SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质
06 生物化学实验--SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量
SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量【目的】1 ．掌握 SDS-PAGE 测定蛋白质分子量的操作方法。
2 ．熟悉 SDS-PAGE 测定蛋白质分子量的原理。
【原理】带电粒子在电场中向着与其自身电荷方向相反的电极移动，称为电泳。
不同蛋白质分子具有不同的大小、形状，在一定的 pH 环境中带有不同的电荷量，因而在一定的电场中所受的电场引力及介质对其的阻力不同，二者的作用结果使不同蛋白质分子在介质中以不同的速率移动，经过一定的时间后得以分离，这就是电泳分离蛋白质及核酸生物大分子的基本原理。
聚丙烯酰胺凝胶电泳就是以聚丙烯酰胺凝胶作为电泳介质的电泳。
在电泳时，蛋白质在介质中的移动速率与其分子的大小，形状和所带的电荷量有关，为了使其只与蛋白质分子的大小有关，从而利用蛋白质在介质中的迁移率来测定蛋白质的分子量，就需要消除蛋白质分子的形状和所带电荷量的不同对迁移率的影响或减小到可忽略不计的程度。
SDS 是十二烷基硫酸钠（ sAium dAecyl sulfate ）的简称，它是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与 SDS 的结合比为 1.4 g SDS/ 1 g 蛋白质），使各种蛋白质 -SDS 复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别，使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线，可求得未知物的分子量。
SDS 与蛋白质结合后引起蛋白质构象的改变。
SDS- 蛋白质复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形状的长椭园棒，不同蛋白质的 SDS 复合物的短轴长度都一样（约为 18? ，即 1.8 nm ），而长轴则随蛋白质分子量成正比的变化。
说明， SDS 和蛋白质的结合所形成的 SDS- 蛋白质复合物消除了由于天然蛋白质形状不同而对电泳迁移率的影响。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子质量解析
【实验步骤及操作方法】
1.安装垂直板电泳槽 将密封胶条放在平直玻璃板上，将凹形
玻璃板与 平直玻璃板重叠。 用手将两块玻璃板夹住，放入电泳槽内。 用蒸馏水检漏
2.电泳缓冲液（Tris-甘氨酸缓冲液，pH=8.3）：取 Tris6.0g，甘氨酸28.8g，SDS1.0g，用去离子水 溶解后定容至1L。
3.样品溶解液（用于溶解标准蛋白质及样品蛋白 质）：取SDS0.1g，巯基乙醇0.1mL，甘油 1.0mL，溴酚蓝28.8g，0.2mol/L磷酸缓冲液 0.5mL，加重蒸馏水至10mL。
【试剂配制】
4. 染 色 液 ： 0.25g 考 马 斯 亮 蓝 R-250 ， 加 入 454mL50%甲醇溶液和46mL冰乙酸。
5.脱色液：75mL冰乙酸，875mL水与50mL甲醇 6.10% 过 硫 酸 钠 、 10%SDS 、 1% 四 甲 基 乙 二 胺
（TEMED）
【实验材料及预处理】
蛋白质相对分子质量的测定 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法
【实验目的】
• 理解电泳法测定蛋白质分子量的原理。 • 掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法的基本操
作 • 学会绘制标准曲线。
【实验原理】
聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺（Acr）和N，N-甲叉双 丙烯酰胺（Bis）聚合而成，是一种具有交叉网状结构的 凝胶，可以产生分子筛效应，其孔径大小可以通过配置 药品的浓度来控制，常用作电泳的载体。
因此，我们可以测定标准蛋白质的迁移率，通过标 准蛋白质相对迁移率的对数对相对分子量作图，得到标 准曲线，根据标准曲线计算出未知蛋白质的相对分子质 量。
垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离蛋白质
垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离蛋白质一、试验目的了解并掌握垂直板凝胶电泳的使用方法。
二、实验原理聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳是以聚丙烯酰胺凝胶做支持物的一种区带电泳，由于此种凝胶具有分子筛的性质，所以本法对样品的分离作用，不仅决定于样品中各组分所带净电荷的多少，也与分子的大小有关。
其次，聚丙烯酰胺凝胶电泳还有一种独特的浓缩效应，即在电泳开始阶段，由于不连续pH 梯度的作用，将样品压缩成一条狭窄区带，从而提高了分离效果。
聚丙烯酰胺凝胶具有网状立体结构，很少带有离子的侧基，惰性好，电泳时，电渗作用小，几乎无吸附作用，对热稳定，呈透明状，易于观察结果。
聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂亚甲基双丙烯酰胺(简称Bis)在催化剂的作用下，聚合交联而成的含有酰胺基侧链的脂肪族大分子化合物。
三、仪器和试剂仪器电泳仪、垂直平板电泳槽、微量注射器、灯泡瓶、移液器、染色与脱色缸、量筒、滴管。
试剂1. 丙烯酰胺(单体，简称Acr)2. 1%琼脂3. N，N，N，，N，—四甲基乙二胺(TEMED)4. N，N，—亚甲基双丙烯酰胺(交联剂，简称Bis)5. 过硫酸铵(聚合时的催化剂)6. 试剂A(pH8.9)：36.6g 三羟甲基氨基甲烷(Tris)和48mL 1mol/l HC l 混合加水至100ml7. 试剂B(pH 6.7)：5.98g Tris 和48ml 1mol/lHCl 混合加水至100ml8. 电极缓冲液：6.0gTris 和28.8g 甘氨酸混合加水至1000ml，用时稀释10倍9. 0.05%溴酚蓝10. 20%甘油11. 7%醋酸12. 1mol/l HCl13. 蛋白样品：人或动物血清四、操作步骤1.垂直平板电泳槽的安装先把垂直平板电泳槽和两块玻璃板洗净，晾干。
通过硅胶带将两块玻璃板紧贴于电泳槽(玻璃板之间留有空隙)，两边用夹子夹住。
