腹水抗体制备一般流程
细胞冻存复苏及腹水制备-LM
2013-5-23
三，贴壁细胞的消化：
1，吸去培养液，用无菌的PBS、Hanks液或无血清培养液洗涤细胞一 次，以去除残余的血清。 2，加入少量胰酶细胞消化液，略盖过细胞即可，室温放置30秒至2分钟。 3，显微镜下观察，细胞明显收缩，并且肉眼观察培养器皿底部发现细 胞的形态发生明显的变化；或者用枪吹打细胞发现细胞刚好可以被吹打
下来，此时吸除胰酶细胞消化液。加入含血清的培养液终止胰酶（竞争
抑制），吹打下细胞，即可直接用于后续实验。 4，如果发现消化不足，则加入胰酶细胞消化液重新消化。
5，如果发现细胞消化时间过长，未及吹打细胞，细胞已经有部分直接
从培养器皿底部脱落，直接用胰酶细胞培养液把细胞全部吹打下来， 1000-2000r离心1min，尽量去除胰酶细胞消化液后，加入含血清的完
的首选方法，一般用于生产科研或诊断用的单克隆抗体。
三，腹水产生的原因：
1，杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔后，大量肿瘤细胞在腹腔
中生长，分泌很多刺激性的因子，胶体渗透压升高，导致 腹水产生。 2，杂交瘤细胞的生长对腹膜是个刺激，引起炎症反应导 致腹膜上的毛细血管通透性增加，体液漏出，形成腹水 。
四，液体石蜡的作用：
1，饲养细胞有污染却没有发现。 2，细胞在水浴锅中时间过长或水进入冻存管。 3，操作过程存在污染。 4，没有更换枪头，导致交叉污染。 5，没有记录细胞的名称及其编号或者有重号现象。
四，细胞复苏的注意事项：
1，所用器材经过高压处理，培养基和血清是新的。
2，整个过程保证无菌操作。
3，复苏的关键是速融，一般在1min内。
接种小鼠腹腔 抽取腹水
腹水纯化标记
单抗鉴定
项目组进行评价
我们主要制备的腹水有三类：
通过小鼠腹水如何大量制备单克隆抗体
教学中产生的问题：单克隆抗体的制备过程中，大家都关注了筛选过程，往往没有关注制备的两条途径，其中之一，细胞培养的途径许多学生能理解，而腹水生产的途径就不熟悉，教材中也没有介绍，而这对内环境的知识也是有帮助的。
单克隆抗体（monoclonal
antibody，MAb），是针对专一的抗原决定簇产生的抗体。
单克隆技术又名杂交瘤技术起源于1975年，主要原理是利用产生抗体的B细胞与骨髓瘤细胞杂交融合成杂交瘤细胞，生产抗体。
两种方法生产单克隆抗体：
目前大量制备单抗的方法主要有两种方法，一种是动物体内生产法（腹水制备），在小鼠腹腔内接种杂交瘤细胞，杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体，约1-2周，可见小鼠腹部膨大，用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体；另一种是细胞体外培养法，将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养，在培养过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体。
由于腹水中单克隆抗体的产生通常会导致内源性宿主蛋白的污染，因此细胞培养对于小规模和大规模单克隆抗体的生产至关重要。
重点问题解疑：如何通过腹水产生单克隆抗体？
杂交瘤细胞被注射到小鼠腹腔内，由于有组织液提供足够的营养，所以能够大量分裂。同时部分杂交瘤细胞分泌抗体，这些细胞和抗体导致腹腔组织液渗透压增高，血浆和淋巴就会渗出并潴留在腹腔内形成腹水。
腹水制备法的优点：
腹水制备法操作简单、制备成本低，是目前国内生产抗体的主要方式，但是，得到的腹水常混有小鼠的各种杂蛋白（包括免疫球蛋白Ig），而且还有污染动物病毒的危险。而体外培养法通过转代培养制备的细胞培养得到的抗体，不但不含小鼠杂蛋白和动物病毒，而且抗体易纯化，目前在国外抗体生产中非常流行。
