释级的供试液进行供试品检查..⒋供试品中微生物的回收表1所列的计数方法适用性试验用的各试验菌应逐一进行微生物回收试验..微生物的回收可采用平皿法、薄膜过滤法或MPN法..⑴平皿法平皿法包括倾注法和涂布法..表1中每株试验菌每种培养基至少制备2个平皿;以算术均值作为计数结果..倾注法取照上述“供试液的制备”、“接种和稀释”和“抑菌活性的中和或消除”制备的供试液1ml;置直径90mm的无菌平皿中;注入15～20ml温度不超过45℃熔化的胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基;混匀;凝固;倒置培养..若使用直径较大的平皿;培养基的用量应相应增加..按表1规定条件培养、计数..同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数..计算各试验组的平均菌落数..涂布法取15～20ml温度不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基;注入直径90mm的无菌平皿;凝固;制成平板;采用适宜的方法使培养基表面干燥..若使用直径较大的平皿;培养基用量也应相应增加..每一平皿表面接种上述照“供试液的制备”、“接种和稀释”和“抑菌活性的中和或消除”制备的供试液不少于0.1ml..按表1规定条件培养、计数..同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数..计算各试验组的平均菌落数..⑵薄膜过滤法薄膜过滤法所采用的滤膜孔径应不大于0.45μm;直径一般为50mm;若采用其他直径的滤膜;冲洗量应进行相应的调整..选择滤膜材质时应保证供试品及其溶剂不影响微生物的充分被截留..滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌..使用时;应保证滤膜在过滤前后的完整性..水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜..油类供试品;其滤膜和滤器在使用前应充分干燥..为发挥滤膜的最大过滤效率;应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面..供试液经薄膜过滤后;若需要用冲洗液冲洗滤膜;每张滤膜每次冲洗量为100ml..总冲洗量不得超过1000ml;以避免滤膜上的微生物受损伤..取照上述“供试液的制备”、“接种和稀释”和“抑菌活性的中和或消除”制备的供试液适量一般取相当于1g、1ml或10cm2的供试品;若供试品中所含的菌数较多时;供试液可酌情减量;加至适量的稀释液中;混匀;过滤..用适量的冲洗液冲洗滤膜..若测定需氧菌总数;转移滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上；若测定霉菌和酵母总数;转移滤膜菌面朝上贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上..按表1规定条件培养、计数..每株试验菌每种培养基至少制备一张滤膜..同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数..⑶MPN法MPN法的精密度和准确度不及薄膜过滤法和平皿计数法;仅在供试品需氧菌总数没有适宜计数方法的情况下使用;本法不适用于霉菌计数..若使用MPN法;按下列步骤进行..取照上述“供试液的制备”、“接种和稀释”和“抑菌活性的中和或消除”制备的供试液至少3个连续稀释级;每一稀释级取3份1ml分别接种至3管装有9～10ml胰酪大豆胨液体培养基中;同法测定菌液对照组菌数..必要时可在培养基中加入表面活性剂、中和剂或灭活剂..接种管置30～35℃培养3天;逐日观察各管微生物生长情况..如果由于供试品的原因使得结果难以判断;可将该管培养物转种至胰酪大豆胨液体培养基或胰酪大豆胨琼脂培养基;在相同条件下培养1～2天;观察是否有微生物生长..根据微生物生长的管数从表3查对被测供试品每1g或每1ml中总需氧菌的最可能数..表3微生物最可能数检索表注：表内所列检验量如改用1g或ml、0.1g或ml和0.01g或ml时;表内数字应相应降低10倍；如改用0.01 g或ml、0.001 g或ml和0.0001 g或ml时;表内数字应相应增加10倍;其余类推..⒌结果判断计数方法适用性试验中;采用薄膜过滤法或平皿法时;试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5～2范围内；采用MPN法;试验组菌数应在菌液对照组菌数的95%置信限内..若各试验菌的回收试验均符合要求;照所用的供试液制备方法及计数方法进行该供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数..方法适用性确认时;若采用上述方法还存在一株或多株试验菌的回收达不到要求;那么选择回收最接近要求的方法和试验条件进行供试品的检查..4.1.8供试品检查检验量检验量即一次试验所用的供试品量g、ml或cm2..除另有规定外;一般供试品的检验量为10g或10ml；膜剂为100cm2；贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减..检验时;应从2个以上最小包装单位中抽取供试品;大蜜丸还不得少于4丸;膜剂还不得少于4片..一般应随机抽取供试品;取规定容器数;混合;取规定量供试品进行检验..供试品的检查按计数方法适用性试验确认的计数方法进行供试品中需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定..胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基用于测定需氧菌总数；沙氏葡萄糖琼脂培养基用于测定霉菌和酵母菌总数..阴性对照试验以稀释剂代替供试液进行阴性对照试验;阴性对照试验应无菌生长..如果阴性对照有菌生长;应进行偏差调查..⒈平皿法平皿法包括倾注法和涂布法..除另有规定外;取规定量供试品;按方法适用性试验确认的方法进行供试液制备和菌数测定;每稀释级每种培养基至少制备2个平皿..培养和计数除另有规定外;胰酪大豆胨琼脂培养基平板在30～35℃培养3天;沙氏葡萄糖琼脂培养基平板在20～25℃培养5天;观察菌落生长情况;点计平板上生长的所有菌落数;必要时可适当延长培养时间至7天进行菌落计数并报告..菌落蔓延生长成片的平皿不宜计数..点计菌落数后;计算各稀释级供试液的平均菌落数;按菌数报告规则报告菌数..若同稀释级两个平皿的菌落数平均值不小于15;则两个平皿的菌落数不能相差1倍或以上..菌数报告规则需氧菌总数测定宜选取平均菌落数小于300cfu的稀释级、霉菌和酵母菌总数测定宜选取平均菌落数小于100cfu的稀释级;作为菌数报告取两位有效数字的依据..取最高的平均菌落数;计算1g、1ml或10cm2供试品中所含的微生物数..如各稀释级的平皿均无菌落生长;或仅最低稀释级的平板有菌落生长;但平均菌落数小于1时;以﹤1乘以最低稀释倍数的值报告菌数..⒉薄膜过滤法除另有规定外;按计数方法适用性试验确认的方法进行供试液制备..取相当于1g、1ml或10cm2供试品的供试液;若供试品所含的菌数较多时;可取适宜稀释级的供试液;照方法适用性试验确认的方法加至适量稀释液中;立即过滤;冲洗;冲洗后取出滤膜;菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基上培养..培养和计数培养条件和计数方法同平皿计数法;每张滤膜上的菌落数应不超过100cfu..