将1%琼脂糖融化，冷至50℃左右，用吸管吸取热的1%琼脂沿电泳槽的两边条内侧加入电泳槽的底槽中，封住缝隙，冷后琼脂凝固，待用。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量
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5.“SDS — 聚丙稀酰胺凝胶电 泳法测定蛋白质分子量”一实验的开 设达到了与国内同类院校相当的较高 水平。
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（二）特点：
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在 聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二 烷基磺酸钠）。
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蛋白质在一定浓度的含有强还原剂 的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合， 形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物。
蛋白质丧失了原有的电荷状态形成 仅保持原有分子大小为特征的负离子团 块，降低或消除了各种蛋白质分子之间 天然的电荷差异，因此在进行电泳时，
电泳分类：移动界面电泳、区带电泳等。
区带电泳 是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄 层样品溶液，然后加电场，分子在支持介质上或支 持介质中迁移。
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区带电泳使用不同的支持介质，有
滤纸、纤维素粉、聚氯乙烯树脂、淀 粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜， 现在则多用聚丙烯酰胺（PAGE）和 琼脂糖凝胶。
球蛋白（去年完成的基金项目）
（三）纯化免疫球蛋白G DEAE-离子交换纤维素法纯化免疫球蛋白G子量（ 连续四个单项实验）。
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（1）制胶（简单叙述）（双层胶，摸索胶浓度）
A.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干, 准备2个干 净的锥形瓶。把玻璃板在灌胶支架上固定好。
开封后溶于200µl蒸馏水，置-20℃保存，使用前室温融化，沸水浴中加热3-5分钟后上样。
。 样品1：称3mg样品1，加2 ml蒸馏水溶解
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE测定蛋白质分子量
02 实验材料
所需的试剂和溶液
丙烯酰胺（AA）：用于制备凝胶，是聚合反应 的单体。
甲叉双丙烯酰胺（MBA）：交联剂，增加凝胶 的交联度。
N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED）：催化剂， 加速交联聚合反应。
所需的试剂和溶液
过硫酸铵（APS）
引发剂，产生自由基，引发聚合反应。
SDS
十二烷基硫酸钠，用于变性蛋白质并促使其 带负电荷。
发展新型分离技术
随着生物技术的不断发展，可以发展新型的蛋白质分离技术， 如二维电泳、毛细管电泳等，以提高蛋白质分离的分辨率和准
确性。
应用多维度分析
在后续实验中，可以将SDS-PAGE与其他蛋白质分析技术相结 合，如质谱技术、免疫学检测等，进行多维度分析，更全面地
了解蛋白质的性质和功能。
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白质带负电荷，从而在电场中向正极移动。
聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质，能够根据蛋白质分子量的不同
03
对其进行分离。
蛋白质的分子量测定
通过比较标准蛋白的迁移率和已知分 子量的标准蛋白，可以大致测定出待 测蛋白质的分子量。
蛋白质的迁移率与其分子量的对数成 反比，因此可以通过计算待测蛋白与 标准蛋白的相对迁移率来推算其分子 量。
甘氨酸
作为分子量标准品。
Tris-HCl缓冲液
维持电泳过程中的pH值稳定。
所需的仪器和设备
电源
为电泳提供电力。
凝胶板
放置凝胶的框架。
垂直电泳槽
提供电泳所需的基 本结构。
移液器
精确添加试剂和溶 液。
紫外透射仪
检测蛋白质条带。
实验前的准备事项
清洗电泳槽和相关器具，确保无残留物。 准备好所需的试剂和溶液，并确保其在有效期内。
实验8 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量
实验8 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子量Mr原理蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳中, 蛋白质的迁移率取决于它所带净电荷及分子的大小和形状。
在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate,简称SDS）和还原剂（如巯基乙醇）处理蛋白质样品, 则蛋白质分子中的二硫键被还原, 1g蛋白质可定量结合1.4g SDS。
由于SDS呈解离状态, 使蛋白质亚基带上大量的负电荷, 其数值大大超过蛋白质分子原有的电荷量, 因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。
各种蛋白质-SDS复合物表现出相等的电荷密度, 在聚丙烯酰胺凝胶上电泳时, 它们纯粹按照分子的大小由凝胶的分子筛效应来进行分离, 有效迁移率与相对分子量的对数成很好的线性关系。
用这种方法测定蛋白质的Mr, 简便、快速, 只需要廉价的设备和μg量的蛋白质样品。
所得的结果, 在Mr为15000~200000的范围内, 与用其他方法测得的Mr相比, 误差一般在±10%以内。
因此SDS测定Mr的方法, 已得到非常广泛的应用和迅速的发展。
现在经SDS-聚丙烯酰胺凝胶研究过的蛋白质已经有很多种了。
实验证明, 在蛋白质溶液中加入SDS和巯基乙醇后, 巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键；SDS能使蛋白质的氢键、疏水键打开, 并结合到蛋白质分子上形成蛋白质-SDS复合物。
