病毒载体-2014-10
腺病毒载体的分类及包装方法
腺病毒载体的分类及包装方法1.腺病毒载体分类第一代腺病毒载体：指E1或E3基因缺失的腺病毒载体。
特点：(1)外源基因容量为6.5-8Kb；(2)适用于大多数基因治疗，且容易获得高滴度的病毒；(3)可用于表达重组蛋白质或将外源基因导入对其他转染方法不敏感的细胞株中；(4)若未经纯化使用，容易引发机体产生强烈的炎症反应和免疫反应，纯化后可安全使用。
第二代腺病毒载体：指E2A或E4基因缺失的腺病毒载体。
特点：(1)外源基因容量增加，可达14Kb；(2)病毒蛋白表达降低，引发机体的免疫反应比第一代弱；(3)外源基因表达时间较长；(4)病毒产量较低，且滴度降低。
第三代腺病毒载体：也称为空壳载体或辅助病毒载体，指全部或大部分腺病毒基因组缺失，仅可保留ITR和包装信号序列的腺病毒载体。
特点：(1)外源基因容量大幅度提高，可达37Kb；(2)无病毒蛋白表达，降低了机体的免疫反应，提高了安全性；(3)外源基因可长期稳定表达；(4)需要一个腺病毒突变体作为辅助病毒；(5)可反复应用，无需考虑机体的抗腺病毒中和抗体的影响。
2.腺病毒载体包装方法传统的双质粒共转染法将插入了外源基因的穿梭载体质粒与携带腺病毒基因组的质粒共转染293细胞，这两种质粒在293细胞内通过随机的同源重组（同源序列的DNA分子之间或者分子之内的重新组合），形成重组腺病毒载体基因组，并包装成病毒颗粒。
局限性：(1) 操作较复杂，因其易被亲代病毒污染，需经过多次纯化和鉴定；(2) 重组效率低，耗费时间较长。
注：此方法适用于临床。
(1)Ad-Easy法将克隆了外源基因的腺病毒穿梭质粒与携带腺病毒大部分基因组的质粒共转染RecA+细菌，在细菌RecA 重组酶的作用下，经抗性筛选获得重组腺病毒基因组质粒，将其酶切纯化后转染293细胞，包装成重组病毒颗粒。
特点：(1) 酶切和连接步骤少，操作简便；(2) 可选择的穿梭载体多；(3) 同源重组率达60%以上，效率相对较高；局限性：(1) 某些腺病毒基因容易发生突变；(2) 设备和技术要求较高。
基因治疗的三大类基因传递载体与基因传递效率评估
基因治疗的三大类基因传递载体与基因传递效率评估基因治疗是利用基因传递载体将修复或替代基因传递到患者的细胞中，以治疗遗传性疾病、癌症等难治性疾病的一种方法。
在基因治疗过程中，选择合适的基因传递载体和评估基因传递效率是非常重要的一步。
本文将介绍基因治疗中的三大类基因传递载体以及基因传递效率的评估方法。
第一类基因传递载体是病毒型载体。
病毒型载体可以将基因传递到目标细胞内，并整合到宿主基因组中，实现长期稳定的基因传递效果。
常用的病毒型载体包括腺病毒（Adenovirus）、逆转录病毒（Retrovirus）和腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）等。
这些病毒型载体具有高效率的基因传递能力，但也存在一些问题，比如免疫反应、随机插入等。
然而，病毒型载体在基因治疗中仍然是最常用的载体，因为它们可以针对不同类型的细胞和组织进行基因传递。
第二类基因传递载体是非病毒型载体。
非病毒型载体是指没有感染细胞的能力，通常可以通过物理或化学手段将基因传递到细胞中。
常见的非病毒型载体有质粒DNA、利用电穿孔或超声波破裂、脂质体等。
相比病毒型载体，非病毒型载体有许多优点，如安全性高、简易制备、规模化生产等。
然而，非病毒型载体的缺点是传递效率相对较低，对于某些细胞类型的基因传递效果较差。
第三类基因传递载体是基因编辑工具。
基因编辑工具一般用于精确修改基因，包括锌指核酸酶（Zinc Finger Nucleases，ZFNs）、类转录因子效应子（Transcription activator-like effector nucleases，TALENs）和CRISPR/Cas9等。
这些工具可以通过靶向特定的DNA序列来实现基因的精确修饰，比如基因敲除、插入和突变等。