菌数报告规则以相当于1g、1ml或10cm2供试品的菌落数报告菌数；若滤膜上无菌落生长;以﹤1报告菌数每张滤膜过滤1g、1ml或10cm2供试品;或﹤1乘以最低稀释倍数的值报告菌数..⒊MPN法取规定量供试品;按方法适用性试验确认的方法进行供试液制备和供试品接种;所有试验管在30～35℃培养3～5天;如果需要确认是否有微生物生长;按方法适应性试验确定的方法进行..记录每一稀释级微生物生长的管数;从表3查对每1g或1ml供试品中需氧菌总数的最可能数..4.1.9结果判断需氧菌总数是指胰酪大豆胨琼脂培养基上生长的总菌落数包括真菌菌落数；霉菌和酵母菌总数是指沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的总菌落数包括细菌菌落数..若因沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的细菌使霉菌和酵母菌的计数结果不符合微生物限度要求;可使用含抗生素如氯霉素、庆大霉素的沙氏葡萄糖琼脂培养基或其他选择性培养基如玫瑰红钠琼脂培养基进行霉菌和酵母菌总数测定..使用选择性培养基时;应进行培养基适用性检查..若采用MPN法;测定结果为需氧菌总数..各品种项下规定的微生物限度标准解释如下：101cfu：可接受的最大菌数为20；102cfu：可接受的最大菌数为200；103cfu：可接受的最大菌数为2000：依此类推..若供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的检查结果均符合该品种项下的规定;判供试品符合规定；若其中任何一项不符合该品种项下的规定;判供试品不符合规定..稀释液、冲洗液及培养基见非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法通则1106无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器具、原料、辅料、及其他品种是否无菌的一种方法..若供试品符合无菌检查法的规定;仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染..稀释液、冲洗液及培养基见非无菌产品微生物限度检查：控制及检查法..4.2非无菌产品微生物限度检查：控制及检查法4.2.1简述控制菌检查法系用于在规定的试验条件下;检查供试品中是否存在特定的微生物..当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料是否符合相应的微生物限度标准时;应按下列规定进行检验;包括样品取样量和结果判断等..本检查法可采用替代的微生物检查法;包括自动检测方法;但必须证明替代方法等效于药典规定的检查方法..供试液制备及实验环境要求同“非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法”通则1105..如果供试品具有抗菌活性;应尽可能去除或中和..供试品检查时;若使用了中和剂或灭活剂;应确认有效性及对微生物无毒性..供试液制备时如果使用了表面活性剂;应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性..4.2.2培养基适用性检查和控制菌检查方法适用性试验供试品控制菌检查中所使用的培养基应进行适用性检查..供试品的控制菌检查方法应进行方法适用性试验;以确认所采用的方法适合于该产品的控制菌检查..若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时;控制菌检查方法应重新进行适用性试验..4.2.3菌种及菌液制备菌种试验用菌株的传代次数不得超过5代从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0代;并采用适宜的菌种保藏技术进行保存;以保证试验菌株的生物学特性..金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus〔CMCCB26003〕铜绿假单胞菌Pseudomonasaeruginosa〔CMCCB10104〕大肠埃希菌Escherichiacoli〔CMCCB44102〕乙型副伤寒沙门菌SalmonellaparatyphiB〔CMCCB50094〕白色念珠菌Candidaalbicans〔CMCCF98001〕生孢梭菌Clostridiumsporogenes〔CMCCB64941〕菌液制备将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、沙门菌分别接种于胰酪大豆胨液体培养基中或在胰酪大豆胨琼脂培养基上;30～35℃培养18～24小时；将白色念珠菌接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基上或沙氏葡萄糖液体培养基中;20～25℃培养2～3天；将生孢梭菌接种于梭菌增菌培养基中置厌氧条件下30～35℃培养24～48小时或接种于硫乙醇酸盐流体培养基中30～35℃培养18～24小时..上述培养物用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液..菌液制备后若在室温下放置;应在2小时内使用；若保存在2～8℃;可在24小时内使用..生孢梭菌孢子悬液可替代新鲜的菌悬液;稳定的孢子悬液可保存在2～8℃;在验证过的贮存期内使用..4.2.4阴性对照为确认试验条件是否符合要求;应进行阴性对照试验;阴性对照试验应无菌生长..如阴性对照有菌生长;应进行偏差调查..4.2.5培养基适用性检查控制菌检查用的成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基的适用性检查..控制菌检查用培养基的适用性检查项目包括促生长能力、抑制能力及指示特性的检查..各培养基的检测项目及所用的菌株见表1..表1控制菌检查用培养基的促生长能力、抑制能力和指示特性液体培养基促生长能力检查分别接种不大于100cfu的试验菌见表1于被检培养基和对照培养基中;在相应控制菌检查规定的培养温度及不长于规定的最短培养时间下培养;与对照培养基管比较;被检培养基管试验菌应生长良好..固体培养基促生长能力检查用涂布法分别接种不大于100cfu的试验菌见表1于被检培养基和对照培养基平板上;在相应控制菌检查规定的培养温度及不长于规定的最短培养时间下培养;被检培养基与对照培养基上生长的菌落大小、形态特征应一致..培养基抑制能力检查接种不少于100cfu的试验菌见表1于被检培养基和对照培养基中;在相应控制菌检查规定的培养温度及不短于规定的最长培养时间下培养;试验菌应不得生长..培养基指示特性检查用涂布法分别接种不大于100cfu的试验菌见表1于被检培养基和对照培养基平板上;在相应控制菌检查规定的培养温度及不长于规定的最短培养时间下培养;被检培养基上试验菌生长的菌落大小、形态特征、指示剂反应情况等应与对照培养基一致..4.2.6控制菌检查方法适用性试验供试液制备按下列“供试品检查”中的规定制备供试液..试验菌根据各品种项下微生物限度标准中规定检查的控制菌选择相应试验菌株;确认耐胆盐革兰阴性菌检查方法时;采用大肠埃希菌和铜绿假单胞菌为试验菌..适用性试验按控制菌检查法取规定量供试液及不大于100cfu的试验菌接入规定的培养基中；采用薄膜过滤法时;取规定量供试液;过滤;冲洗;试验菌应加在最后一次冲洗液中;过滤后;注入规定的培养基或取出滤膜接入规定的培养基中..依相应的控制菌检查方法;在规定的温度及最短时间下培养;应能检出所加试验菌相应的反应特征..结果判断上述试验若检出试验菌;按此供试液制备法和控制菌检查方法进行供试品检查；若未检出试验菌;应消除供试品的抑菌活性见非无菌产品微生物检查：微生物计数法中的“抗菌活性的去除或灭活”;并重新进行方法适用性试验..。