在一定的条件下, SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质。
由于十二烷基硫酸根带负电, 使各种蛋白质的SDS复合物都带上相同密度的负电荷, 它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量, 因而掩盖了不同种类的蛋白质间原有的电荷差别。
1.在用SDS-凝胶电泳法测定蛋白质的Mr时, 应注意以下几个问题:如果蛋白质-SDS复合物不能达到1.4gSDS/1g蛋白质的比率并具有相同的构象, 就不能得到准确的结果。
影响蛋白质和SDS结合的因素主要有以下3个: ⑴二硫键是否完全被还原: 只有在蛋白质分子内的二硫键被彻底还原的情况下, SDS才能定量地结合到蛋白质分子上去, 并使之具有相同的构象。
实验十 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质
实验十聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质【实验目的】1. 了解和掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的技术和原理；2. 掌握用此法分离蛋白质组分的操作方法。
【实验原理】在生物化学、分子生物学和基因（遗传）工程实验中，常常要进行蛋白质和核酸的分离工作。
聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel Electrophoresis, PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质进行蛋白质或核酸分离的一种电泳方法。
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（acrylamide，简称ACR）和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺（N,N-methylene bisacrylsmide 简称BIS）在催化剂的作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。
通过改变单体浓度与交联剂的比例，可以得到不同孔径的凝胶，用于分离分子量大小不同的物质。
聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：（1）化学聚合：催化剂采用过硫酸铵，加速剂为N,N,N,N－四甲基乙二胺（简称TEMED）。
通常控制这二种溶液的用量，使聚合在1小时内完成。
（2）光聚合：通常用核黄素为催化剂，通过控制光照时间、强度控制聚合时间，也可加入TEMED 加速反应。
聚丙烯酰胺凝电泳常分为二大类：第一类为连续的凝胶（仅有分离胶）电泳；第二类为不连续的凝胶（浓缩胶和分离胶）电泳。
一般地，不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳有三种效应：①电荷效应（电泳物所带电荷的差异性）；②凝胶的分子筛效应（凝胶的网状结构及电泳物的大小形状不同所致）。
③浓缩效应（浓缩胶与分离胶中聚丙烯酰胺的浓度及pH的不同，即不连续性所致）。
因此，样品分离效果好，分辨率高。
SDS即十二烷基硫酸钠（Sodium Dodecyl Sulfate，简称SDS）是阴离子表面活性剂，它能以一定比例和蛋白质结合，形成一种SDS-蛋白质复合物。
这时，蛋白质即带有大量的负电荷，并远远超过了其原来的电荷，从而使天然蛋白质分子间的电荷差别降低仍至消除。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳：莱姆利(emmli)于1970年创建的含十二烷基硫酸钠(SDS)的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质方法。
向样品加入还原剂(打开蛋白质的二硫键)和过量SDS，SDS是阴离子去垢剂，使蛋白质变性解聚，并与蛋白质结合成带强负电荷的复合物，掩盖了蛋白质之间原有电荷的差异，使各种蛋白质的电荷／质量比值都相同，因而在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时迁移率主要取决于蛋白质分子大小。
是分析蛋白质和多肽、测定其分子量等常用的方法。
可测定蛋白质分子量.其原理是带大量电荷的SDS结合到蛋白质分子上克服了蛋白质分子原有电荷的影响而得到恒定的荷/质比.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测蛋白质分子量已经比较成功,此法测定时间短,分辨率高,所需样品量极少(1～100μg),但只适用于球形或基本上呈球形的蛋白质,某些蛋白质不易与SDS结合如木瓜蛋白酶,核糖核酸酶等,此时测定结果就不准确.2、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）(1)定义丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：是以聚丙烯胺凝胶作为载体的一种区带电泳。
SDS-PAGE:是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）(2)SDS的作用SDS是一种阴离子去垢剂，可与蛋白质结合，形成SDS-蛋白质复合物。
于SDS带有大量负电荷，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖,即消除了蛋白质分子之间电荷差异。
此在电泳时，蛋白质分子的迁移速度则主要取决于蛋白质分子大小(3) SDS-PAGE分类：SDS-PAGE按照缓冲液pH值和凝胶孔径差异分为连续系统和不连续系统两大类：连续系统：电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。
不连续系统：缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度均不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳(4)聚丙烯胺凝胶的生成：聚丙烯胺凝胶由丙烯酰胺单体（Acr）和N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下聚合而成。
生物化学实验8聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳
图5 不连续系统浓缩效应示意图