杂交瘤腹水纯化方法
杂交瘤腹水纯化方法
腹水纯化是获得高纯度单克隆抗体的重要步骤。
以下是一种常见的杂交瘤腹水纯化方法：
1. 离心：将收集的腹水离心，去除细胞和固体杂质。
2. 过滤：使用0.22 微米的过滤器过滤腹水，以去除微小的颗粒和悬浮物。
3. 亲和层析：使用针对单克隆抗体的亲和层析柱进行纯化。
将腹水加载到层析柱上，使抗体与层析柱上的配体结合，而其他杂质则流过柱子。
4. 洗脱：使用适当的洗脱缓冲液将结合在层析柱上的单克隆抗体洗脱下来。
洗脱缓冲液可以是具有竞争结合能力的物质，或者是改变pH 值或离子强度来打破抗体与配体的结合。
5. 浓缩和透析：将洗脱下来的抗体溶液进行浓缩，可以使用超滤或透析的方法去除多余的盐分和缓冲液，同时调整抗体的浓度。
6. 保存：将纯化后的单克隆抗体保存于适当的条件下，如低温冰箱或加入防腐剂。
需要注意的是，腹水纯化的方法可能因实验需求和设备条件而有所不同。
在进行腹水纯化之前，建议参考相关的实验手册和文献，以选择适合的纯化方法，并确保操作的正确性和安全性。
实验四 腹水型单抗的制备及纯化
实验四腹水型单抗的制备及纯化迄今为止，通常情况下均采用动物体内生产单抗的方法，鉴于绝大多数动物用杂交瘤均由BALB/c小鼠的骨髓瘤细胞与同品系的脾细胞融合而得，因此使用的动物当然首先BALB/c 小鼠。
本方法即将杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔内，在小鼠腹腔内生长杂交瘤，并产生腹水，因而可得到大量的腹水单抗且抗体浓度很高。
可见该法操作简便、经济，不过，腹水中常混有细胞及其残渣、小颗粒物质、脂肪滴以及小鼠的各种杂蛋白，因此在很多情况下要提纯后才能使用。
而腹水单抗的纯化是一个相当困难的工作，本实验将进行IgG1型腹水单抗的提纯方法。
材料：1、成年BALB/c小鼠。
2、灭菌液体石蜡或福氏不完全佐剂；处于对数生长期的杂交瘤细胞；新鲜采集的腹水（或冻存的腹水）。
3、饱和硫酸铵（pH7.2-7.4）溶液，正辛酸，0.1M NaOH，1M NaOH，0.06M，pH4.0NaAc-HAc缓冲液，0.01M，pH7.4 PBS，10×PBS（0.01M，pH7.4）。
方法：一、腹水的制备1．取12周龄的BALB/ c小鼠腹腔注射灭菌石蜡，0.5ml/只或腹腔注射福氏不完全佐剂，0.2-0.3ml/只。
2．1周后（注射灭菌液体石蜡）或3天后（注射福氏不完全佐剂）腹腔接种用PBS或无血清培养基稀释的杂交瘤细胞，每只小鼠1—3×106/0.3ml。
3．间隔5天后，每天观察小鼠腹水产生情况，如腹部明显膨大，以手触摸时，皮肤有紧张感，即可用16号针头采集腹水，一般可连续采2-3次，通常每只小鼠可采5-10ml腹水。
将腹水离心（2000rpm离心5min），吸去最上层的脂肪组织，除去细胞成分和其他的沉淀物，收集上清，将上清加入50﹪甘油冻存于－20℃冰箱，留下一小部分测定效价。
二、辛酸—硫酸铵法纯化腹水中的单抗1．取3ml腹水，2500r/min离心弃杂质，加入0.06M，pH4.0 NaAc-HAc缓冲液3ml，调pH 至4.8（用0.1M NaOH调）；2．加入99ul正辛酸（33ul/ml腹水），室温搅拌≥30min，4℃搅拌≥60min，逐滴加完，4℃澄清2h（20min）；3．取出15000r/min离心30min（10min）（4℃），去沉淀（白蛋白和其它非IgG蛋白），上清加入1/10体积的10×PBS（0.01M，pH7.4），用1M NaOH调pH至7.2；4．上清滴加等量饱和硫酸铵（pH7.2-7.4）溶液，使硫酸铵的饱和度为50％，继续搅拌10-30min，静置30min；5．10000rpm（4℃）离心30min（10min），弃上清，将沉淀溶于1.2ml，0.01M，pH7.4 PBS 中，6．0.01M，pH7.4 PBS透析过夜（4℃），其间换液3次，收集透析袋内液体，—20℃保存备用。