非无菌产品微生物限度标准修订
路漫漫其修远兮, 吾将上下而求索
2020年4月9日星期四
2015年版药典药品微生物度标准修订
我国药品微生物限度标准的历史沿革 2015版微生物限度标准增修订内容 非无菌药品微生物限度标准 微生物限度标准的表述 需氧菌总数、真菌数数值的表述 微生物限度标准的解释
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标准 2、品种正文项下：
【 无菌 】 受热不稳定、制剂不能进行最终灭菌的无菌工艺产品 用于手术、烧伤或严重创伤的局部给药制剂 应符合无菌检查法规定。 3、非无菌化学药品及生物制品制剂的微生物限度标准（见表1）
按10个给药途径，以固体、液体性状分别给出具体的限度标准要求。
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《 2015版药典 》抑菌效力检查法修订内容
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抑菌剂 是指抑制微生物生长的化学物质，有时也称防腐剂。 ⒈抑菌效力检查法系用于测定无菌及非无菌制剂的抑菌活性，以评价最终产 品的抑菌效力， ⒉用于指导生产企业在研发阶段制剂中抑菌剂浓度的确定。 以防止制剂在正常贮藏或使用过程中可能发生的微生物污染和繁殖使药物变 质而对使用者造成危害，尤其是多剂量包装的制剂。
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微生物限度标准解释
⑷制剂通则项下微生物限度检查项目 必检项目 制剂通则项下有微生物限度要求的制剂为必检项目 原则性要求 化学药品丸剂、口服 片剂、胶囊剂、颗粒剂；应对其被微生 物污染的风险进行评估,在保证患者用药安全安全的前提下，通过历史回顾 分析可不进行批批检验。 ⑸如果上述制剂的性质及工艺的原因导致产品易受微生物污染，应在品 种项下列出微生物限度检查项及微生物限度标准，如 生化类制剂。
9202 非无菌药品微生物限度检查指导原则
9202 非无菌药品微生物限度检查指导原则为更好应用非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法（通则 1105）、 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法（通则 1106）及非无菌药品微 生物限度标准 (通则 1101)，特制定本指导原则。
非无菌药品中污染的某些微生物可能导致药物活性降低， 甚至使药品丧失疗 效，从而对患者健康造成潜在的危害。
因此，在药品生产、贮藏和流通各个环节 中，药品生产企业应严格遵循 GMP 的指导原则，以降低产品受微生物污染程度。
非无菌产品微生物计数法、 控制菌检查法及药品微生物限度标准可用于判断非规 定无菌制剂及原料、辅料是否符合药典的规定，也可用于指导制剂、原料、辅料 微生物质量标准的制定，及指导生产过程中间产品微生物质量的监控。
本指导原 则将对微生物限度标准和方法中的特定内容及标准的应用做进一步的说明。
1.非无菌药品微生物限度检查中，受控的洁净环境是指不低于 GMP 现行版要 求的 D 级洁净环境。
2. 非无菌药品微生物限度检查过程中，如使用表面活性剂、灭活剂及中和 剂，在确定其能否适用于所检样品及其用量时，除应证明该试剂对所检样品的处 理有效外,还须确认该试剂不影响样品中可能污染的微生物的检出(即无毒性)， 因 此无毒性确认试验的菌株不能仅局限于验证试验菌株， 而应当包括产品中可能污 染的微生物。
3.供试液制备方法、抑菌成分的消除方法及需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数 计数方法应尽量选择微生物计数方法中操作简便、快速的方法,同时,所选用的方 法应避免损伤供试品中污染的微生物。
对于抑菌作用较强的供试品,在供试品溶 液性状允许的情况下，应尽量选用薄膜过滤法进行试验。
4.对照培养基系指按培养基处方特别制备、质量优良的培养基，用于培养基 适用性检查，以保证药品微生物检验用培养基的质量。
对照培养基由中国食品药 品检定研究院研制及分发。
5.进行微生物计数方法适用性试验时,若因没有适宜的方法消除供试品中的 抑菌作用而导致微生物回收的失败， 应采用能使微生物生长的更高稀释级供试液 进行方法适用性试验。
非无菌药品微生物限度检查指导原则
非无菌药品微生物限度检查指导原则微生物限度检查是药品质量控制中的重要环节，尤其对于非无菌药品而言更为重要。
本文将对非无菌药品微生物限度检查的指导原则进行详细介绍，旨在提高药品的质量安全性。
一、检验项目及标准非无菌药品微生物限度检查的主要检验项目包括总生菌数、大肠菌群、霉菌和酵母菌等。
每一项检验项目都有相应的标准来衡量合格与否。
以下是常用的标准：1. 总生菌数：根据药典要求，大部分非无菌药品每克不得超过1000 CFU（菌落形成单位）。
2. 大肠菌群：大肠菌群是肠道中的常见菌种，其存在可能暗示有肠源性污染。
检验结果一般要求不得检出大肠菌群。
3. 霉菌和酵母菌：霉菌和酵母菌是环境中广泛存在的微生物，在非无菌药品中的存在可能引发变质，甚至导致严重的药品质量问题。
一般情况下，每克药品中不得检出霉菌和酵母菌。
二、样品的选择和采集在进行微生物限度检查前，需选择合适的样品，并采取正确的样品采集方式。
以下是一些常用的样品选择和采集方法：1. 样品选择：根据药品的特性，选择代表性的样品进行检测。
选取多个批次的不同规格的样品进行检验更有利于全面评估该药品的微生物污染水平。
2. 样品采集：在采集样品前，先进行适当的表面消毒，以避免外源性污染。
采集时应遵循严格的无菌操作，确保样品的真实性和可靠性。
常用的样品采集方法包括划线法、切割法、稀释法等。
三、检验方法和操作流程微生物限度检查需要使用一系列严格的操作流程和检验方法，以保证结果的准确性和可比性。
以下是一般的操作流程：1. 样品预处理：根据药品的特性，选择适当的预处理方法，如溶解、稀释、震荡等，以提高微生物的检出率。
2. 培养基选择：根据不同的菌种需求，选择适宜的培养基进行菌落的培养。
常用的培养基有营养琼脂平板、大肠埃希菌选择平板、马铃薯葡萄糖琼脂平板等。
3. 培养条件：根据菌种的生长特性和检验项目的要求，设定适当的温度、时间和培养条件，以促进菌落的生长。
4. 菌落计数：通过目视或自动计数法，对培养基上的菌落进行计数。
非无菌药品微生物限度标准
或
cfu/10cm2）
霉菌和酵母菌总数 （cfu/g、cfu/ml 或 cfu/10cm2）
控制菌
口服给药★
固体制剂
103
液体制剂
102
不得检出大肠埃希菌（1g 或 1ml）；含脏器提取物的制剂 102 还不得检出沙门菌（10g 或 101 10ml）
口腔黏膜给药制剂
齿龈给药制剂
102
鼻用制剂
不得检出大肠埃希菌、金黄
或 cfu/10cm2）
或 cfu/10cm2）
固体口服给药制剂
不得检出大肠埃希菌（1g）；
不含豆豉、神曲 104（丸剂 3×104）
102
不得检出沙门菌（10g）；耐
等发酵原粉
胆盐革兰阴性菌应小于
含豆豉、神曲等
105
5×102不得检出大肠埃希菌（1ml）；
102
铜 绿 假 单 胞 菌 （ 1g 或
10cm2）；阴道、尿道给药制
102
剂还不得白色念珠菌、梭菌
（1g 或 10cm2）
不得检出金黄色葡萄球菌、
102
铜绿假单胞菌（1ml）；阴道、
尿道给药制剂还不得白色
102
念珠菌、梭菌（1ml）
5. 非无菌的药用原料及辅料微生物限度标准（见表 3）