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） ： 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，它的迁 移率取决于它所带净电荷以及分子的大小 和形状等因素。如果在丙烯酰胺凝胶系统 中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠 (sodium dodecyl sulfate, 简 称 SDS) ， 则 蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的 分子量，而与所带电荷和形状无关。因此 可以利用SDS-PAGE测定蛋白质分子量。
（1）样品浓缩效应 (a)凝胶孔径不连续性： (b)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性；
在pH6.7的凝胶缓冲体系中 前导离子或快离子：HC1解离出的氯根(C1-) 尾随离子(trailing ion)或慢离子：甘氨酸根
mclcl>mpp>mGG(Cl代表氯根，P代表蛋白质，G代表甘氨酸根) 有效迁移率=m，m为迁移率，为解离度)
聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：
(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好； (2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中
不溶； (3)对pH和温度变化较稳定； (4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，
则样品分离重复性好； (5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g (6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，
图1 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图
(A为正面,B为剖面)
(1)样品胶pH6.7
(2)浓缩胶pH6.7
(3)分离胶pH8.9 (4)电极缓冲液pH8.3
图2 夹心垂直板电泳槽示意图 图3 凝胶模示意图 1.样品槽模板 2.长玻璃板 1.导线接头 2.下贮槽 3.凹形橡胶框
4.样品槽模板 5.固定螺丝 6.上贮槽 7.冷凝系统
SDS-PAGE电泳实验步骤
垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质一、实验目得学习ＳDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳法(ＳDS—ＰAGＥ)测定蛋白质得分子量得原理与基本操作技术、二、实验原理蛋白质就是两性电解质,在一定得ｐH条件下解离而带电荷。
当溶液得pH大于蛋白质得等电点(pＩ)时,蛋白质本身带负电,在电场中将向正极移动;当溶液得pH小于蛋白质得等电点时,蛋白质带正电,在电场中将向负极移动;蛋白质在特定电场中移动得速度取决于其本身所带得净电荷得多少、蛋白质颗粒得大小与分子形状、电场强度等。
聚丙烯酰胺凝胶就是由一定量得丙烯酰胺与双丙烯酰胺聚合而成得三维网状孔结构、本实验采用不连续凝胶系统,调整双丙烯酰胺用量得多少,可制成不同孔径得两层凝胶;这样,当含有不同分子量得蛋白质溶液通过这两层凝胶时,受阻滞得程度不同而表现出不同得迁移率。
由于上层胶得孔径较大,不同大小得蛋白质分子在通过大孔胶时,受到得阻滞基本相同,因此以相同得速率移动;当进入小孔胶时,分子量大得蛋白质移动速度减慢,因而在两层凝胶得界面处,样品被压缩成很窄得区带。
这就就是常说得浓缩效应与分子筛效应。
同时,在制备上层胶(浓缩胶)与下层胶(分离胶)时,采用两种缓冲体系;上层胶ｐＨ=6、7—6。
8,下层胶pH=8.9;Tris—HCＩ缓冲液中得Triｓ用于维持溶液得电中性及pＨ,就是缓冲配对离子;ＣI－就是前导离子。
在pH6.８时,缓冲液中得Gly—为尾随离子,而在pH＝8、９时,Gly得解离度增加;这样浓缩胶与分离胶之间ｐH得不连续性,控制了慢离子得解离度,进而达到控制其有效迁移率之目得。
不同蛋白质具有不同得等电点,在进入分离胶后,各种蛋白质由于所带得静电荷不同,而有不同得迁移率、由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在得浓缩效应,分子筛效应及电荷效应,使不同得蛋白质在同一电场中达到有效得分离。
如果在聚丙烯酰胺凝胶中加入一定浓度得十二烷基硫酸钠(SDS),由于SDＳ带有大量得负电荷,且这种阴离子表面活性剂能使蛋白质变性,特别就是在强还原剂如巯基乙醇存在下,蛋白质分子内得二硫键被还原,肽链完全伸展,使蛋白质分子与SDS充分结合,形成带负电性得蛋白质—SDS复合物;此时,蛋白质分子上所带得负电荷量远远超过蛋白质分子原有得电荷量,掩盖了不同蛋白质间所带电荷上得差异、蛋白质分子量愈小,在电场中移动得愈快;反之,愈慢。
(完整版)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告
分子生物学实验报告实验名称：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳班级：生工xxx姓名：xxx同组人：xxx学号：xxxx日期：xxxxSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1 引言SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是目前分离蛋白质亚基并测定其分子量的常用方法，为检测电泳后凝胶中的蛋白质，一般使用考马斯亮蓝（CBB）染色[1]。
本次实验的目的在于学习聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理，并掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质的操作技术。
2 材料和方法2.1实验原理2.1.1 聚丙烯酰胺凝胶的性能及制备原理2.1.1.1 性能聚丙烯酰胺凝胶的机械性能好，有弹性，透明，相对地化学稳定，对pH和温度变化比较稳定，在很多溶剂中不溶，是非离子型的，没有吸附和电渗作用。
通过改变浓度和交联度，可以控制孔径在广泛的范围内变动，并且制备凝胶的重复性好。