小鼠单抗腹水纯化步骤
小鼠单抗腹水纯化一、初纯——辛酸—硫酸铵法【原理】在酸性条件下（pH=4.5），非IgG的蛋白成分（包括白蛋白，部分Ig），能被辛酸等短链脂肪酸沉淀，上清中剩余的蛋白主要为IgG，再用硫酸铵沉淀上清，即可获得纯度较高的IgG。
辛酸—硫酸铵法比硫酸铵法能或得更高纯度的IgG。
【溶液配制】1、60mM的醋酸缓冲液（pH4.0）200ml取0.2M醋酸缓冲液母液60ml，加ddH2O至200ml，调pH为4.04.0.2M醋酸缓冲液母液60ml：○10.2mM乙酸49.2ml，折合566μl的冰乙酸。
○20.2M乙酸钠10.8ml（0.2M乙酸钠：2.72g三水合乙酸钠（MW136.08），溶解于100ml ddH2O中）2、10*PBS (0.1M,pH7.4) 500ml取0.2M PB母液250ml加水定容到500ml，加入45gNaCl（使NaCl终浓度为9%），此时pH约为7.35，调pH至7.4.0.2M PB母液250ml：0.2M Na2HPO4202.5ml （折合14.5g Na2HPO4·12H2O）0.2M NaH2PO447.5ml （折合1.482g NaH2PO4·2H2O）3、1M Tris——Cl（pH9.0）100ml称取12.11gTris——Base（MW 121.1），加水至98ml，用HCl调pH至9.0.【步骤】1、腹水4℃，12000rpm离心15min，去除细胞碎片和大的蛋白聚集物。
2、腹水上清滤纸过滤去除脂质和大的颗粒沉淀，滤液用4倍体积的60mM醋酸缓冲液（pH4.0）稀释后，用1M NaOH调pH至4.5（一般pH刚好在4.5左右，可不再调）。
3、逐滴加入辛酸（终浓度为25μl/ml稀释腹水），待溶解后再加入另一滴，室温搅拌30min，然后4℃静置2h以上，使其充分沉淀。
注意：缓慢滴加避免局部的浓度一下子很高，这样就可能将不需要的蛋白沉淀下来。
小鼠单抗腹水纯化步骤
小鼠单抗腹水纯化一、初纯——辛酸—硫酸铵法【原理】在酸性条件下（pH=4.5），非IgG的蛋白成分（包括白蛋白，部分Ig），能被辛酸等短链脂肪酸沉淀，上清中剩余的蛋白主要为IgG，再用硫酸铵沉淀上清，即可获得纯度较高的IgG。
辛酸—硫酸铵法比硫酸铵法能或得更高纯度的IgG。
【溶液配制】1、60mM的醋酸缓冲液（pH4.0）200ml取0.2M醋酸缓冲液母液60ml，加ddH2O至200ml，调pH为4.04.0.2M醋酸缓冲液母液60ml：○10.2mM乙酸49.2ml，折合566μl的冰乙酸。
○20.2M乙酸钠10.8ml（0.2M乙酸钠：2.72g三水合乙酸钠（MW136.08），溶解于100ml ddH2O中）2、10*PBS (0.1M,pH7.4) 500ml取0.2M PB母液250ml加水定容到500ml，加入45gNaCl（使NaCl终浓度为9%），此时pH约为7.35，调pH至7.4.0.2M PB母液250ml：0.2M Na2HPO4202.5ml （折合14.5g Na2HPO4·12H2O）0.2M NaH2PO447.5ml （折合1.482g NaH2PO4·2H2O）3、1M Tris——Cl（pH9.0）100ml称取12.11gTris——Base（MW 121.1），加水至98ml，用HCl调pH至9.0.【步骤】1、腹水4℃，12000rpm离心15min，去除细胞碎片和大的蛋白聚集物。
2、腹水上清滤纸过滤去除脂质和大的颗粒沉淀，滤液用4倍体积的60mM醋酸缓冲液（pH4.0）稀释后，用1M NaOH调pH至4.5（一般pH刚好在4.5左右，可不再调）。