表 3 非无菌药用原料及辅料微生物限度标准
10cm2）
化学药品制剂和生物制品制剂若含有未经提取的动植物来源的成份及矿物质还
不得检出沙门菌（10g 或 10ml）。
4. 非无菌含药材原粉的中药制剂微生物限度标准（见表 2）
表 2 非无菌含药材原粉的中药制剂微生物限度标准
给药途径
需氧菌总数 霉菌和酵母菌总数
控制菌
2015版中国药典微生物限度
1.4.2供试品检查
• 供试液制备
– ⑵ 水不溶性非油脂类供试品
• 取供试品， 用 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨 缓冲液，或 pH7.2 磷酸盐缓冲液，或胰酪 大豆胨液体培养基制备成 1:10 供试液。 分散力较差的供试品，可在稀释液中加入 表面活性剂如 0.1%的聚山梨酯 80，使供 试品分散均匀。若需要，调节供试液 pH 值至 6～8。必要时，用同一稀释液将供 试液进一步 10倍系列稀释。
1.3.3计数方法适用性试验
1. 供试液制备 2. 接种和稀释 3. 抗菌活性的去除与灭活 4. 供试品中微生物的回收
– 平皿法 – 薄膜过滤法 – 最可能数法（MPN 法）
5. 结果判断
1.4 供试品检查
• 1.4.1检验量
– 检验量即一次试验所用的供试品量（g、ml
或cm²）。
– 除另有规定外,一般供试品的检验量为10g 或
• 需氧菌总数是指胰酪大豆胨琼脂培养基上生长的 总菌落数（包括真菌菌落数）；
• 霉菌和酵母菌总数是指沙氏葡萄糖琼脂培养基上 生长的总菌落数（包括细菌菌落数）。
• 若因沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的细菌使霉菌 和酵母菌的计数结果不符合微生物限度要求，可 使用含抗生素（如氯霉素、庆大霉素）的沙氏葡 萄糖琼脂培养基或其他选择性培养基（如玫瑰红 钠琼脂培养基）进行霉菌和酵母菌总数测定。
1.4.2供试品检查
• 供试液制备
– ⑷需用特殊方法制备供试液的供试品
• 膜剂供试品 • 肠溶及结肠溶制剂供试品 • 气雾剂、喷雾剂供试品 • 贴膏剂供试品
1.4.2供试品检查
1. 平皿法
– 平皿法包括倾注法和涂布法。 – 除另有规定外，取规定量供试品，按方法适用性
试验确认的方法进行供试液制备和菌数测定，每 稀释级每种培养基至少制备2个平皿。 – 培养和计数 除另有规定外，胰酪大豆胨琼脂培养 基平板在30～35℃培养3~5天，沙氏葡萄糖琼脂 培养基平板在20～25℃培养5 ~7天， 观察菌落 生长情况,点计平板上生长的所有菌落数，必要时 可适当延长培养时间至7 天进行菌落计数并报告 。菌落蔓延生长成片的平皿不宜计数。点计菌落 数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌 数报告规则报告菌数。 – 若同稀释级两个平皿的菌落数平均值不小于15， 则两个平皿的菌落数不能相差1 倍或以上。
中国药典2020微生物限度检查
中国药典2020微生物限度检查【原创实用版】目录1.2020 版《中国药典》微生物限度检查概述2.非无菌产品微生物限度的检查要点3.微生物限度计数及耐胆盐革兰阴性菌4.药典委发布的相关国家标准草案5.中药饮片微生物限度检查法6.美国药典 USP 微生物限度检查正文2020 版《中国药典》微生物限度检查概述2020 版《中国药典》是药品质量标准的重要参考文献，其中包含了关于微生物限度检查的详细规定。
微生物限度检查是为了确保药品在生产、储存和使用过程中不会受到微生物污染，从而保证药品的安全性和有效性。
本文将对 2020 版《中国药典》中的微生物限度检查进行概述。
非无菌产品微生物限度的检查要点非无菌产品的微生物限度检查是药品质量控制中的重要环节。
根据2020 版《中国药典》的规定，非无菌产品的微生物限度检查主要包括以下几个方面：1.菌种及菌液制备：需要对铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌等菌种进行培养，确保培养物的活性和纯度。
2.培养条件：在 35℃的条件下，将新鲜培养物用 pH7.0 的 0.9% 无菌氯化钠溶液进行处理。
3.计数方法：采用适当的计数方法对微生物数量进行测定，如平板计数法等。
微生物限度计数及耐胆盐革兰阴性菌2020 版《中国药典》对微生物限度计数进行了详细的规定，主要包括耐胆盐革兰阴性菌的计数。
在药品生产过程中，需要对耐胆盐革兰阴性菌的数量进行严格的控制，以确保药品的质量和安全性。
药典委发布的相关国家标准草案近日，国家药典委员会发布了《凡例》、《微生物限度检查法》等 5 份国家标准草案。
这些草案对于药品微生物限度检查的标准化和规范化具有重要意义。
中药饮片微生物限度检查法中药饮片微生物限度检查法用于检查中药材及中药饮片的微生物污染程度。
检查项目包括需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、耐热菌总数、耐胆盐革兰阴性菌、大肠埃希菌、沙门菌等。
中药饮片微生物限度检查的试验环境应符合微生物限度检查的要求，全过程必须严格遵守无菌操作。
2020年版《中国药典》通则 —“非无菌药品微生物限度标准”
2020年版《中国药典》通则“非无菌药品微生物限度标准”（蓝色字体表示新增内容，红色字体表示删减内容）非无菌药品的微生物限度标准是基于药品的给药途径和对患者健康潜在的危害以及药品的特殊性而制订的。
药品生产、贮存、销售过程中的检验，药用原料、辅料及、中药提取物及中药饮片的检验，新药标准制订，进口药品标准复核，考察药品质量及仲裁等，除另有规定外，其微生物限度均以本标准为依据。
1.制剂通则、品种项下要求无菌的及标示无菌的制剂和原辅料应符合无菌检查法规定。
2.用于手术、严重烧伤、严重创伤的局部给药制剂应符合无菌检查法规定。
3.非无菌化学药品制剂、生物制品制剂、不含药材原粉的中药制剂的微生物限度标准见表 1。
表 1 非无菌化学药品制剂、生物制品制剂、不含药材原粉的中药制剂的微生物限度标准给药途径需氧菌总数（cf u/g、cf u/m l或cf u/10c m2）霉菌和酵母菌总数（cf u/g、c fu/m l或cfu/10cm2）控制菌口服给药①固体制剂液体及半固体制剂103102102101不得检出大肠埃希菌（1g 或1ml）；含脏器提取物的制剂还不得检出沙门菌（10g 或10ml）口腔黏膜给药制剂齿龈给药制剂鼻用制剂102101不得检出大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌（1g、1ml 或 10cm2）耳用制剂皮肤给药制剂102101不得检出金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌（1g、1ml 或10cm2）呼吸道吸入给药制剂102101不得检出大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、或 10ml ） 阴道、尿道给药制剂102101不得检出金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌（1g 、1ml 或 10cm 2）；中药制剂还不得检出梭菌（1g 、 1ml 或 10cm 2）直肠给药 固体制剂103102 不得检出金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌（1g 或 1ml ）其他局部给药制剂102102不得检出金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌（1g 、1ml 或 10cm 2）注 ①化学药品制剂和生物制品制剂若含有未经提取的动植物来源的成份及矿物质还不得检出沙门菌（10g 或 10ml ）。