由于纯度高和不溶性，因此还适于少量样品的制备，不致污染样品。
2.1.1.2 制备原理聚丙烯酰胺凝胶是用丙烯酰胺（Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂的作用下聚合而成。
聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化系统有化学聚合和光聚合两种。
本实验是用化学聚合。
化学聚合的催化剂通常多采用过硫酸铵（AP）或过硫酸钾，此外还需要一种脂肪族叔胺作加速剂，最有效的加速剂是N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（TEMED）。
在叔胺的催化下，由过硫酸铵形成氧的自由基，后者又使单体形成自由基，从而引发聚合反应。
叔胺要处于自由碱基状态下才有效，所以在低pH时，常会延长聚合时间；分子氧阻止链的延长，妨碍聚合作用；一些金属也能抑制聚合；冷却可以使聚合速度变慢。
通常控制这些因素使聚合在1小时内完成，以便使凝胶的性质稳定。
聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳有两种系统，即只有分离胶的连续系统和有浓缩胶与分离胶的不连续系统，不连续系统中最典型、国内外均广泛使用的是著名的Ornstein-Davis高pH碱性不连续系统，其浓缩胶丙烯酰胺浓度为4％，pH = 6.8，分离胶的丙烯酰胺浓度为12.5％，pH = 8.8。
实验二十五 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
（二）、器材
1．垂直板型电泳槽
2．直流稳压电源(电压300～600V，电流50～100mA)
3．50或100μl的微量注射器
四、操作步骤
（一）安装垂直板型电泳装置
此种夹心式垂直板电泳装置(如图2，3)的两侧为有机玻璃制成的电极槽，两个电极槽中间夹有一个凝胶模子。凝胶模子由3部分组成；一个“U”形的硅胶框、两块长短不等的玻璃片、样品槽模板(俗称“梳子”)。电极槽由上贮槽(白金电极在上或面对短玻璃片)、下贮槽(白金电极在下或面对长玻璃片)和冷凝系统组成。凝胶模子的硅胶框内侧有两条凹槽，可将两块相应大小的玻璃片嵌入槽内。玻璃片之间形成一个2～3mm厚的间隙，将来制胶时，将胶灌入其中。灌胶前，先将玻璃片洗净、晾干、嵌入胶带凹槽中。长玻璃片下沿与胶带框底之间保持有一缝隙，以使此端的凝胶与一侧的电极槽相通；而短玻璃片的下沿则插入橡胶框的底槽内。将已插好玻璃片的凝胶模子置于仰放的上贮槽上，短玻璃片应面对上贮槽，再合上下贮槽，用4条长螺丝将两个半槽固定在一起。上螺丝时，要按一定顺序逐个拧紧，均匀用力。将装好的电泳装置垂直放置，在长玻璃片下端与硅胶框交界的缝隙内加入用电极缓冲溶液配制的1％琼脂糖溶液，待其凝固后，即堵住凝胶模板下面的窄缝(通电时又可作为盐桥)。（二）凝胶的制备
8．凝胶贮液：Acr30.0g，Bis0.8g，加蒸馏水到100ml
9．电极缓冲溶液：SDS l g，Tris6g，甘氨酸28.8g，加蒸馏水至1000ml，pH=8.3。
10．固定液：取50％甲醇454ml，冰醋酸46ml，混匀。
11．染色液：1.25 g考马斯亮蓝R-250，加454 ml 50％甲醇溶液和46ml冰醋酸，混匀。
SDS_聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子质量
以标准蛋白质分子量的对数对相对迁移 率作图，得到标准曲线，根据待测样品相对 迁移率，从标准曲线上计算出其分子量。
思考题
• 在不连续体系SDS-PAGE中，当分离胶加完 后，需在其上加一层水，为什么?
四、浓缩胶的配制（5%）
试剂
H2O 凝胶贮备液 分离胶缓冲液(pH6.8) 10% Leabharlann DSTEMED 10%过硫酸铵
总体积
体积 2.92（ml） 0.8（ml） 1.25（ml） 0.05（ml）
5（ul） 25（ul） 5.05（ml）
五、浓缩胶的灌注和聚合
用移液管将所配制的浓缩胶缓冲液沿 着凝胶腔的长玻璃板的内面缓缓注入，将 梳子插入胶液顶部，放置室温下待其聚合。
【操作方法】
一、装板
将垂直板型电泳装置内的板状凝胶模子取出， 将玻璃片洗净、凉干、嵌入凹槽中，形成一个 “夹心”凝胶腔，把装好的凝胶腔置于仰放的 电极上槽。将电泳槽、凝胶模子串成一体的垂 直板型电泳装置，垂直放置在水平台面上，灌 注胶液。
二、分离胶的配制（12%）
试剂
H2O 凝胶贮备液 分离胶缓冲液(pH8.8) 10% SDS
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测 定蛋白质的相对分子质量
【目的】
• 学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。 • 掌握垂直板电泳的操作方法。 • 运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色
鉴定。
【原理】
在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十 二烷基硫酸钠（SDS），使蛋白样品与SDS结合 形成带负电荷的复合物，由于复合物分子量的 不同，在电泳中反应出不同的迁移率。根据标 准样品在该系统电泳中所作出的标准曲线，推 算出被测蛋白样品分子量的近似值。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS－聚丙烯酰胺凝胶 电泳分离血清蛋白质
一、பைடு நூலகம்的要求
1.学习电泳原理和技术
2.掌握SDS－聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的工作原
理和操作方法
二、实验原理
聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联
剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂四甲基乙二胺 (TEMED)和催化剂过硫酸铵((NH4)2S2O8 ，AP) 的作用 下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支
持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。
TEMED(加速剂)
Acr(单体)+Bis(交联剂)
AP(催化剂)
凝胶
聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构，具有 电荷效应、分子筛效应。