基因编辑工具具有高效的基因传递能力和精确性，但也面临着安全性和伦理问题的挑战。
为了评估基因传递效率，科研人员通常会采用多种方法来确定基因传递的效果。
病毒载体的监测与控制在传染病预防中的应用
病毒载体的监测与控制在传染病预防中的应用近年来，随着全球化的加速发展和人口流动的增加，传染病的防控已成为全球关注的焦点。
病毒是一类常见的传染病致病因子，有效监测和控制病毒载体对于预防和控制传染病具有重要意义。
本文将探讨病毒载体的监测与控制在传染病预防中的应用。
一、病毒载体的监测1. 病毒载体的种类病毒载体是指能够携带病毒并在宿主中传播的生物体，常见的病毒载体包括昆虫、啮齿动物、家禽等。
监测病毒载体的种类有助于确定传染源和传播途径，从而采取相应的防控措施。
2. 采集监测方法常见的采集监测方法包括室内采集和野外监测。
室内采集通过对可能携带病毒的生物体进行实验室分析，如培养、PCR等，以确定是否携带病毒以及病毒的类型。
野外监测则通过采集病毒载体的样本，如昆虫的体液、粪便等，在实验室中进行病毒的鉴定和分析。
3. 分子检测技术的应用随着分子生物学技术的进步，分子检测技术在病毒载体的监测中得到广泛应用。
例如，PCR技术可以通过扩增病毒核酸的特定片段来检测病毒载体的感染情况，具有高灵敏度和高特异性。
二、病毒载体的控制1. 遗传改良病毒载体通过遗传改良病毒载体，可以降低其传播能力和致病性。
例如，利用基因工程技术对病毒载体进行改造，使其失去致病性或减弱传播能力，从而减少疫情的蔓延。
2. 昆虫控制昆虫作为常见的病毒载体，对其进行有效的控制可以降低传染病的风险。
采取物理方法（如网罩、灯光诱捕等）和化学方法（如喷洒杀虫剂）可以有效控制昆虫数量，减少病毒的传播途径。
3. 宿主管理宿主管理是预防和控制病毒载体的重要手段。
通过加强家禽、家畜等可能成为潜在病毒载体的动物的养殖管理，包括饲养环境的改良、疫苗接种等，可以有效减少病毒的感染和传播。
4. 公共卫生宣传公众健康教育是预防和控制传染病的重要措施。
通过向公众传递关于病毒载体监测与控制的知识，提高公众的健康意识和科学防护意识，可以减少潜在传染源和传播途径，从而有效控制传染病的发生。
病毒防护知识
一、什么是计算机病毒？
计算机病毒是一个程序，一段可执行码。就像生物病毒一样，计算机病毒有独 特的复制能力，可以很快地蔓延，又常常难以根除。它们能把自身附着在各种类型 的文件上。当文件被复制或从一个用户传送到另一个用户时，它们就随同文件一起 蔓延开来。 可以从不同角度给出计算机病毒的定义。一种定义是通过磁盘、磁带和网络等 作为媒介传播扩散,能“传染” 其他程序的程序。另一种是能够实现自身复制且借 助一定的载体存在的具有潜伏性、传染性和破坏性的程序。还有的定义是一种人为 制造的程序,它通过不同的途径潜伏或寄生在存储媒体（如磁盘、内存）或程序里。 当某种条件或时机成熟时,它会自生复制并传播,使计算机的资源受到不同程序的破 坏等等。这些说法在某种意义上借用了生物学病毒的概念,计算机病毒同生物病毒所 相似之处是能够侵入计算机系统和网络,危害正常工作的“病原体”。它能够对计算 机系统进行各种破坏,同时能够自我复制, 具有传染性。 所以, 计算机病毒就是能够通过某种途径潜伏在计算机存储介质（或程序）里, 当达到某种条件时即被激活的具有对计算机资源进行破坏作用的一组程序或指令集 合。
5 2014-来可以工作的通用软件突然不能工作或不能正常工作。字库或数据库无故 不能使用。 6、系统突然自行重新引导。 7、在没有安排向磁盘读写数据的情况下，磁盘的指示灯闪亮。多发生在病毒攻 击磁盘或文件（试图传染）的情况。 8、打印机或其他外部设备突然工作不正常，如打印机接而不通，可能发生2708 病毒入侵。 9、当用软盘引导系统时，结果却转成实际上由C盘启动，而软盘已经插好在A盘 驱动器上。这时可能A盘片已被Ctrl+Break病毒或者有相同特性的病毒感染，并已传 染给C盘。 10、磁盘坏区突然增多，卷标自行变化。 11、内存空间不应有的减少。 12、系统无故死锁。 13、硬盘（C盘）变成不能启动系统等等。