生物制品原液微生物限度标准
生物制品原液微生物限度标准
生物制品原液的微生物限度标准主要依据《中国药典》和《药品生产质量管理规范》进行制定。
以下是具体的标准：
1. 对于非无菌的生物制品，其微生物限度标准通常包括细菌、霉菌和酵母菌总数以及控制菌的检查。
2. 细菌、霉菌和酵母菌总数的标准：对于每1ml生物制品原液，细菌数不
得超过100cfu，霉菌和酵母菌数不得超过100cfu。
同时，对于每1g生物
制品原液，细菌数不得超过1000cfu，霉菌和酵母菌数不得超过1000cfu。
3. 控制菌检查的标准：对于生物制品原液，应按照《中国药典》和《药品生产质量管理规范》的规定进行控制菌检查，如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等。
控制菌检查应为阴性。
4. 对于有特殊用途或规定的生物制品，如用于免疫治疗的制品、基因治疗制品等，其微生物限度标准应根据相关规定进行制定。
此外，在生物制品的生产过程中，应遵循无菌操作规程，采用经过验证的无菌工艺和设备，并进行严格的质量控制，确保产品的安全性和有效性。
药品微生物限度标准
药品微生物限度标准非无菌药品的微生物限度标准是基于药品的给药途径和对患者健康潜在的危害以及药品的特殊性而制订的。
药品生产、贮存、销售过程中的检验，化学药品原料药、中药提取物及辅料的检验，新药标准制订，进口药品标准复核，考察药品质量及仲裁等，除另有规定外，其微生物限度均以本标准为依据。
非无菌制剂的总需氧菌数、总霉菌及酵母菌数测定照附录×××检查；非无菌制剂的控制菌检查照附录×××检查。
本限度标准解释如下：101CFU：最大可接受限值＝20；102CFU：最大可接受限值＝200；103CFU：最大可接受限值＝2000。
以此类推。
1.制剂通则、品种项下要求无菌的制剂及标示无菌的制剂应符合无菌检查法规定。
2.口服给药制剂2.1 不含药材原粉的口服给药制剂需氧菌总数每1g不得过103cfu。
每1ml不得过102cfu。
霉菌及酵母菌总数每1g不得过102cfu。
每1ml不得过101cfu。
大肠埃希菌每1g或1ml不得检出。
沙门菌含脏器提取物的口服给药制剂每10g或10ml不得检出。
2.2含药材原粉的口服制剂2.2.1不含豆豉、神曲等发酵原粉的口服给药制剂需氧菌总数每1g不得过10000cfu。
每1ml不得过100cfu。
霉菌及酵母菌总数每1g或1ml不得过100cfu。
大肠埃希菌每1g或1ml不得检出。
沙门菌每10g或10ml不得检出。
耐胆盐革兰阴性菌每1g应小于102个。
每1ml应小于101个。
2.2.2 含豆豉、神曲等发酵原粉的口服制剂需氧菌总数每1g不得过100000cfu。
每1ml不得过1000cfu。
霉菌和酵母菌总数每1g不得过500cfu。
每1ml不得过100cfu。
大肠埃希菌每1g或1ml不得检出。
沙门菌每10g或10ml不得检出。
耐胆盐革兰阴性菌每1g应小于102个。
每1ml应小于101个。
3.局部给药制剂3.1 用于手术、烧伤或严重创伤的局部给药制剂应符合无菌检查法规定。
EP 5.1.4 非无菌制剂和药用物质的微生物质量标准(中英文)
01/2011:50104 5.1.4. MICROBIOLOGICAL QUALITY OF NON-STERILE PHARMACEUTICAL PREPARATIONS AND SUBSTANCES FOR PHARMACEUTICAL USE (1) 非无菌制剂和药用物质的微生物质量The presence of certain micro-organisms in non-sterile preparations may have the potential to reduce or even inactivate the therapeutic activity of the product and has a potential to adversely affect the health of the patient.在非无菌制剂中如果存在某些微生物，可能会降低或抑制药物的治疗活性，可能会对病人健康有潜在不良影响。
Manufacturers therefore have to ensure a low bioburden of finished dosage forms by implementing current guidelines on Good Manufacturing Practice during the manufacture, storage and distribution of pharmaceutical preparations.因此，生产商应在药品生产、存贮和销售过程中遵守现行GMP指南，来保证制剂的微生物在一个较低的水平。
Microbial examination of non-sterile products is performed according to the methods given in general chapters 2.6.12 and 2.6.13. Acceptance criteria for non-sterile pharmaceutical products based upon the total aerobic microbial count (TAMC) and the total combined yeasts/moulds count (TYMC) are given in Tables 5.1.4-1 and 5.1.4-2. Acceptance criteria are based on individual results or on the average of replicate counts when replicate counts are performed (e.g. direct plating methods).非无菌产品微生物检查应依据通则2.6.12和2.6.13中指定的方法进行。
微生物限度中国药典2020年版四部通则1105、1106、1107
微生物限度中国药典2020年版四部通则1105、1106、
1107
摘要：
一、微生物限度检查的重要性
二、中国药典2020 年版四部通则1105、1106、1107 介绍
三、微生物限度检查方法
四、微生物限度检查在药品质量管理中的作用
正文：
微生物限度检查在药品生产和质量控制中扮演着至关重要的角色。
它旨在确保药品中微生物的数量和种类符合规定标准，以避免微生物污染和药品失效。
在中国，药品的微生物限度检查主要依据《中国药典》进行。
《中国药典》2020 年版四部通则1105、1106、1107 对微生物限度检查进行了详细规定。
其中，1105 通则规定了非无菌药品微生物限度检查的基本要求和方法；1106 通则针对无菌药品的微生物限度检查进行了规定；1107 通则则对微生物限度检查中使用的培养基、试剂和仪器等进行了详细说明。
微生物限度检查方法主要包括计数法和定性法。
计数法是通过计算样品中微生物的数量来判断其是否符合规定标准；定性法则是通过观察和鉴定微生物的种类，以确定其是否为有害微生物。
这两种方法在实际应用中往往相互结合，以提高检查的准确性。
微生物限度检查在药品质量管理中发挥着重要作用。
首先，它为药品生产过程中的微生物控制提供了依据，帮助企业制定合理的生产工艺和质量控制策
略。
其次，微生物限度检查可以有效防止药品在生产和储存过程中的微生物污染，保证药品的安全性和有效性。
最后，微生物限度检查还有助于药品监管部门对药品质量进行监督和评价，确保药品市场秩序和公众用药安全。