3、逐滴加入辛酸（终浓度为25μl/ml稀释腹水），待溶解后再加入另一滴，室温搅拌30min，然后4℃静置2h以上，使其充分沉淀。
注意：缓慢滴加避免局部的浓度一下子很高，这样就可能将不需要的蛋白沉淀下来。
小鼠单抗腹水纯化步骤
小鼠单抗腹水纯化一、初纯——辛酸—硫酸铵法【原理】在酸性条件下（pH=4.5），非IgG的蛋白成分（包括白蛋白，部分Ig），能被辛酸等短链脂肪酸沉淀，上清中剩余的蛋白主要为IgG，再用硫酸铵沉淀上清，即可获得纯度较高的IgG。
辛酸—硫酸铵法比硫酸铵法能或得更高纯度的IgG。
【溶液配制】1、60mM的醋酸缓冲液（pH4.0）200ml取0.2M醋酸缓冲液母液60ml，加ddH2O至200ml，调pH为4.04.0.2M醋酸缓冲液母液60ml：○10.2mM乙酸49.2ml，折合566μl的冰乙酸。
○20.2M乙酸钠10.8ml（0.2M乙酸钠：2.72g三水合乙酸钠（MW136.08），溶解于100ml ddH2O中）2、10*PBS (0.1M,pH7.4) 500ml取0.2M PB母液250ml加水定容到500ml，加入45gNaCl（使NaCl终浓度为9%），此时pH约为7.35，调pH至7.4.0.2M PB母液250ml：0.2M Na2HPO4202.5ml （折合14.5g Na2HPO4·12H2O）0.2M NaH2PO447.5ml （折合1.482g NaH2PO4·2H2O）3、1M Tris——Cl（pH9.0）100ml称取12.11gTris——Base（MW 121.1），加水至98ml，用HCl调pH至9.0.【步骤】1、腹水4℃，12000rpm离心15min，去除细胞碎片和大的蛋白聚集物。
2、腹水上清滤纸过滤去除脂质和大的颗粒沉淀，滤液用4倍体积的60mM醋酸缓冲液（pH4.0）稀释后，用1M NaOH调pH至4.5（一般pH刚好在4.5左右，可不再调）。
3、逐滴加入辛酸（终浓度为25μl/ml稀释腹水），待溶解后再加入另一滴，室温搅拌30min，然后4℃静置2h以上，使其充分沉淀。
注意：缓慢滴加避免局部的浓度一下子很高，这样就可能将不需要的蛋白沉淀下来。
抗体制备流程
抗体制备流程抗体制备是生物学研究中常见的实验技术之一，也是一项复杂而精细的工作。
下面将介绍抗体制备的一般流程，以供参考。
1. 抗原制备。
首先，需要准备抗原。
抗原可以是蛋白质、多肽、细胞膜蛋白等。
通常情况下，我们会通过基因工程技术来表达和纯化抗原蛋白。
在这一步骤中，需要注意保持抗原的天然构象和活性。
2. 免疫动物的选择。
选择合适的免疫动物也是非常重要的。
常见的免疫动物包括小鼠、大鼠、兔子等。
在选择免疫动物时，需要考虑到免疫动物的体积、生理特征、抗原的种类等因素。
3. 免疫程序。
将制备好的抗原充分混合并与免疫动物进行免疫。
免疫的途径可以是皮下注射、腹腔注射等。
在免疫过程中，需要根据实验要求进行多次免疫，以提高抗体的效价。
4. 血清收集。
在完成免疫程序后，需要定期采集免疫动物的血清样本。
血清中含有免疫动物产生的抗体，可以用于后续的实验。
5. 抗体纯化。
从采集到的血清样本中，可以通过蛋白A/G亲和层析柱或其他纯化手段来纯化抗体。
纯化后的抗体可以用于酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫印迹（Western blot）等实验。
6. 抗体鉴定。
鉴定纯化后的抗体的效价和特异性也是必不可少的步骤。
常用的鉴定方法包括ELISA、Western blot、免疫组化等。
7. 抗体保存。
最后，需要将鉴定合格的抗体进行分装并保存。
在保存过程中，需要注意避免抗体的冻融循环，以保证抗体的稳定性和活性。
总结。
抗体制备是一项复杂的实验技术，需要研究人员具备扎实的实验技能和丰富的经验。
在实验过程中，需要严格控制各个步骤的条件和参数，以保证抗体的质量和稳定性。
