腹水抗体制备一般流程

腹水抗体制备(实验室级别)

2012-8-27

一、实验原理：

将稳定分泌单抗的细胞株，通过扩大培养，接种于Balb/c小鼠腹腔内，使其以腹水瘤形式在小鼠腹腔内增殖，从而得到大量含单抗的腹水。

二、实验材料：

药品：血清培养基、液体石蜡、生理盐水

仪器：电热恒温水浴箱、CO2培养厢、超净工作台、低速自动平衡离心机

三、制备步骤：

1.打石蜡

在细胞培养前两周，取8周-10周的Balb/C小鼠，按每个细胞株注射3只，1ml/只，以促进小鼠肠道蠕动，进行分笼，写好标记，十天后准备注射细胞；

2.杂交瘤细胞复苏与扩大培养

(1)12孔细胞培养板，每孔中加入的细胞培养液约2ml。

(2)按冻存细胞的液氮罐位置，取出冻存的细胞管，在37℃水浴箱中搅动1min

左右，快速融化冷冻的杂交瘤细胞。

(3)将融化的细胞吸入5mL的细胞培养液中，尽量收集细胞，装入EP管，然后

平衡EP管，800rpm，8min，进行离心。

(4)将离心好的细胞上清液吸除，吸取3mL细胞培养液混匀沉淀细胞，将该细胞

液吸出，按1ml/孔混匀到相应培养板孔中，显微镜下观察复苏后的细胞数量，生长形态和背景是否有污染及杂质，然后放入细胞培养厢中进行孵育。

3.杂交瘤细胞收集与注射

(1)待细胞处于对数生长期，即可收集。吸取上清1ml后，吹打细胞，使贴壁细

胞脱落，然后收集到15ml离心管中，800rpm，8min离心，

(2)吸取离心上清液(冻存备用)，然后每管加入4ml生理盐水，混匀后，同样条

件再次离心，弃去上清液，每管再加人2-3ml生理盐水，混匀后吸入5ml注射器，按约1ml-0.5ml/只，注射小鼠腹腔。从注射后起一周后，每天注意观察小鼠腹腔隆起程度和小鼠生命状态，防止小鼠死亡。

4.腹水收集

(1)取经过免疫的腹部隆起的小鼠，颈部处死，用消毒酒精浸泡，用剪刀剪开腹

部上皮，撕开腹部皮肤，挑起腹腔膜，剪开，注意不要全部剪开，将吸管插进去，挤压腹水后，再吸取腹水到15ml离心管中，800rpm，30min离心，收集油脂层一下淡黄液体，即为腹水抗体。

(2)正常情况下，每只小鼠可收集2-3ml腹水。抗体浓度0.5-5mg/ml。按1ml/

管，用1.5mlEP管分装后放-80℃冻存。

5.抗体纯化

(1)ProteinG亲和层析柱准备:填料（1ml）装柱后，超纯水流洗3-5个柱床体积

以洗掉乙醇，用平衡缓冲液洗5-10个柱床体积平衡柱子。

(2)上样：将样品上柱，上柱前需将样品超滤浓缩至1ml上柱。

(3)洗涤：平衡缓冲液洗5-10个柱床体积，直至洗涤液用检测液检测无明显显

色反应为止。

(4)洗脱：洗脱缓冲液洗脱吸附在填料上的目标抗体，收集洗脱峰(1-6管)，洗

脱液立即用中和缓冲液中和到中性。

(5)平衡层析柱：立即用5-10个柱床体积平衡缓冲液平衡柱子到中性。

(6)再生：再生缓冲液流洗2-3个柱床体积。

(7)保存：先后用平衡缓冲液、20%乙醇分别流洗3-5个柱床体积。层析柱内保

留适当体积的20%乙醇，置于4~8℃保存。