总之，微生物限度检查在药品质量管理中具有重要意义。
非无菌药品微生物限度标准
附录×××非无菌药品微生物限度标准非无菌药品的微生物限度标准是基于药品的给药途径和对患者健康潜在的危害以及药品的特殊性而制订的。
药品生产、贮存、销售过程中的检验，药用原料、辅料及中药提取物的检验，新药标准制订，进口药品标准复核，考察药品质量及仲裁等，除另有规定外，其微生物限度均以本标准为依据。
1.制剂通则、品种项下要求无菌的制剂及标示无菌的制剂和原辅料应符合无菌检查法规定。
2.用于手术、烧伤或严重创伤的局部给药制剂应符合无菌检查法规定。
3. 非无菌不含药材原粉的中药制剂微生物限度标准（见表1）表1 非无菌不含药材原粉的中药制剂微生物限度标准给药途径需氧菌总数（CFU/g、 CFU/m或CFU/10cm2）霉菌及和酵母菌总数（CFU/g、 CFU/m或CFU/10cm2）控制菌口服固体给药制剂103102不得检出大肠埃希菌（1g）；含脏器提取物的制剂还不得检出沙门菌（10g）口服液体给药制剂102101不得检出大肠埃希菌（1ml）；含脏器提取物的制剂还不得检出沙门菌（10ml）口腔黏膜给药制剂齿龈给药制剂鼻用制剂102101不得检出大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌（1g、1ml或10cm2）耳用制剂皮肤给药制剂102101不得检出金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌（1g、1ml或10cm2）呼吸道吸入给药制剂102101不得检出大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、耐胆盐革兰阴性菌（1g或1ml）阴道、尿道给药制剂102101不得检出金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、梭菌（1g、1ml或10cm2）直肠给药固体制剂液体制剂103102102102不得检出金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌（1g或1ml）其他局部给药制剂102102不得检出金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌（1g、1ml或10cm2）4. 非无菌含药材原粉的中药制剂微生物限度标准（见表2）表2非无菌含药材原粉的中药制剂微生物限度标准给药途径需氧菌总数（CFU/g、 CFU/mL或CFU/10cm2）霉菌和酵母菌总数（CFU/g、 CFU/mL或CFU/10cm2）控制菌固体口服给药制剂不含豆豉、神曲等发酵原粉含豆豉、神曲等发酵原粉104（丸剂3×104）1051025×102不得检出大肠埃希菌（1g）；不得检出沙门菌（10g）；耐胆盐革兰阴性菌应小于102（1g）。
2015版中国药典微生物限度
1.4.2供试品检查
• 供试液制备
– ⑶油脂类供试品
• 取供试品，加入无菌十四烷酸异丙酯使溶 解，或与最少量并能使供试品乳化的无菌 聚山梨酯 80或其他无抑菌性的无菌表面 活性剂充分混匀。表面活性剂的温度一般 不超过 40℃（特殊情况下，最多不超过 45℃），小心混合，若需要可在水浴中进 行，然后加入预热的稀释液使成 1∶10供 试液，保温，混合，并在最短时间内形成 乳状液。必要时，用稀释液或含上述表面 活性剂的稀释液进一步 10倍系列稀释。
– 培养和计数 培养条件和计数方法同平皿计数 法，每张滤膜上的菌落数应不超过100cfu。
• 菌数报告规则
– 以相当于 1g、1ml 或10cm2 供试品的菌落数 报告菌数；若滤膜上无菌落生长，以﹤1 报 告菌数（每张滤膜过滤1g、1ml 或10cm2 供 试品）,或﹤1 乘以最低稀释倍数的值报告菌 数。
1.4.2供试品检查
• 供试液制备
– ⑷需用特殊方法制备供试液的供试品
• 膜剂供试品 • 肠溶及结肠溶制剂供试品 • 气雾剂、喷雾剂供试品 • 贴膏剂供试品
1.4.2供试品检查
1. 平皿法
– 平皿法包括倾注法和涂布法。 – 除另有规定外，取规定量供试品，按方法适用性
试验确认的方法进行供试液制备和菌数测定，每 稀释级每种培养基至少制备2个平皿。 – 培养和计数 除另有规定外，胰酪大豆胨琼脂培养 基平板在30～35℃培养3~5天，沙氏葡萄糖琼脂 培养基平板在20～25℃培养5 ~7天， 观察菌落 生长情况,点计平板上生长的所有菌落数，必要时 可适当延长培养时间至7 天进行菌落计数并报告 。菌落蔓延生长成片的平皿不宜计数。点计菌落 数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌 数报告规则报告菌数。 – 若同稀释级两个平皿的菌落数平均值不小于15， 则两个平皿的菌落数不能相差1 倍或以上。
2010年版《药典》微生物限度标准
《中国药典》2010年版二部附录XI J （附录115页）《微生物限度检查法》微生物限度标准非无菌药品的微生物限度标准是基于药品的给药途径及对患者健康潜在的危害而制订的。
药品的生产、贮存、销售过程中的检验，原料及辅料的检验，新药标准制订，进口药品标准复核，考察药品质量及仲裁等，除另有规定外，其微生物限度均以本标准为依据。
1.制剂通则、品种项下要求无菌的制剂及标示无菌的制剂应符合无菌检查法规定。
2.口服给药制剂细菌数每1g不得过l000CFU 。
每lml 不得过100CFU 。
霉菌和酵母菌数每lg或lml 不得过100CFU 。
大肠埃希菌每1g 或lml不得检出.3 ．局部给药制剂3.1用于手术、烧伤及严重创伤的局部给药制剂应符合无菌检查法规定。
3.2 耳、鼻及呼吸道吸入给药制剂细菌数每1g、lml 或l0cm2，不得过100CPU 。
霉菌和酵母菌数每1g、lml 或l0cm2，不得过10CPU 。
金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌每1g、lml 或l0cm2不得检出。
大肠埃希菌鼻及呼吸道给药的制剂，每1g、lml 或l0cm2，不得检出。
3.3 阴道、尿道给药制剂细菌数每1g、lml 或l0cm2，不得过100CFU 。
霉菌数和酵母菌数每1g、lml 或l0cm2应小于10CFU 。
金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌每1g、lml 或l0cm2，不得检出。
3 .4 直肠给药制剂细菌数每1g不得过l000CFU。
每lml 不得过100CFU 。
霉菌和酵母菌数每1g 或lml 不得过100CFU 。
金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌每lg 或lml 不得检出。
3.5 其他局部给药制剂细菌数每1g、lml 或l0cm2不得过100CFU 。
霉菌和酵母菌数每1g、lml 或l0cm2不得过100CFU 。
金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌每1g、lml 或l0cm2不得检出。
4.含动物组织（包括提取物）的口服给药制剂每10g 或10ml 还不得检出沙门菌。
3、(孙老师)1107 非无菌药品微生物限度标准解析
2、标准执行的注意事项
哪些需要做微生物限度检查 –正文项下【微生物限度】有要求 –制剂通则项下该品种对【微生物限度】有要 求 –“微生物限度检查法”标准规定
新药的微生物限度标准 基于数据分析和风险评估 原辅料、给药途径及对患者的潜在危害综合考虑控制 菌标准 -产品特性：是否适合微生物生长？是否有抑菌力 -用药对象：婴儿、体弱者、病患