【江苏省自然科学基金】_病毒包装_期刊发文热词逐年推荐_20140817
推荐指数 4 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
2009年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
科研热词 腺病毒载体 酪氨酸磷酸化 转染 调节性t细胞 绿色荧光蛋白 细胞分化 端粒酶逆转录酶启动子 树突状细胞 慢病毒 心肌细胞 干细胞 小鼠 大鼠 基因表达 基因治疗 人β 2-肾上腺素能受体 rna干扰 rel-a psd-95 foxp3 ad easy腺病毒 4-1bbl
2011年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
2011年 科研热词 构建 转染 血管生成素1 血管形成 腺病毒载体 腺病毒表达载体 腺病毒 肺动脉高压 耐药 组织工程 病毒包装 慢病毒 基因载体 单核细胞趋化因子1 mcf-7细胞 hyb1基因 293t细胞 推荐指数 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
2013年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29
科研热词 推荐指数 慢病毒载体 3 rna干扰 2 靶标 1 雪旺细胞 1 重组腺病毒 1 酪氨酸激酶受体b 1 表达 1 腺病毒 1 脂肪酸结合蛋白3 1 肾肿瘤 1 羰基-氰-对-三氟甲氧基本腙 1 线粒体功能 1 神经干细胞 1 抗体 1 慢病毒高表达系统 1 慢性炎症疼痛 1 干扰 1 小鼠精母细胞系 1 增殖缺陷型腺病毒 1 基因转染细胞株 1 克隆 1 pias-ny基因 1 p19细胞 1 notch4 1 neuritin基因 1 mirna 1 lgr5 1 g250 1 cnksr2基因 1
病毒载体PPT课件
• 而且，这些新技术也带来新的问题，主要是由辅 助病毒污染及载体的不稳定性所引起。
• 构建载体的一个因素是需要维持载体的正常大小 才能完成有效地DNA的包装。这个问题可以通过 “填充”DNA来完成，尽管这些填充DNA片段的 性能可以影响转基因的表达。
• 已经明确E4基因的部分保留有利于宿主细胞战胜 T细胞免疫反应从而有利于病毒生存，因此改造载 体时可以保留部分E4基因。
• 外源基因的容量增加了：14kb • 外源基因的表达时间比第一代病毒载体有所延长，
但仍然不能长期持续表达。 • 宿主的免疫反应仍然是影响外源基因持久表达的
主要障碍，特别是在发生重复感染的时候这种作 用尤其明显。
32
第三代重组腺病毒载体
第三代腺病毒载体的构建是将病毒的其他基因全部或接 近全部删除。这就是所谓的“空肠病毒”载体，它仅保留了 ITR和包装信号序列，因此需要辅助病毒和适当的包装细胞 用于病毒的繁殖，病毒的获得需要仔细的纯化。
生化中学习过核苷酸密码子，AAA编码 赖氨酸
AAA
lysine
7
1972年Berg等在一系列的研究中发展了第一 种建立在SV40基础上的重组病毒载体，并将λ噬 菌体部分DNA片段和大肠杆菌半乳糖操纵子连接 到 SV40 DNA中。
1976年，带有λ噬菌体DNA的重组SV40载体 在猴肾体用于基因治疗有以下优点： • 转移效率较高 • 在转化的细胞中将外源基因整合到染色体上或作
为染色体外的遗传物质进行表达，两种途径可供 选择 • 有可能将外源治疗基因置于病毒调节信号的控制 下进行表达 • 能够将外源基因作为病毒微染色体的一部分，并 能进行分离
13
病毒载体作为基因治疗的工具存在的问题： 尽管病毒载体介导的基因转移在临床上已经取
慢病毒载体包装构建过程