电荷效应（电泳物所带电荷的差异性） 分子筛效应（凝胶的网状结构及电泳物的 大小形状不同所致） PAGE同时还具有浓缩效应与体系的不连续性。
四、 操作步骤
固定玻板
制备分离胶 制备浓缩胶 加样 电泳
染色和脱色
1.安装夹心式垂直板电泳槽
安装好后，在长玻璃板下端与硅胶模框
交界的缝隙内加入已融化的1%琼脂糖。其目 的是封住空隙，凝固后的琼脂糖中应避免有 气泡。
2、配制凝胶
7.5%分离胶 （10ml） DDW 30%Acr-Bis 4.85 2.5 3%浓缩胶 （5ml） 3.16 0.5
6 .染色与脱色
电泳结束后，取下凝胶模，卸下胶框，用小 刀或镊子撬开短玻璃板，从凝胶板上切下左上 角作为加样标记。加入染色液染色1-2 h，再用 脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰。
将楔子插进，将底部插紧
插入梳子
加缓冲液
加 样
电泳
剥胶
五、实验结果
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
• 温度 聚合速度与温度有关，一般是高温聚合快， 聚合速度与温度有关，一般是高温聚合快， 而聚合的速度影响交联孔径的大小， 而聚合的速度影响交联孔径的大小，所以凝胶聚 合时必须保持温度恒定， 合时必须保持温度恒定，通常用与电泳相同的温 度。 分子氧的存在会阻止碳链的延长， • • 分子氧 分子氧的存在会阻止碳链的延长，妨 碍聚合作用，在聚合过程中要尽量避免接触空气。 碍聚合作用，在聚合过程中要尽量避免接触空气。 • • 杂质 某些金属离子或其它杂质也会影响凝胶 的化学聚合，所以应选择高纯度的Acr、Bis和 的化学聚合，所以应选择高纯度的 、 和 AP。 。
化学聚合的凝胶孔径较小，常用于制备分离胶， 化学聚合的凝胶孔径较小，常用于制备分离胶， 重复性好。聚合反应受各种因素的影响： 重复性好。聚合反应受各种因素的影响： 应选择合适的AP和 • 催化剂和加速剂的浓度 应选择合适的 和 TEMED浓度使聚合时间控制在 浓度使聚合时间控制在30—60min内较好， 内较好， 浓度使聚合时间控制在 内较好 过量的催化剂和加速剂会引起烧胶和蛋白质条带的 畸变。 畸变。 • pH TEMED只能以游离碱的形式发挥作用，在 只能以游离碱的形式发挥作用， 只能以游离碱的形式发挥作用 酸性条件下，叔胺缺少自由碱基，引发AP产生自由 酸性条件下，叔胺缺少自由碱基，引发 产生自由 基的过程会被延迟，聚合时间延长。 基的过程会被延迟，聚合时间延长。 •
凝胶总浓度及交联度对凝胶的影响
• 凝胶溶液中单体和交联剂的总浓度和两者的比例是决定聚 丙烯酰胺凝胶特性包括其机械性能、弹性、透明度、 丙烯酰胺凝胶特性包括其机械性能、弹性、透明度、粘着 度及孔径大小的主要因素。 为凝胶溶液中单体和交联剂的 度及孔径大小的主要因素。T为凝胶溶液中单体和交联剂的 总质量浓度， 为凝胶溶液中交联剂占单体和交联剂总量的 总质量浓度，C为凝胶溶液中交联剂占单体和交联剂总量的 质量分数。 质量分数。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量
. 样作为实验组来 同上项目三 SDS －聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE ）测定蛋白质分子量一实训目的1 掌握 SDS-PAGE 测定蛋白质分子量的操作步骤2 学会聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的原理 二实训原理用聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离鉴定蛋白质（protein ），主要依赖于电荷效应和分子筛效应。
再与标准样品对照即可确定各区带的成分。
要利用凝胶电泳测定某样品的蛋白质分子量就必须去掉其电荷效应，因此，当电泳时，蛋白质分子的迁移率取决于其分子大小。
SDS 能破坏蛋白质分子间以及其他物质分子间的非共价键使蛋白质的构象发生变化，继而使蛋白质变性解离成单一亚基，从而降低或消除了各种蛋白质分子间的天然电荷差异，形成 S DS-蛋白质负离子，因此，当电泳时，蛋白质分子的迁移率取决于其分子大小，当蛋白质分子量在 1.2X104～16.5X104 之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈直线关系，符合下列方程。
LogMW ＝K －bm(LogMW 为分子量的对数，K 、b 为常数，m 为迁移率)若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋 白质在相同条件下进行电泳根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得其分子量 三、实训器材序号 1 2 3 4 56 设备名称垂直板电泳槽及附件 直流稳压稳流电泳仪 微量进样器玻璃注射器玻璃平板电炉 规格，型号可变压数量1 12 1 41序 试剂纯度、浓度 作用配 制 需要工具 需要工具号 方法1低分子量标 准蛋白质样 2mg /ml以标准样品为 对照即可确定 见 表 格 下 水浴锅、小烧 杯，玻璃棒 本样品各区带的 方成分210~20mg/ml水浴锅、小烧品3浓缩胶缓冲 液测定蛋白质的 分子量呈弱酸性，使甘 同上 氨酸解离很少， 在电场作用下， 涌动效率低，二 氯离子含量高，杯，玻璃棒天平、容量 瓶、棕色试剂 瓶保 证 电 泳 的 作为催化剂，产去掉其电荷效SDS加速剂，可催化4分离胶缓冲 液形成较高的电 位梯度压着蛋 白质聚集在一 起，凝缩为一狭 小区带。
试验四SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质
• 5．加样：取大肠杆菌和BSA蛋白样品加样，每个 加样孔加样不宜过多，一般每孔加样7.5L。
• 6．电泳：先恒压80V，待样品进入分离胶后，调 电压为120V（恒压）。当溴酚蓝移动到离底部约 0.5cm时，停止电泳。
7．翘开玻璃板，将浓缩胶切掉, 剥下凝胶，准备染 色。
8． 凝胶染色：使用考马斯亮蓝R250染色。两块胶 （小盒子）或四块胶（大盒子）同步染色脱色。盖 上盖子用微波炉加热约15-20秒，摇床振荡15分钟， 回收染液至指定容器。清水漂洗后加入脱色液（25% 乙醇，7.5%乙酸）脱色，用量和步骤与染色相同， 脱色两次，每次10分钟。
上，注意薄玻璃朝向自己，厚 极架（卡在底面的卡口上），注意薄玻璃朝向
玻璃上的箭头向上。按弹簧夹，电极架，厚玻璃的箭头朝上，玻璃与红色橡胶
将玻璃夹卡入制胶架。在玻璃 条必须完全紧贴。（需同时放置两块制好的胶，
