药品微生物限度检查法 PPT课件

MUG阴性，靛基质 阳性
• MUG阴性，靛基质 阴性
MUG阳性，靛基质 阴性
•
↓
↓取胆盐乳糖培养液划线
•
报告
曙红亚甲蓝琼脂平板或麦康凯琼脂平板
•
↓36±1℃ 18~24h
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阳性
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阴性
•
↓
↓
• 镜检、适宜的生化试验
报告
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↓
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大肠埃希菌检验程序
•
供试品→ 供试液
• 检验量即一次试验所用的供试品量（g、ml或 cm2）
• 一般应随机抽取不少于检验用量（两个以上最小 包装单位）的3倍量供试品。
• 除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或 10ml；中药膜剂为50cm2
• 贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。
• 要求检查沙门菌的供试品其检验量应增加10g或 10ml
• 一个细菌、霉菌或酵母菌的菌落均可由一 个或多个菌细胞生长繁殖而成，因此供试 品中所测得的菌落数，实际为菌落形成单 位数（colony forming unity, cfu）
• ·供试品检验的全过程必须符合无菌技术 要求。
• 培养基、稀释剂、实验器具等的灭菌，按 灭菌法（见附录）的要求采用验证合格的 灭菌程序灭菌。
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操作要点
·菌落数在100以内时按实有数据报告。菌落数 大于100时，取两位有效数字报告，第三位按 数字修约规则处理。
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异常情况处理
• 菌落蔓延： 培养中由于一些菌落蔓延 生长而影响另一些菌落生长，甚至掩盖 了另一些菌落，干扰计数。
• 原因： 有动力和培养环境湿度过大造 成，给动力菌造成泳动的条件，促使形 成蔓延菌落机会增多。
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控制菌的检查
• 大肠埃希菌检验程序
•
供试品→ 供试液
↓ • 不少于100ml的 胆盐乳糖增菌液
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↓35~37℃ 18~24h
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取 0.2ml
↓
•
5mlMUG培养基中
↓35~37℃ 5、24h
•
366nm紫外光下观察
•
↓ 加靛基质试剂
•
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• MUG阳性，靛基质 阳性
操作要点
●每张滤膜取相当于1g或1ml供试品的供试液直接过滤或加至适量 稀释剂中混匀，过滤，用适宜的冲洗液冲洗滤膜，冲洗方法及 冲洗量同“计数方法的验证”，冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴 于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄 糖琼脂培养基平板上培养。每种培养基至少制备一张滤膜，滤 膜贴于平板上时不得有空隙或气泡，否则影响微生物生长。
• 较完善检查法：也是目前国际上常用 的一种方法。是以琼脂平板上的细菌、 霉菌或酵母菌形成的一个独立可见的 菌落为计数依据。该法测定结果只反 映在规定条件下所生长的细菌、霉菌 和酵母菌的菌落数。
• 增加试验的可操作性 • 使方法更具科学性，保证检验结果
的准确性。
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操作环境
• 检验全过程应严格遵守无菌操作，在环境洁 净度10000级和局部洁净度100级单向流空气 区域内进行，以防止再污染。单向流空气区 域、工作台面及环境应定期按中华人民共和 国国家标准GB/T 16292～16294-1996 《医药 工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降 菌的测试方法》进行洁净度验证。
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防止方法
• 加TTC：于倾注培养基前，在每1000ml营养 琼脂内加入灭菌1%TTC溶液1ml混匀后倾注 平皿。
• 开盖干燥：将已凝固的琼脂平板开盖，倒置 斜放于净化工作台上，开机1-2h后合盖，再 放培养箱中
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异常菌数报告
在特殊情况下，营养琼脂培养基上生长的霉菌、 酵母菌多于玫瑰红钠琼脂培养基上菌落数则 以营养琼脂平板的霉菌、酵母菌菌落数报告， 反之如玫瑰红钠琼脂平板生长了细菌，且多 于营养琼脂平板的菌落数，则以玫瑰红钠琼 脂平板的细菌数报告
药品微生物限度检查法
吉林省食品药品检验所
2008.3.29长春
微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原、 辅料受微生物污染程度的方法，也是评价生产企 业的药用原料、辅料、设备、器具、工艺流程、 环境和操作者卫生状况的重要手段和依据。检查 项目包括染菌量及控制菌检查。