缓病毒载体包拆构修历程之阳早格格创做本理：缓病毒载体不妨将中源基果大概中源的shRNA灵验天调整到宿主染色体上，进而达到少期性表黑手段序列的效验.正在熏染本领圆里可灵验天熏染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、搞细胞等多种典型的细胞，进而达到良佳的的基果治疗效验.对付于一些较易转染的细胞，如本代细胞、搞细胞、没有瓦解的细胞等，使用缓病毒载体，能大大普及手段基果大概手段shRNA的转导效用，且手段基果大概手段shRNA调整到宿主细胞基果组的几率大大减少，不妨比较便当快速天真止手段基果大概手段shRNA的少暂、宁静表黑.观念：缓病毒载体是指以人类免疫缺陷病毒-1 (H IV-1) 根源的一种病毒载体，缓病毒载体包罗了包拆、转染、宁静调整所需要的遗传疑息，是缓病毒载体系统的主要组成部分.携戴有中源基果的缓病毒载体正在缓病毒包拆量粒、细胞系的辅帮下，通过病毒包拆成为有熏染力的病毒颗粒，通过熏染细胞大概活体构造，真止中源基果正在细胞大概活体构造中表黑.辅帮身分：缓病毒载体辅帮身分包罗：缓病毒包拆量粒战可爆收病毒颗粒的细胞系.缓病毒载体包罗了包拆、转染、宁静调整所需要的遗传疑息.缓病毒包拆量粒可提供所有的转录并包拆RNA 到沉组的假病毒载体所需要的所有辅帮蛋黑.为爆收下滴度的病毒颗粒，需要利用表黑载体战包拆量粒共时共转染细胞，正在细胞中举止病毒的包拆，包拆佳的假病毒颗粒分泌到细胞中的培植基中，离心博得上浑液后，不妨曲交用于宿主细胞的熏染，手段基果加进到宿主细胞之后，通过反转录，调整到基果组，进而下火仄的表黑效力分子.基根源基本理：缓病毒载体系统由二部分组成，即包拆身分战载体身分.包拆身分：由HIV-1基果组去除了包拆、顺转录战调整所需的顺式效用序列而构修，不妨反式提供爆收病毒颗粒所必须的蛋黑.包拆身分常常被合并构修到二个量粒上，一个量粒表黑Gag战Pol蛋黑，另一个量粒表黑Env蛋黑，其手段也是落矮回复成家死型病毒的大概.将包拆身分与载体身分的3个量粒共转染细胞(如人肾293T细胞)，即可正在细胞上浑中支获惟有一次性熏染本领而无复造本领的、携戴手段基果的HIV-1载体颗粒.载体身分：与包拆身分互补，即含有包拆、顺转录战调整所需的HIV顺式效用序列，共时具备同源开用子统造下的多克隆位面及正在此位面拔出的手段基果.为落矮二种身分共源沉组回复成家死型病毒的大概，需尽管缩小二者的共源性，如将包拆身分上5′LTR换成巨细胞病毒(CMV)坐时早期开用子、3′LTR换成SV40 polyA等.一、真验过程（1战2为并列步调）安排上下游特同性扩删引物，共时引进酶切位面，PCR(采与下保真KOD酶，3K内突变率为0%)从模板中（CDNA 量粒大概者文库）调与手段基果CDS区（coding sequence）连进T载体.将CDS区从T载体上切下，拆进缓病毒过表黑量粒载体.合成siRNA对付应的DNA颈环结构，退火后连进缓病毒搞扰量粒载体3. 缓病毒载体的包拆与浓缩杂化造备缓病毒脱梭量粒及其辅帮包拆本件载体量粒，三种量粒载体分别举止下杂度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 调换为真足培植基，培植24战48h后，分别支集富含缓病毒颗粒的细胞上浑液，病毒上浑液通过超离心浓缩病毒.二、真验资料2.1缓病毒载体、包拆细胞战菌株该病毒包拆系统为三量粒系统，组成为pspax2, pMD2G,pLVX-IRES-ZsGreen1/pLVX-shRNA2.其中量粒上的ZsGreen1表黑框能表黑绿色荧光蛋黑（GFP）.载体疑息1)缓病毒克隆载体图谱如下：2）包拆量粒疑息如下：PMD2G载体图谱战序列疑息PSPAX2载体图谱战序列疑息：细胞株293T，缓病毒的包拆细胞，为揭壁依好型成上皮样细胞，死少培植基为DMEM(含10% FBS).揭壁细胞经培植死少删殖产死单层细胞. 菌株大肠杆菌菌株DH5α.用于扩删缓病毒载体战辅帮包拆载体量粒.三、过程图。