的间隙内灌胶，放上梳子，待 如只使用一块则另一面须用提供的塑料板代替，
胶凝固。
注意塑料板上的提示，必须使塑料板与橡胶条
1.将红色玻璃夹子底座朝 下、卡口打开呈直角状， 放入厚薄两片玻璃，薄玻 璃朝向自己。注意厚玻璃 箭头向上，旁边两条小玻 璃条与薄玻璃接触，使之 形成一个间隙。
2.在平整的桌面上放下玻 璃与夹子，使玻璃和夹子 的底面完全对齐，向外扳 动塑料卡口，关紧夹子。
3.将做好的玻璃夹放在制胶架 4.取出制好的玻璃（连带胶），将玻璃放入电
完全紧贴。）正常安装则会形成一个密闭的容
器。
5.将底座的开关打开， 并向外拨动透明的架子， 使中间空隙增大，放入 电极架。
6.如图所示将电极架往下 压（约1~2mm），使底面 完全接触。
7.关上底座开关。
8.放入电泳槽内，加上加样 架加样。注意加样架与刚才 制胶所用的梳子齿数必须一 致。
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涂抹痕迹——例4 涂抹痕迹可能常见于用非连续胶跑膜相关蛋白这类脂质含量丰富的样品。在 非连续PAGE中，样品蛋白基于两个因素而被超 浓缩。首先，当样品从非限 制性的积层胶移动至限制速度的分离胶时迁移速率陡然下降。其次，也是最 重要的，PH变化造成蛋白样品电泳速率的改变，导致样品突 然停滞。一个高 约半厘米左右的样品被压缩成为一个仅为数微米厚的薄层条带，局部蛋白浓 度急剧增加。 胞膜相关蛋白一般于较低浓度是沉淀，因此泳道的顶部通常有一条神色的条 带含有沉淀的蛋白。当电泳进行时沉淀的蛋白重新溶解然后持续进入凝胶， 因此造成了一个持续性的较深的不可分辨的背景。许多膜相关蛋白的凝胶图 像都显示同样的特征。 上图中4、7道的蛋白样品虽然含有相同的蛋白量，但是第4道的样品中含有的 膜蛋白的量超过了凝胶的分辨能力，造成了很深的涂抹痕迹。
电泳：带电粒子在电场中的定向移动。 影响泳动率u的因素 内因：1.净电荷 2.质点大小 3.质点形状
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外因：1.V ( U/L) 2.缓冲液的pH (pH恒定) 3.离子强度[I] 最适:0.02-0.2 4.电渗：液体对固体支持物的相对移动
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2. SDS-PAGE电泳原理
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• 3. Quantifying proteins —— 蛋白质定量分析；
实验目的
1.掌握电泳技术的基本原理。 2.掌握SDS-PAGE检测蛋白质分子的原理和技术。
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1. 电泳技术的基本原理
Electrophoresis, also called cataphoresis, is the motion of dispersed particles relative to a fluid under the influence of a spatially uniform electric field
将样品加到凝胶凹形样品槽底部，由于样品溶解液中含有比重 样品层。待所有凹形样品槽内都加到了样品，即可开始电泳。厦ຫໍສະໝຸດ 门 大学 生命
较大的蔗糖或甘油，因此样品溶解液会自动沉降在凝胶表形成
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5. 加样（挑选一块质量好的胶板，每两组样品上一块板上） 取50µl样品，微量进样器（移液枪）通过缓冲液，小心地
注意安装要平衡、紧密，不漏胶。
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2. 配胶
本实验采用不连续体系，分离胶浓度10.0 %，浓缩胶浓度为5%，具体 操作见下表: 试剂名称 凝胶贮液 分离胶缓冲液 (pH 8.9 Tris-HCl) 浓缩胶缓冲液 (pH 6.7 Tris-HCl) 10%TEMED 10%SDS 重蒸水 10%过硫酸铵 配制10 mL 10%分离胶 所需试剂用量（mL） 3.33 1.25 — 0.05 0.1 配制5 mL 5%浓缩胶 所需试剂用量（mL） 0.83 — 0.625 0.025 0.05 3.445 0.10
*浓缩胶的10%过硫酸铵应在分离胶凝固后，灌浓缩胶之前加入。
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5.22 0.15
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3. 制备凝胶板（每一组制备一块板）
（1）将混合后的分离胶溶液，迅速加至长、短玻璃板间的窄缝内，加 胶高度距样品模板梳齿下缘约1 cm。用1 ml 移液器在凝胶表面沿短玻璃 板边缘轻轻加一层水。用于隔绝空气，使胶面平整。 （2）约15-30 min凝胶完全聚合，则可看到水与凝固的胶面有折射率不 同的界线，倒去水，用滤纸条吸去多余的水，但不要碰破胶面。 （3）将混合均匀后的浓缩胶溶液，迅速加到分离胶上方，距短玻璃上 合凝固。
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6. 电泳 将直流稳压电泳仪的正极与下槽连接，负极与上槽连接(方 向切勿接错)，打开电泳仪开关，开始时将电流调至10 mA。待 样品进入分离胶后，将电流调至20-30 mA。当溴酚蓝染料迁移 至距离硅胶框下缘1 cm时，将电流调回到零，关电源。取下凝 胶板，用不锈钢铲轻轻将玻璃板撬开移去，在胶板一端切除一 7. 固定和染色 。 角作为标记，将胶板移至大培养皿中染色。 使染色液没过胶块，微波炉略微加热，置脱色摇床染色5 min 8. 脱色：用脱色液浸泡漂洗2次后用DDW继续浸泡脱色数次 9.凝胶成像。
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症状1——涂抹痕迹（smears） 涂抹痕迹——例1 涂抹痕迹可能由于多种原因引起，但是最常见的原因 是聚丙烯酰胺凝胶倒胶的不均匀或者上样量过大。