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微生物限度检查法起草的指导思想
•↓
↓取胆盐乳糖培养液划线
报告
曙红亚甲蓝琼脂平板或麦康凯琼脂平板
•
↓36±1℃ 18~24h
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阳性
•
阴性
•
↓
↓
• 镜检、适宜的生化试验
报告
•
↓
•
报告
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注意事项
• 配制MUG培养基时，务必校正pH值 ，灭菌后pH不得 过7.4否则pH值偏高，MUG分解本身则显荧光。
加热溶化 • 注皿时培养基应在45±1℃，高于45℃时易造成细菌受损或致死，
低于45℃时易凝固，影响混匀，因此使用前可用水浴保温效果较 好。 • 倾注培养基于平皿中与样品摇匀时，切勿溅到皿盖边和皿盖上， 以免影响实验结果。
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操作要点
采用薄膜过滤法时，水溶性供试液过滤前先将
少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，
• 十四烷酸异丙酯的灭菌方法：采用薄膜 过滤法除菌，选用孔径为0.22um的脂溶 性滤膜，在140℃干热灭菌2小时。
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• 特殊供试液制备方法
• 非水溶性膜剂供试品 取50cm2,剪碎， 加适量的稀释剂（通常为每1ml或每 2ml含1cm2）,浸泡，振摇，以供试品 浸液作为1:10或1:20供试品。
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操作要点
• 作供试品稀释时，每一稀释级都要更换吸管。 • ·细菌培养48h，真菌培养72h，计数。如菌落极小，不
易辨认可适当延长培养时间。再点计菌落数。 • 含蜂蜜、王浆的液体制剂，用玫瑰红钠琼脂培养基测定
霉菌数，用酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基测定酵菌数， 并且合并计数。 • 若同一稀释级两个平板的菌落平均数不小于15，则两个 平板的菌落数不能相差1 倍或以上。 • 使用灭菌吸管时，管尖不要接触可能污染的任何容器或 用具。 • 供试液稀释及注皿时应振摇后取均匀的供试液，以免造 成实验误差。
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特殊供试液制备方法
• 肠溶及结肠溶制剂供试品 • 取供试品10g，加至100ml pH6.8磷酸
盐缓冲液（肠溶制剂）中或pH7.6磷 酸盐缓冲液（结肠制剂），置45℃水 浴中，振摇，使溶解，作为1:10的供 试液。
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特殊供试液制备方法
• 具抑菌活性的供试品
– 当仅有１个稀释级的菌落数符合上述规定， 以该级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报 告菌数。
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菌数报告规则
当同时有2个稀释级的菌落数符合上述规定时，视两者比 值（比值为高稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值除以 低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值 ）而定。若比 值不大于2，以两稀释级的菌落数乘以稀释倍数的均 值报告菌数；若比值大于2但不超过5时，以低稀释级 的菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。当出现比值大 于5或高稀释级的菌落数大于或等于低稀释级的菌落 数等异常情况时，应查明原因再行检查，必要时，应 进行方法的重新验证。
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洁净级别
洁净级别
尘粒数/m3
浮游菌
个/m2
微粒直径 微粒直径
≥0.5um ≥5um
100
≤3,500
≤0
≤5
沉降菌 个/0.5h
≤1
10000 ≤350,000 ≤2000 ≤100 ≤3
100000
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≤3,500,000 ≤20,000 ≤500
≤10
5
检验量
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大肠菌群
大肠菌群作为水质粪便污染的指示菌已有80多年历史。大肠菌群的定 义：是指37℃生长时能发酵乳糖，在24h内产酸产气的革兰阴性无 芽孢杆菌，符合上述定义的细菌除大肠埃希氏杆菌属外，还包括肠 杆菌科的肠杆菌属、枸椽酸菌属、克雷伯菌属等，实际上基本包括 人和了正常家畜肠道内的全部需氧的革兰阴性杆菌，较大肠埃希菌 更具代表性，且存活时间较长。故检出大肠埃希菌，一般认为药品 受粪便的近期污染；而检出大肠菌群，则表示药品受粪便的近期或 远期污染。以大肠菌群作为口服药品微生物限度标准的控制菌，具 有广泛的卫生学意义，更能反映药品的卫生质量。
• 当供试品有抑菌活性时，应消除其抑菌活 性后，再依法检查。
• 常用的方法有： 培养基稀释法
离心沉淀集菌法 3000转/分离心20分钟，