丙型肝炎的病毒载体和病毒抗原
丙型肝炎的病毒载体和病毒抗原丙型肝炎是由丙型肝炎病毒（HCV）引起的一种传染病，它主要通过血液传播。
丙型肝炎病毒是一种正链RNA病毒，属于强大的病原体。
在丙型肝炎的研究中，病毒载体和病毒抗原是两个重要的概念。
病毒载体是指一种能够携带病毒并在宿主细胞内复制的生物体。
在丙型肝炎中，人类是主要的病毒载体。
丙型肝炎病毒通过血液传播，进入人体后主要感染肝脏细胞。
病毒在肝脏细胞内复制，释放新的病毒颗粒，从而导致肝脏炎症和损伤。
除了人类，丙型肝炎病毒还可以感染灵长类动物，如黑猩猩和猕猴等。
病毒抗原是指病毒颗粒或感染细胞所表达的蛋白质分子，它们可以被宿主免疫系统识别并引发免疫应答。
在丙型肝炎中，病毒抗原主要包括结构蛋白和非结构蛋白。
结构蛋白包括核心蛋白（C）、膜蛋白（E1）和膜蛋白（E2）。
这些蛋白质分子构成了病毒颗粒的外壳，起到保护病毒RNA的作用。
非结构蛋白包括NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B等。
这些蛋白质参与了病毒的复制和感染过程。
病毒抗原在丙型肝炎的诊断和治疗中起着重要的作用。
通过检测病毒抗原，可以确定是否存在丙型肝炎病毒感染。
常用的病毒抗原检测方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）和荧光定量PCR等。
此外，病毒抗原还可以作为疫苗的目标，通过诱导免疫应答来预防丙型肝炎的发生。
除了病毒抗原，丙型肝炎的病毒载体也是研究的重点之一。
病毒载体在病毒学研究中被广泛应用，它可以用来表达病毒蛋白、研究病毒复制和感染机制。
目前，常用的病毒载体包括重组腺相关病毒（rAAV）、重组腺病毒（rAd）和重组冠状病毒（rCoV）等。
通过利用这些载体，研究人员可以模拟丙型肝炎病毒的感染过程，探索病毒与宿主细胞之间的相互作用。
总之，丙型肝炎的病毒载体和病毒抗原是研究该疾病的重要组成部分。
通过深入了解病毒载体和病毒抗原的特性，可以为丙型肝炎的诊断和治疗提供重要的理论依据。
同时，研究病毒载体和病毒抗原还有助于深入了解丙型肝炎病毒的生物学特性，为疫苗和抗病毒药物的开发提供新的思路和方法。
病毒载体
基因导入系统（gene delivery system）是基因治疗的核心技术，可分为病毒载体系统和非病毒载体系统。
本章主要论述用于人类基因治疗的病毒载体系统。
用于基因治疗的病毒载体应具备以下基本条件：1、携带外源基因并能包装成病毒颗粒；2、介导外源基因的转移和表达；3、对机体不致病。
然而，大多数野生型病毒对机体都具有致病性。
因此需要对其进行改造后才能用于人体。
原则上，各种类型的病毒都能被改造成病毒载体。
但是由于病毒的多样性及与机体复杂的依存关系，人们至今对许多病毒的生活周期、分子生物学、与疾病发生及发展的关系等的认识还很不全面,从而限制了许多病毒发展成为具有实用性的载体。
近20年来，只有少数几种病毒如反转录病毒（包括HIV病毒）、腺病毒、腺病毒伴随病毒、疱疹病毒（包括单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒）、甲病毒等被成功地改造成为基因转移载体并开展了不同程度的应用。
第一节病毒载体产生的原理病毒载体的产生建立在对病毒的生活周期和分子生物学认识的基础之上。
研究病毒载体首先要对病毒的基因组结构和功能有充分的了解，最好能获得病毒基因组全序列信息。
病毒基因组可分为编码区和非编码区。
编码区基因产生病毒的结构蛋白和非结构蛋白；根据其对病毒感染性复制的影响，又可分为必需基因和非必需基因。
非编码区中含有病毒进行复制和包装等功能所必需的顺式作用元件。
各种野生型病毒颗粒都具有一定的包装容量，即对所包装的病毒基因组的长度有一定的限制。
一般来说，病毒包装容量不超过自身基因组大小的105～110％。
基因重组技术的发展使病毒载体的产生成为可能。