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涂抹痕迹——例2 这块胶每孔上样量过大。大多数的泳道还是能分清条带，但是在3、4道涂抹 痕迹非常明显。这些泳道的样品主要含有一种蛋 白（血红蛋白的亚基）， 与9、10道一样。但是，3、4道的样品低估了红细胞裂解物和红细胞胞浆组 分中的蛋白含量。这些组分包含了过多的蛋白以至于样品需 要稀释后才能 进行蛋白含量测定。但是这名学生却忘记了这个样品已经稀释过了，因此造 成了蛋白浓度的低估。（严重的失误啊！） 小型胶每孔的蛋白样品的量为20-40微克，取决于所需的分辨率和混合液中 包含的多肽数目。但是，如果是一个纯化样品上样，一个带包含了20-40微 克蛋白，那么其结果肯定也是一团糟！
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，直到背景蓝色褪去。
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SDS-PAGE测定蛋白质分子量
标准Marker蛋白的电泳图谱
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注意事项
1. Ac-bis 凝固前有毒，戴手套小心操作。 2. 装板后，要小心用琼脂封胶，避免漏胶。 3. 取出梳子要两端同时用力，防止胶孔变形。 4. 加样时，注意微量进样器不要碰破胶面。 5. 将电泳板安装到电泳槽上后，要除去凝胶底部 的气泡和多余琼脂。
2. 器材
微量移液器， EP管
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垂直板电泳槽，直流稳压电源 ，微量进样器 ，玻璃板
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实验步骤
1. 装板 将平、凹玻璃板洗干净，和边胶条一同安装在 制胶架上，用燕尾夹固定好电泳板。用琼脂将玻 璃板的两侧和底部封住。
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硫
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厦 门 大 学 生 命 科 学 学
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2.1.蛋白样品浓缩效应
在不连续电泳系统中，含有上、下槽缓冲液(running buffer： Tris-Gly，pH8.3)、浓缩胶缓冲液(stacking gel buffer：TrisHCl，pH6.8)、分离胶缓冲液 (seperating gel buffer：Tris-HCl，pH8.8) 。 浓缩胶：Cl-（墙）> Pr- > Gly (电中性-消失） 由于Cl-很快超过蛋白离子，因此在其后面形成一个电导 较低、电位梯度较陡的区域，该区电位梯度最高，这是在电 泳过程中形成的电位梯度的不连续性，导致蛋白质和Gly- 离 子加快移动，结果使蛋白质在进入分离胶之前，快、慢离子 之间浓缩成一薄层，有利于提高电泳的分辨率。
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2） 煮沸：促进还原剂破坏二硫键，促进SDS和蛋白 结合
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sucrose（glycerol）：帮助将样品沉入上样孔内
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4. 电泳完毕后的检测
1）考马斯亮蓝染色（R250） 2）银染 3）western blot 4）质谱分析
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试剂和器材
1. 试剂
即可加样。
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过凹玻璃板约0.5 cm，小心拔掉梳子，并清理点样孔并清除凝胶板底部的气泡，
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（4）将凝胶板从制胶架中取下。安装到电泳槽上，加入电极缓冲液，使液面没
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缘0.5 cm处，轻轻加入梳子，静置电泳槽， 20 min 左右，浓缩胶即可聚
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4. 样品处理 1. 粗提碱性磷酸酶 2. 过柱纯化透析后的碱性磷酸酶 100 µ l样品+30 µ l 5*SDS 样品缓冲液（上样缓冲液）后煮沸3 min 3. 10 µ l 标准分子量对照（molecular weight marker）（分格两 组样品）
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2. SDS-PAGE电泳原理
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电泳过程示意图 A为电泳前3层凝胶排列顺序，3层胶中均有快离子，慢离子 B显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的区带。 C显示蛋白质样品分离成数个区带。
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Cl-
glycine sample
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3. 样品处理
1） 上样缓冲液（样品缓冲液）： SDS：使蛋白变性，带上均一负电荷 β-mercaptoethonol：还原剂，破坏二硫键，打破蛋白 高级结构 电泳指示染料：溴酚蓝（bromophenoblue）
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2.2. 分子筛效应
蛋白质离子进入分离胶后，其pH 升高，使Gly 解离成负离子 的效应增加；同时因凝胶的浓度升高，蛋白质的泳动受到影 响，迁移率急剧下降。 分离胶：Cl- > Gly- > Pr-
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高电压梯度不复存在，蛋白质便在一个较均一的pH 和电压 梯度环境中，按其分子的大小移动。
• 6. Blotting applications —— 免疫印迹的第一步； • 7. identifying post-translational modification of proteins —— 蛋白质修饰的鉴定…