生物制药概论论文

由于分子生物学、基因工程技术和基因组学研究的飞速发展，蛋白多肽类药物的数目日益增长，治疗疾病种类越来越多，其疗效越来越好。最近3年FDA

批准上市的重组蛋白药物有蛋白同化试剂（克伦特罗、达那唑等）；肽类激素（重组人促红素注射液、重组甘精胰岛素等）；基因重组人血白蛋白；长效重组蛋白药物等。

蛋白质的糖基化是真核生物的一种常见的翻译后修饰方式。目前，随着基因工程技术的发展，已有越来越多的药用重组蛋白被制备。它们多属于糖蛋白，如重组人促红细胞生成素（rhEPO）重组人组织纤溶酶原激活剂(rhPA) 等。目前，随着分析技术的发展已可对糖链结构进行精确分析，并发现经不同宿主细胞表达、培养条件以及纯化工艺制备所得的重组糖蛋白其糖基形式存在着明显差异。这种差异对糖蛋白的理化性质和药理作用等有很大的影响，体现在蛋白的稳定性、溶解性、免疫原性、体内外生物活性、药物动力学和生物分配等方面。由于糖基对重组糖蛋白的功能产生重要作用。因此，糖蛋白类药物审批的要求已越来越高。美国FDA已经要求在申报人用糖蛋白类药物时，须提供糖蛋白的糖形分析结果。在我国已有许多单位开始此类研究工作。重组糖蛋白的质量控制要点是需要完整的糖基化。对repos的研究结果表明：糖链的分枝形式及末端的唾液酸化的程度使其体内外活性产生很大差异,完全或部分失去唾液酸的rhEPO进入体液循环后，可被肝脏中的半乳糖受体结合并迅速降解，从而影响其在体内的半衰期。糖基化与细胞生长状态密切相关，因此培养好细胞是首要的工作。采用连续灌注培养的方式培养基营养成分比较稳定，是较为理想的培养方式。此外，在上游构建研究时，选择好表达系统和宿主细胞是最为重要的步骤。随着基因技术的不断发展，有可能通过基因手段调控得到理想的糖链，例如通过表达某种特定的酶，从而改变或装配得到理想的糖链形式。另外，有可能将抗凋亡基因如bcl-2构建入工程细胞株，使细胞更长时间地稳定表达糖蛋白。

蛋白多肽类药物的临床药代动力学是药物临床研究的重要内容。与化学药物不同，蛋白多肽有些是内源性物质，药代动力学研究时首先需考察基线水平；蛋白可能引发抗体干扰药代动力学过程。最突出特点足蛋白多肽和内源性蛋白多肽都由氨基酸组成，结构相似不易区别。药代动力学研究中，目标蛋白给药量小，血浆浓度极低，在pg/mI,或ng/mI，一水平，而符种内源性蛋白含量要高出数千上万倍，这种干扰使目标分子的准确测量非常困难，其药代动力学研究测定方法必须有高度专属性、灵敏度及较高F1内和日间精密度及准确度。肽类激素主要通过腺苷酸环化酶系统作用。重组活性蛋白多肽的药代动力学受许多变量的影响，如内源性水平、循环内可溶性受体和细胞受体、代谢转化、免疫耐受性和生成被分析蛋白的抗体，都有可能影响蛋白多肽处置过程。对蛋白多肽的模型分析比化学药物更加复杂，可能会涉及模型不容易描述其特征的非线性过程并造成不易预测的后果。给药途径也是重要变量，皮下给药有可能被皮下注射部位的蛋白水解酶部分代谢。目前正在积极研究各种新给药途径。为了优化给药方案设汁，深入了解影响蛋白多肽类药物分析和药代动力学的各种因素是极其重要的。

基因重组人血白蛋白（HSA）结构分析：HSA是常用的临床药物，目前仍以传统力法由人血浆中分离，随着血浆供应日趋紧张以及艾滋病病毒、肝炎椭毒的泛滥；迫切需耍一种既可以阻止艾滋病，肝炎等疾病的传染机会又可以替代pHSA 产品；生产重组HSA就顺应了这一要求。虽然rHSA已经完成了三期临床实验．同时也证实了与pHSA有着相同的疗效。但是要想完全取代pHSA还尚需时日。由于HSA是一种多功能蛋白，因其具有元酶活性且无免疫原性等特点，可作为赋形剂

和稳定剂及无血清细胞培养基的组分。此外，由于具有抗氧化性，rHSA也被用作药物载体，从而赋予药物更好的理化特性。rHSA的广泛应用将为人类血液和血液制品翻开新的篇幅。

化学修饰是延长蛋白药物半衰期的一个有效途径，其中应用最为广泛的修饰剂是单甲氧基聚乙烯二醇 ( methoxypoly ethylene glycol，mPEG)，其次是多糖类如葡聚糖、聚蔗糖、淀粉等；同源蛋白质、人工合成多肽类如白蛋白、聚丙氨酸等；长链脂肪酸类以及聚烯属烃基化合物、聚酸酐等。PEG是惰性、两亲、不带电荷的柔性聚合物，分子量随聚合程度而变化( 1～50 kDa )，有线性和支链两种构型，其中线性单甲氧基聚乙烯醇( mPEG)已经FDA批准作为许多药物的安全载体。mPEG通过共价键与蛋白质连接，对蛋白表面氨基进行修饰以有效地改变多肽、蛋白药物在体内的分布和药物学特性。目前mPEG修饰已应用于40多种不同蛋白的修饰如猪血清白蛋白( BSA)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)白介素。-2(IL-2) 等。PEG修饰后血浆半衰期一般可延长几倍至几十倍甚至是上百倍，但大部分蛋白的免疫原性也有所降低，而蛋白的生物活性也有不同程度降低。这可能是由于 PEG大分子在蛋白分子周围形成一层外壳阻碍了免疫细胞与蛋白的接触保护了蛋白，掩盖了蛋白酶识别位点避免蛋白酶降解的发生，但同时也使蛋白的活性位点受到影响。通过基因融合技术增加多肽和蛋白药物分子量或改变与受体的亲和性等原理延长药物半衰期。人血清白蛋白(HSA)是现有天然载体蛋白之一，并且是血液中含量最高的单一蛋白 (达40g/L)，是人体血浆的主要成分，在体内有维持血液渗透压，运输营养和其它重要生物物质的作用，具有无免疫原性，人体相容性好，分子量大( 约为66 kDa )，半衰期长(达两周)等稳定剂和多肽运载蛋白的必需性质，它已成功地在哺乳动物细胞和酵母中实现高效表达。日本 Green Cross公司酵母表达的HSA已完成Ⅲ期临床实验和规模化生产的准备，临床实验证明酵母表达的HSA与天然的HSA在效果和安全性方面完全一致。1990年英国 delta公司首先将白蛋白用于基因融合提高多肽、蛋白药物的半衰期，1997年申请了HSA与人生长激素(HGS)的融合蛋白的专利。美国Yeh等将CD4与HSA融合表达，HAS-CD4融合蛋白在小鼠体，内半衰期较CD4延长140倍，使其半衰期与HSA相似。利用寡核苷酸引物、PCR介导的定点突变及盒式突变等方法使蛋白药物中影响活性或稳定性的氨基酸发生突变可以有效提高蛋白稳定性，增加药物半衰期。对于半衰期短的多肽、蛋白药物也可以采取改变剂型或包埋的形式延缓其在体内的释放来延长药物作用时间。