最简单的做法是，将适当长度的外源DNA 插入病毒基因组的非必需区，包装成重组病毒颗粒。
比如，本实验室曾将4.5kb的lacZ基因表达盒（CMV-lacZ-polyA）插入HSV1病毒的UL44（糖蛋白C）基因的XbaI位点中，病毒基因组的其余部分不改变，构建成重组病毒HSV1-lacZ100（吴小兵等，1998）。
实验专栏丨你知道病毒载体系统该怎么选择吗？
实验专栏⼁你知道病毒载体系统该怎么选择吗？2017-07-24中洪博元医学实验帮对于⼀些较难转染的细胞，如原代细胞、⼲细胞、不分化的细胞等，使⽤慢病毒载体，能⼤⼤提⾼⽬的基因或⽬的shRNA的转导效率，且⽬的基因或⽬的shRNA整合到宿主细胞基因组的⼏率⼤⼤增加，能够⽐较⽅便快捷地实现⽬的基因或⽬的shRNA的长期、稳定表达。
⼀、⽬前存在许多病毒载体系统，包括：腺病毒、逆转病毒和慢病毒，那么每种病毒载体系统都应该针对哪种实验呢？各有什么特点呢？腺病毒针对⼤多数细胞有⼏乎100%的感染效率，包括分裂和不分裂细胞及原代细胞，不整合到宿主细胞。
但是构建和包装的操作相对复杂。
腺病毒表达系统：这是⼀种很常⽤的哺乳动物病毒表达系统；但与慢病毒不同的是，腺病毒基因组及其携带的外源基因不会整合⼊宿主细胞的基因组中，⽽是游离于宿主基因组外独⽴表达，因此可实现⽬的基因瞬时、⾼丰度的表达，同时还避免了因整合⽽引发的潜在的基因突变和随机效应，安全性和可控性⾼。
逆转录病毒对于⼤多数细胞的感染效率<30%。
⽽且依赖细胞的分裂。
操作⼈员需要注意的是逆转录病毒会整合到宿主细胞的基因组上，并且有引起基因突变、激活癌基因的风险。
与腺病毒不同的是，它的构建及包装要⽐后者简单很多。
逆转录病毒表达系统：逆转录病毒将⾃⾝基因组及其携带的外源基因随机、稳定地整合⼊宿主细胞基因组中，可实现⽬的基因稳定、长期的表达。
逆转录病毒表达系统根据不同的包装细胞系可分为单嗜性、双嗜性和泛嗜性，不同包装细胞产⽣的逆转录病毒能够特异性地感染某⼀个或某⼀类宿主细胞。
辉骏⽣物采⽤的病毒包装细胞系为plat E细胞系，该细胞系包含gag、pol和env基因，因此转染单⼀表达质粒就可以包装出逆转录病毒，但是该病毒具有很强的针对性，只适⽤于⼤⿏、⼩⿏细胞稳定株的建⽴。
慢病毒对于分裂细胞和⾮分裂细胞能够达到30%的感染效率。
和逆转录病毒⼀样存在整合到宿主细胞基因组上的风险，以致引起基因突变、致癌。
病毒载体的应用与检测
病毒载体的应用与检测关键词：细胞菌种保藏中心标准物质北京标准物质网随着病毒载体的发展，病毒载体的应用也越来越广泛，尤其在人类疾病的基因治疗中发挥着重要作用。
1.在肿瘤基因治疗中的应用根据肿瘤的类型和分布，可采用多种技术来抑制和消除肿瘤细胞。
复制缺陷型和条件复制型腺病毒载体已经应用于肿瘤的生物治疗，这主要是通过病毒载体将肿瘤抑制基因、免疫激活基因或凋亡基因导入靶细胞中来实现的。
例如腺病毒载体ONYX-015已经应用于多种肿瘤的治疗中，并已经用于Ⅰ期和Ⅱ期临床试验。
疱疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)基因缺失的病毒载体能够在动物肿瘤模型和肿瘤组织中抑制肿瘤的生长。
痘苗病毒载体可以传递很多的肿瘤特异性抗原，并诱导机体产生很强的针对该肿瘤抗原的细胞免疫。
慢病毒介导的RNA干扰、免疫基因的激活也应用于肿瘤的基因治疗中。
2.在疫苗中的应用腺病毒载体可以迅速刺激机体产生高水平的免疫反应，故常应用于HIVH5N1等病原体疫苗的研制中。
如腺病毒载体Ad5就应用于研制HIV疫苗。
美国Merck公司开发的HIV疫苗(MRK Ad5)即采用了Ad5腺病毒载体。
虽然Ad5疫苗最终失败，但是为后续的HIV疫苗研制积累了宝贵的经验。
现在又开发出了DNA-腺病毒联合免疫的方法，它将腺病毒载体与其他载体联合起来，以实现持久、有效的免疫保护。
将外源基因插入疱疹病毒的非必需基因的位置，构建出来的疱疹病毒载体可用于疫苗的研制。