希望本文介绍的抗体制备流程能对您有所帮助。
小鼠单抗腹水纯化步骤
小鼠单抗腹水纯化步骤小鼠单抗是一种通过免疫响应体外制备的抗体，通常通过腹水提取方式来获得。
下面是小鼠单抗腹水纯化的一般步骤：1.小鼠免疫将小鼠注射目标抗原，通常使用免疫佐剂将抗原与免疫系统刺激起来。
免疫期间要注意小鼠的饮食和生活环境，保证其健康状态。
2.收集腹水在免疫后，根据小鼠的体重和免疫剂量，使用注射器从小鼠的腹腔中收集腹水。
使用无菌器具，注意操作过程要无菌。
3.储存和预处理腹水收集到的腹水用离心机离心，去除其中的杂质和细胞。
然后将澄清的腹水分装入无菌离心管中，并进行储存。
4.蛋白质浓缩和沉淀将腹水进行浓缩，可以使用离心或超滤等方法。
浓缩过程中要注意温度和时间的控制，以避免蛋白质降解。
浓缩后的腹水可以进一步进行封冻保存。
5.抗原亲和纯化使用亲和层析柱，将浓缩的腹水与目标抗原相互作用。
亲和层析柱可以选择已经与目标抗原结合的树脂，或者通过动态亲和层析的方法进行柱填充。
6.纯化和洗脱将亲和层析柱上结合的抗原-抗体复合物进行洗脱。
可以使用洗脱液来改变物质之间的亲和力，以实现复合物的解离。
洗脱后的洗脱液可以进行进一步的分析和检测。
7.鉴定和分析对纯化后的抗体进行鉴定和分析，可以使用免疫层析、SDS-、Western blot等方法。
这些方法可以检测纯化后的抗体的纯度、抗体滴度和特异性。
8.储存和保存将纯化后的抗体进行分装并储存，通常以冷冻的形式保存。
在保存的过程中要注意使用无菌的存储容器，避免污染和降解。
以上是小鼠单抗腹水纯化的一般步骤。
根据实际需求和具体实验条件的不同，可能会有所调整。
另外，为了保证实验的安全和可重复性，建议在进行实验前充分了解相关实验操作和操作流程，并遵守实验室安全规范。
抗体制备介绍
抗体制备抗体制备是生物技术领域中的一个重要过程，它涉及多个步骤，目的是为了获取特定的抗体，这些抗体可以用于诊断、治疗以及科学研究。
以下是抗体制备的一般流程：1. 抗原的选择与制备抗原选择：根据需要制备的抗体类型，选择相应的抗原。
抗原通常是一种能引起免疫反应的分子，如蛋白质、多肽、多糖等。
抗原制备：如果抗原是蛋白质，可能需要通过重组DNA技术在细胞中表达并纯化。
如果抗原较小，可能需要通过化学方法合成。
2. 动物免疫宿主选择：通常选用小鼠、大鼠、兔子或者羊等动物作为宿主。
免疫程序：将抗原与佐剂混合后，通过注射的方式引入动物体内，以刺激免疫系统产生抗体。
通常需要多次免疫才能获得足够数量的抗体。
3. 采集和检测采集血液：免疫数周后，从动物体内采集血液。
分离血清：血液离心后，取上层的血清，其中含有抗体。
检测抗体：通过ELISA、Western blotting、免疫荧光等方法检测抗体的特异性和亲和力。
4. 抗体纯化沉淀法：如铵硫酸盐沉淀法。
色谱法：包括离子交换色谱、亲和色谱（利用蛋白A或蛋白G 亲和抗体Fc区）等。
5. 抗体标记（如需）酶标记：如与辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶结合。
荧光标记：如FITC或PE标记。
同位素标记：用于放射免疫检测。
6. 单克隆抗体制备（如果需要）融合：将已免疫动物的脾细胞与恒温动物骨髓瘤细胞融合。
筛选：利用HAT培养基筛选出能够产生所需抗体的杂交瘤细胞。
克隆：将杂交瘤细胞进行单细胞克隆，确保抗体的一致性。
培养和扩大：将筛选出的杂交瘤细胞在体外培养或者在特定的动物体内扩大。
抗体采集和纯化：从培养基或动物的腹水中采集含有单克隆抗体的液体，并进行纯化。
7. 质量控制抗体活性：检测抗体的亲和力和特异性。
抗体纯度：通过SDSPAGE、HPLC等方法检测纯度。
抗体稳定性：进行长时间存储后，检测抗体的稳定性。
8.包装和保存包装：按照需求包装成不同规格。
保存：通常在低温条件下保存，例如20℃或者80℃，有时添加甘油或蛋白稳定剂。