原辅料、中药提取物、中药饮片 -参考制剂要求、生产工艺特点设置控制菌要求
４、标准限度放宽了？ –标准限度放宽，但是培养基的营养能力增加
1107 非无菌药品微生物限度标准 解析
四川省食品药品检验检测院 孙雪奇 2016年6月
内
容
• 一、标准概况 • 二、修订依据 • 三、微生物限度标准 • 四、国外药典标准收载情况
一、标准概况
方 法 标 准
1995年Chp附录收载 微生物限度检查法
1986版《药品卫生标准》及 1989版《药品卫生补充规定》 2000版Chp收载限度标准 （按剂型划分限度标准，按 给药途径及制剂特点制定控 制菌标准。）
TSA 营养 琼脂
11600
90
4500
110
<10
5600
<10
110
10
<10
例：金葡计数比较 以同一金黄色葡萄球菌菌悬液分别在营养琼脂和 TSA上计数。
培养基 样品（cfu/ml）
TSA 营养 琼脂
127
121
103
101
四、国外药典标准收载情况
2015年版中国药典微生物限度检查法
1.1 总则：
• 环境： – 微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要 求。(在不低于GMP 现行版要求的D 级洁净环境 、局部洁净度不低于B 级的单向流空气区域内进 行)【10版：在环境洁净度10000级下的局部洁净 度100级的单向流空气区域内】。 – 检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染 ，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检 出。 – 单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监 测。
菌数报告规则
– 需氧菌总数测定宜选取平均菌落数小于 300cfu 的稀释级、霉菌和酵母菌总数测定宜 选取平均菌落数小于100cfu 的稀释级，作为 菌数报告（取两位有效数字）的依据。取最 高的平均菌落数，计算1g、1ml 或10 cm² 供 试品中所含的微生物数。 – 如各稀释级的平皿均无菌落生长，或仅最低 稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小 于1 时，以﹤1 乘以最低稀释倍数的值报告菌 数。
1.4.2供试品检查
• 供试液制备 – ⑴ 水溶性供试品
• 取供试品，用 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨 缓冲液，或pH7.2 磷酸盐缓冲液，或胰酪 大豆胨液体培养基溶解或稀释制成 1:10 供试液。若需要，调节供试液 pH 值至 6 ～8。必要时，用同一稀释液将供试液进 一步 10倍系列稀释。水溶性液体制剂也 可用混合的供试品原液作为供试液。
1.3.1菌液制备及使用
试验菌株 试验菌液的制备
金黄色葡萄球菌 〔CMCC(B) 26 003)〕
铜绿假单胞菌 〔CMCC（B)10 104〕 枯草芽孢杆菌 〔CMCC(B) 63 501〕 白色念珠菌 〔CMCC(F) 98 001〕
胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培 养基 【10版：营养肉汤或营养琼脂培养基】 30～35℃，18～24小时
2020版中国药典】通则-非无菌微生物限度检查
2020版中国药典】通则-非无菌微生物限度检查本文介绍了非无菌产品微生物限度检查中的微生物计数法。
该方法适用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。
在检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合规定的微生物限度标准时，应严格遵守无菌操作，防止再污染。
计数方法的选择应考虑供试品理化特性和微生物限度标准等因素，并经过确认。
此外，商品化的预制培养基和由脱水培养基或按处方配制的培养基都应进行培养基适用性检查。
在供试液制备过程中，应根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液，并在加温时均匀加热，且温度不应超过45°C。
供试液从制备至加人检验用培养基，不得超过1小时。
在进行多种品种计数方法的适用性试验时，需要注意时效问题。
在“供试液制备”这一节中，水溶性供试品、水不溶性非油脂供试品、油脂类供试品的制备方法没有变化。
在2020版药典中，将原来的“需用特殊方法制备供试液的供试品”中的小类（四种）提升至与上述三类并列，除气雾剂供试品外，制备方法没有变化。
具体是膜剂供试品、肠溶及结肠溶制剂供试品、气雾剂供试品（2015版：气雾剂、喷雾剂供试品）、贴剂、贴膏剂供试品（2015版：贴膏剂供试品）。
需要注意的是，气雾剂供试品的变化较大，需要特别注意。
在进行供试液接种后的抗菌活性去除或灭活时，可以使用中和剂或灭活剂（表2)来消除干扰物的抑菌活性。
最好在稀释液或培养基灭菌前加入。
如果使用中和剂或灭活剂，试验中应设中和剂或灭活剂对照组，即取相应量含中和剂或灭活剂的稀释液替代供试品同试验组操作。
需要注意的是，在方法学中，这个对照组的稀释液中显然要含有相应的中和剂或者灭活剂，进一步明确，以防止错误套用。
在供试品中微生物的回收中，涂布法中“取15~20ml”修订为“取适量（通常为15~20ml）”。
在薄膜过滤法中，所采用的滤膜孔径应不大于0.45μm，直径一般为50mm。
如果采用其他直径的滤膜，冲洗量应进行相应的调整。
非无菌药品的微生物限度检查概述
中 图分 类 号 ：Ｒ１ｌ７
文 献 标 识 码 ：Ａ
ＤＯＩ：１０．１９６１３／ｊ．ｃｎｋｉ．１６７１ ３１４１．２０１８．０２．０１９
本 文 引用 格 式 ：柳莹 ，相坤 ．非无菌药品的微生物限度检查概述 ［Ｊ］．世界最新医学信息文摘 。２０１８，１８（０２）：３４—３５．
批 号 、储存条件 、制备 日期 、有效期 限及制 备人 。
１ 定 义
用于试验的每台仪器 、设备应该有 唯一标识 。
微 生物 限度检 查法 是针对 非规 定灭 菌制 剂及其 原料 、辅 ２－３ 人员 。药 品微生物试验工作的人员在上 岗前应接受相应 的
料 受微 生物污染程度检查 的方 法 ，检查项 目包括需 氧菌总数 、 培训 ，其 中包括 专业 知识 的培训 以及 岗位职责 ，并确保 每一 位
微生物实验室 由相应的洁净 区域和活菌操作 区域组成 ，为
所有人员 的培训 、考核 内容和结果均应记录归档。
避 免实验人员 和实验环境被有危 害性 的生物因子危害 ，应在活 ２．４ 培养 基制备及贮藏 。 （１）尽量 临用现配 ，培养 基的分装
菌操作区配备生物安全柜 。
量 不得超过容器 的 ２／３，以免 灭菌时溢 出。包装 时 ，塞子必须
药品微生物检验 的实验室应设立独立 洁净 室 （区 ）或隔离 塞紧 ，以免松动或 脱落造成 染菌 。 （２）分装 好的培养 基必须
系统 ，相应 的阳性菌实验室 、培养 室 、试验结果观察 区、培养 在不超过 ２ｈ内用验证过 的灭菌程 序灭 菌处理 ，只能进行一次
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药品微生物限度标准
王知坚
•我国药品微生物限度标准的历史沿革•药品微生物限度检查在制剂通则中的修订内容
•药品微生物限度标准的修订内容
•限度标准的注意事项
•国外药典微生物限度标准的收载情况
历史沿革
•检查法的历史沿革
–国务院1973年121号文件标志着我国药品微生
物限度检查工作正式启动
–在1974年颁布了74版《卫生部药品卫生学检查法》，是首次颁布与药品微生物限度检查有关
的检查方法