HSV最早应用于构建乙肝(HBV)表面抗原的表达，并成功研制出HBV的疫苗。
3.在神经生物学中的应用疱疹病毒是一种嗜神经性病毒，它在感染外周神经后可逆行进入中枢神经系统，并可建立无细胞毒性的隐性潜伏感染，然后高效、长期地表达外源基因，而不影响神经细胞的功能，所以可利用疱疹病毒载体将外源基因导入中枢和外周神经系统柬治疗神经紊乱和神经疾病。
此外，慢病毒载体可以转染非分裂细胞并可以长期表达外源基因。
慢病毒载体也被用于神经疾病病理模型的建立，以及表达神经生长因子以促进神经损伤后的修复治疗等。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
Moloney murine leukaemia virus (Mo-MLV)
• amphotrophic virus • The essential regions include the 5' & 3' LTRs & the packaging sequence lying downstream of the 5' LTR. • Transgene expression can either be driven by the promoter/enhancer region in the 5' LTR, or by alternative viral (e.g. cytomegalovirus, Rous sarcoma virus) or cellular (e.g. beta actin, tyrosine) promoters
优点
• Broad range of infectivity and high titer • Infection does not require an actively dividing host cell • Expressed human proteins are properly folded and modified • Large insert size • AdEasy vector is non-insertional
• selectable markers, such as neomycin & beta galactosidase, can be included • The available carrying capacity for retroviral vectors is approximately 7.5 kb • Altering the env gene or its product has proved a successful means of manipulating the cell range
Cloning Gene of Interest Homologous Recombination in vivo in Bacteria Virus Production in AD-293 Cells
Recombinant Adenovirus Construction
Step 1:Cloning a Gene of Interest (GOI) into Shuttle Vectors: • Sub-cloning the GOI into the appropriate intermediary, shuttle vector. • Confirmation through restriction digestion. Step 2: Transfer the expression cassette into the Adenovirus Vector: • Transferring the entire expression cassette into the large, adenovirus genome vector. • Confirmation through restriction mapping.