500转/分离心5分
薄膜过滤法
中和法
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菌数报告规则
• 细菌数 酵母菌平均菌落数在30-300， 霉菌平均菌落数在30-100 之间的稀释级 作为菌数报告的依据。
1：10
不可计 不可计 不可计
39 24 0.5
1：102 1：103
164 20
295 46
271 60
41
4
19
0
比值
－ 1.6 2.2 10.2 － －
菌落数 报告
16400 37750 27100 异常
240 5
16000 38000 27000
240 ＜10
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操作要点
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注意事项
• 观察供试品MUG管时，可与阳性对照管、阴性对照 管同时在366nm紫外灯下观察。
• 在曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯琼脂平板上生长的可疑 菌落，务必挑选2-3个以上菌落分别做IMViC试验鉴 别。
• 在IMViC试验中，以灭菌接种环沾取菌苔，首先接 种于枸椽酸盐琼脂斜面上，然后再接种于蛋白胨水 等其它培养基上，切务将培养基带入枸椽酸盐琼脂 斜面上，以免产生假阳性结果。
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• 供试液的制备 根据供试品的理化特性与生物学特性， 采取适宜的方法制备供试液。供试液
制备若需用水浴加温时，温度不应超过 45℃。供试液从制备至加入检验用培 养基，不得超过1小时。
• 除另有规定外，常用的供试品制备方法 如下：
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特殊供试液制备方法
• 非水溶性供试品
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菌数报告规则
– 当各稀释级的平均菌落数均小于30， 以最低稀释级的平均菌落数乘以稀释 倍数的值报告菌数。
– 各稀释级的平板均无菌落生长，或仅 最低稀释级的平板有菌落生长，但平 均菌落数小于1时，以＜1乘以最低稀 释倍数的值报告菌数。
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菌数报告规则
各 各稀释级菌落平均数
其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。为发挥
滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液
及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过
滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每
次冲洗量为100ml，冲洗液、冲洗量及冲洗方法
同方法验证试验。每片滤膜的总过滤量不宜过
大，以避免滤膜上的微生物受损伤。
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• 取供试品5g(5ml)，加入司盘80 5g、单硬脂 酸甘油酯3g、聚山梨酯80 10g的无菌溶化 混合物（温度低于45℃）的烧杯中，用无 菌玻棒搅拌成团后，慢慢加入45℃左右的 稀释剂至100ml，边加边搅拌，使供试品充 分乳化，作为1:20供试液。
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特殊供试液制备方法
• 取供试品10g，加至含玻璃珠和20ml的 无菌十四烷酸异丙酯的容器中，充分振 摇，使供试品溶解，再加入约45℃的稀 释剂，振摇5-10分钟，萃取，待油水明 显分层，取其水层作为1:10供试液。
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操作要点
• 培养基的分装量不得超过容器的2/3以免灭菌时溢出。包装时，塞 子必须塞紧，以免松动或脱落造成染菌。
• ·培养基配制后应在2h内灭菌，避免细菌繁殖。 • ·灭菌后的培养基应保存在2-25℃ 防止被污染，可在三周内用毕。 • 已溶化的培养基应一次用完，一般开启后不宜再用，更不要反复
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↓ • 不少于100ml的 胆盐乳糖增菌液
•Fra Baidu bibliotek
↓35~37℃ 18~24h
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取 0.2ml
↓
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5mlMUG培养基中
↓35~37℃ 5、24h
•
366nm紫外光下观察
•
↓ 加靛基质试剂
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• MUG阳性，靛基质 阳性
MUG阴性，靛基质 阳性
• MUG阴性，靛基质 阴性
MUG阳性，靛基质 阴性
• 供试品培养液接种于MUG培养基中，培养时间一般在 4h、24h观察是否产生荧光，如荧光很微弱，不能准确 判断时，可延长培养时间至48h再观察结果。由于大肠 埃希菌各菌株间的GUD的活性不完全相同，对底物和 底物的浓度反应的差异；培养基中选择因子的影响； 培养时间、温度；pH的改变；大量竞争菌和样品本身 物质成分的干扰等，对结果的判断亦有影响。