–先后于84年和90年两次修订，颁布新的检查法–1995年版《中国药典》首次在附录中收载微生物限度检查法
–2000年版、2005年版和2010年版《中国药
典》先后收载该检查法，并进行了不同程度的
修订和完善
•限度标准的变迁
–1986年版《卫生部部颁药品微生物限度标准》•国内首次颁布与药品微生物质量有关的限度标准
•限度标准的分类依据为剂型，不同剂型制订不同的
限度标准值；控制菌检查的分类依据为给药途径，
不同途径的制剂有不同的检查内容
–1989年版《卫生部部颁药品卫生补充规定》•是对86版限度标准的修订和补充
•分类方式上与86版相同
–《中国药典》2000年版
•首次将微生物限度标准收载入国家药典
•在编制体例上仍延用部颁标准的做法，按剂型制订限度标准，按给药途径和剂型特点制订控制菌标准–《中国药典》2005年版
•首次确定按给药途径来制订不同产品的限度标准和控制菌标准
•首次在制剂通则中对某一类制剂制订较为特殊的微生物控制要求，如眼用液体制剂需要达到近似无菌的要求
•在标准的具体规定上，体现了当时对微生物质量的研究水平，如含生药原粉的制剂要求开展大肠菌群检查，用于深部组织的制剂要求不得检出梭菌。
–《中国药典》2010年版
•对眼用制剂等特殊要求的制剂，在2005年版的基础上，进一步要求必须达到无菌的要求
•在制剂通则中，对贴膏剂增加了控制菌检查的要求•对阴道、尿道用药新增了不得检出白色念珠菌的要
求
制剂通则中的修订内容
•制剂通则的整合
–要求相同的予以合并，有特殊要求的并列规定如：按照一部、二部和三部制剂通则中对片剂微
生物限度检查的要求，整合后的规定是
【微生物限度】化学药品的口腔贴片、阴道片、阴道泡腾片和外用可溶片等局部用片剂，以及
中药和生物制品的片剂照微生物限度检查法
（附录XI J）检查，应符合规定。
凡规定进行
杂菌检查的片剂，可不进行微生物限度检查。
–眼用制剂以及需要达到无菌要求的其他外用制剂如何实现药典的严格要求
•眼用制剂生产企业迟迟无法通过新版GMP认证
•其他外用制剂生产企业对该要求有不同的看法和意见，无菌要求的实现有相当大的阻力
•对策
–标准方面
•拟按更为严格的要求，来统一各部药典的不同规定如：鼻用制剂整合后拟采用以下规定
【无菌】用于手术或创伤的鼻用制剂，照无菌检查法（附录XI H）检查，应符合规定。
•不同剂型之间规定的不统一，目前拟仍保持原状，即整合的工
作只涉及形式，不考虑内容
•在需要达到无菌要求的制剂中，拟增加“除另有规定外”的描
述，允许基于风险来评价特定产品是否需要达到无菌的要求
–执行方面
•明确规定眼用制剂必须达到无菌的要求，并允许延迟新版GMP 的认证时间直至2015年12月31日
•对其他外用制剂是否需要严格执行无菌要求，拟召开专题研讨会来讨论确定
药品微生物限度标准的修订内容
•限度标准的分类体系•各类产品的具体规定•限度标准的解释
•限度标准的分类体系
–一部、二部两个标准，部分内容重复
–二部将限度标准分成6个部分
•制剂通则、品种项下要求无菌的制剂及标示无菌的
制剂和原辅料
•用于手术、烧伤或严重创伤的局部给药制剂
•非无菌化学药品及生物制品制剂
–根据给药途径不同又分成11类
•非无菌的药用原料及辅料
•有兼用途径的制剂
•霉变、长螨者
–一部将限度标准分成8个部分
•制剂通则、品种项下要求无菌的制剂及标示无菌的制剂和原辅料
•用于手术、烧伤或严重创伤的局部给药制剂
•非无菌不含药材原粉的中药制剂
–根据给药途径不同又分成11类
•非无菌含药材原粉的中药制剂
•非无菌的药用原料及辅料
•中药提取物及中药饮片
•有兼用途径的制剂
•霉变、长螨者
–非无菌含药材原粉的中药制剂的分类原则•第一层次是给药途径，分成口服和局部给药两类
•第二层次是产品状态，分别在口服和局部给药两个
大类中又细分为固体和液体两类
•第三层次有两个不同的分类依据
–对于口服给药的产品，分类依据是是否含有豆豉、神曲等
发酵原粉
–对于局部给药的产品，分类依据是作用部位的表皮或黏膜
是否完整
•各类产品的具体规定
–一部、二部规定均相同的类别
•制剂通则、品种项下要求无菌的制剂及标示无菌的
制剂和原辅料应符合无菌检查法规定
•用于手术、烧伤或严重创伤的局部给药制剂
应符合无菌检查法规定
•有兼用途径的制剂应符合各给药途径的标准
•霉变、长螨者以不合格论
•限度标准的解释
–各品种项下规定的微生物限度标准解释如下：101cfu：可接受的最大菌数为20；
102cfu：可接受的最大菌数为200；
103cfu：可接受的最大菌数为2000：依此类
推。
–这种解释更符合微生物定量分析的特点，由于微生物个体在供试液中存在分布不均匀的情
况，在取样时这种不均匀的特性会导致取样误差较大，从而影响定量分析的准确度和精密
度。
从方法适用性检查的判定依据来看，上限就是200%，因此，自然就会有这样的解释。
限度标准的注意事项
•使用该限度标准的时机
–药品生产、贮存、销售过程中的检验
–药用原料、辅料及中药提取物的检验
–新药标准制订
–进口药品标准复核
–考察药品质量及仲裁等
除另有规定外，其微生物限度均以本标准为依据。
•限度标准的执行顺序–产品标准的各论规定
–制剂通则的一般规定
–本附录收载的通用规定
•局部给药制剂的无菌要求
–用于手术、烧伤及严重创伤的局部给药制剂
–对用于创伤程度难以判断的局部给药制剂，若没有证据证明药品不存在安全性风险，那么该药品应符合无菌检查法要求
•需检查沙门菌的产品范围扩大
–对于不含药材原粉的制剂，需要判断处方中是否含有脏器提取物，如含有，则需要检查沙门菌
–对于含药材原粉的制剂，只要是口服给药，则不论是否含动物类原粉，都需要检查沙门菌
–中药饮片也需要检查沙门菌
•耐胆盐革兰阴性菌
–用于替代原标准中的大肠菌群，但涉及的外延更大
–对于含药材原粉的制剂，只要是口服给药，都需要检查耐胆盐革兰阴性菌
–对于不含药材原粉的制剂，只要是呼吸道吸入给药，也需要检查耐胆盐革兰阴性菌
–中药饮片也需要检查
•微生物限度标准的各论化
–定量标准的建立
•应结合产品的给药途径，用法用量，稳定性等特
点，有针对性地制订个性化的定量标准
•如：以最小包装单位来评价、以更大质量或体积来
评价、生化药的特殊标准等
–其他具有潜在危害的微生物
•应结合原辅料、制剂工艺等特点，来确定是否需要
控制
•如：口服制剂中控制金黄色葡萄球菌、志贺氏菌等
•检出其他致病菌的风险评估原则
–药品的给药途径：给药途径不同，其危害不同（眼、鼻或呼吸道给药）；
–药品的特性：药品是否促进微生物生长，或者药品是否有足够的抑制微生物生长能力；
–药品的使用方法；
–用药对象：用药对象不同，如新生儿、婴幼儿及体弱者，风险可能不同；
–患者使用免疫抑制剂和甾体类固醇激素等药品的情况；
–存在疾病、伤残和器官损伤的情况
国外药典微生物限度标准的收载情况
•USP的收载情况
–在附录<1111>中收载了非无菌药品及药用辅料的微生物检查可接受的标准
–USP36、USP35和USP34没有发生变化
–以给药途径分类来制订限度标准
–与EP7.0的标准基本一致
–与EP不同，没有收载含药材原粉的口服原料
药，也没有收载草药
•EP 的收载情况
–在附录5.1.4中收载非无菌药品及药用辅料的微生物质量
–以给药途径分类来制订限度标准
–与USP略有不同
•在非无菌制剂微生物质量可接受的标准表格中增列
了一项对于含药材原粉制剂的特殊规定
•对草药进行了分类，并规定了不同用途草药的可接
受标准
•JP 的收载情况
–JP XVI版已参考USP和EP对限度标准进行了较大的修订，基本一致
–增订了对限度标准的解释
–有草药及其制剂的微生物限度标准
与EP不同，将草药分成两类，即
第一类：通过沸水浴提取或者在使用前需要加入沸水
的原料药及辅料
第二类：不需要提取可直接使用的原料药及辅料（包
括原料粉末）。