将病毒cDNA经适当改造的载体： 5′LTR / 3′LTR 包装信号（ψ序列） Neo基因/ Ampr 酶切位点（多克隆位点）
包装细胞(packaging cell)
– 将缺失了包装信号及相关序列的缺陷型逆转录病毒导 入哺乳动物细胞，产生大量病毒包装蛋白。NIH/3T3， ψ—2，PA317，ψCRIP – 逆转录病毒载体导入包装细胞后，载体转录出病毒基 因组的部分序列、标记基因、外源基因，被包装成病 毒颗粒。 – 缺陷型的逆转录病毒颗粒 – 一过性感染 – 病毒滴度106CFU/ml以上
• produced at high titres (>1011/ml) • very efficient at transducing target cells in vitro & vivo • intravenous injection, 90% of the vector is degraded in the liver • the majority of problems for clinical trials will be degraded & presented to the immune system
定义 临床应用 基本过程 载体优化 常用载体
病毒载体
载体(vector)
• 是携带外源DNA 进入宿主细胞进行 扩增和表达的DNA,它们一般是通过 改造质粒、噬菌体或病毒等构建的。
载体应具备以下条件：
• １、 能在适当的宿主细胞中复制； • ２、 具有多种限制酶的单一切点（即所谓多克隆 位点）以便外源DNA 插入； • ３、 具有筛选标志以区别阳性与阴性重组分子； • ４、 载体分子较小，以便体外基因操作，同时载 体DNA 与宿主DNA 便于分离； • ５、 对于表达型载体还应具有与宿主细胞相适应 的启动子、增强子、加尾信号等基因表达元件。
Advantages
High Transduction Effciency Insert Size up to 8kB Integrates into host genome resulting in sustained expression of vector Extremely well studied system Vector proteins not expressed in host
interest on four types • retroviruses (lentiviruses) • adenoviruses • adeno-associated viruses • herpes simplex virus type
Retrovirus Vectors
• • • • a class of enveloped viruses ssRNA molecule as the genome,10kb integrates into the host genome three genes: gag (coding for core proteins), pol (coding for reverse transcriptase) & env (coding for the viral envelope protein) • long terminal repeats (LTRs) • packaging sequences
Disadvantages
Low Titers (106- 107) Integration is random In vivo delivery remains poor. Effective only when infecting helper cell lines
Adenovirus Vectors
Tet-Off and Tet-On Gene Expression Systems
原核生物体内的四环素阻碍蛋白(Tet repressor，Te纯疱疹病毒编码的VPl6 的酸性结构域) 两部分构成的融合蛋白(tTA或rtTA)可以受 四环素或者其衍生物的调节而发生构象变 化，从而改变与相应的DNA序列(四环素反 应元件， Tet-Response Element ，TRE) 的结合能力
Obstacles to systemic targeting
• The first: Reactions with the complement system and pre-existing antibodies • The next: the endothelial cell layer • Additional: the stroma and the basalmembrane-like structure to reach the tumor
逆转录病毒载体的特点
• 缺陷型的逆转录病毒感染细胞 • RNA进入靶细胞后，变成前病毒并整合到 宿主细胞的染色体上，可稳定表达 • 只能感染处于增殖期的细胞
安全性问题
• • • • • • 逆转录病毒感染的可能性 污染的可能性 逆转录病毒在靶细胞基因组上的整合 破坏细胞正常生长的必须基因/抑癌基因 LTR激活原癌基因 染色体重排激活原癌基因
TRE: Tet-Response Element. A regulatory sequence consisting of seven direct repeats of a 42-bp sequence that contains the tetO.
靶向性优化
Viruses as Vectors
• Tissue specific expression was by using cellular promoter/enhancers e.g. the myosin light chain 1 promoter • fibre coat protein in the adenovirus binding to MHC class I molecule • Increased expression of integrin, heparin sulphate receptors can increase viral uptake
柯萨奇腺病毒受体(coxsackie adenovirus receptor, CAR)
• • • •
The wild type approximately 35 kb up to 30 kb replaced with foreign DNA four early transcriptional units (E1, E2, E3 & E4) only the inverted terminal repeats (ITRs) & a packaging sequence around the transgene • all the necessary viral genes being provided in trans by a helper virus