wb实验流程及注意事项
wb实验流程及注意事项
WB实验是一种常见的免疫学实验，其流程大致如下：
1.制备细胞悬液：将需要研究的细胞通过离心、洗涤等操作制成含有约1×10^6个/ml的单细胞悬液。
2.孵育细胞：将细胞悬液加入含有10%腹水的RPMI1640培养基中（也可添加适量的FBS）进行孵育，通常孵育时间为24-48小时。
3.收获细胞：将孵育后的细胞通过离心等方式收获，以备进行下一步操作。
4.制备干标准物：将抗体或其他试剂制成干标准物（包括一系列浓度档次），通常冷冻保存备用。
5.制备稀释液：将PBS或其他缓冲液配成不同浓度的稀释液，可用于对干标准物的稀释。
6.加入样品：将步骤3中的细胞悬液加入96孔板中，加入相等体积的稀释液。
7.加入干标准物：将制备好的干标准物加入96孔板中，加入相等体积的稀释液。
8.孵育：将加入样品和干标准物的96孔板进行孵育，通常为2-3小时，使细胞与抗体结合。
9.洗涤：用PBS或其他缓冲液进行洗涤，去除未结合的试剂。
10.加入二抗：加入与干标准物匹配的二抗，并进行孵育。
经过一定时间，细胞与试剂结合形成免疫复合物。
11.用底物发光：加入底物，进行化学发光反应，根据发光量推算出样品中对应物质的浓度。
注意事项：
1.所有试验所用材料要保持洁净，尤其是培养皿和吸管，以避免污染。
2.在制备稀释液和样品时要准确称量，避免误差，同时要注意样品的体积和浓度，保证实验的可靠性。
3.在操作过程中，要规范操作流程，严格遵守实验规程，注意自身安全。
4.试剂保存要避免高温和阳光照射，同时要注意过期时间。
5.实验过程中要及时记录数据，以便后续分析。
抗体制备过程
抗体制备过程抗体是一种重要的生物分子，具有广泛的应用价值，尤其在医学和生物学研究领域。
抗体制备过程是制作抗体的关键步骤之一，本文将详细介绍抗体制备的过程。
抗体制备的过程可以分为以下几个步骤：抗原的选择、免疫动物的选择、免疫程序的设计、抗血清的制备和纯化。
第一步是选择抗原。
抗原是诱导机体产生抗体的物质，可以是蛋白质、多肽、多糖或化合物。
抗原的选择应根据研究目的和需要进行，通常选择与研究对象具有相关性的抗原。
第二步是选择免疫动物。
常用的免疫动物有小鼠、兔子、大鼠等。
选择合适的免疫动物要考虑到其灵敏度、免疫反应强度和体积等因素。
通常情况下，小鼠是最常用的免疫动物，因为其体积小、繁殖周期短且易于操作。
第三步是设计免疫程序。
免疫程序的设计要考虑到抗原的适宜剂量、免疫次数和免疫间隔时间。
在设计免疫程序时，需要注意免疫次数过多可能导致免疫动物免疫抑制，而免疫间隔时间过短则可能导致免疫反应不充分。
第四步是抗血清的制备。
免疫程序完成后，免疫动物的血液中会产生特异性抗体。
在抗血清制备过程中，需要采集免疫动物的血液，并对血液进行离心分离得到血清。
血清中包含了特异性抗体，可以用于后续实验和分析。
第五步是抗血清的纯化。
抗血清中除了包含特异性抗体外，还有其他非特异性成分，如血浆蛋白和其他血清成分。
因此，在使用抗血清之前，需要对其进行纯化。
常用的纯化方法有盐析法、胶体蛋白聚集法、亲和层析法等。
抗体制备过程的关键是合理设计和严格执行免疫程序。
只有充分考虑抗原选择、免疫动物选择、免疫程序设计以及抗血清的制备和纯化，才能获得高质量的抗体。
总结起来，抗体制备的过程包括抗原的选择、免疫动物的选择、免疫程序的设计、抗血清的制备和纯化。
这个过程需要合理选择抗原和免疫动物，并设计适当的免疫程序。
制备好的抗血清还需要进行纯化处理，以去除其他非特异性成分。
抗体制备过程的成功与否将对后续的实验和研究结果产生重要影响。
腹水的制备
这里还有一个获得腹水经验性步骤，不知道能否帮的了你1) 选用雌性Balb/c小鼠，小鼠一定要健康。
2) 腹腔注射0.5ml石蜡油/鼠，1-2周后（我一般选用注射10天后的小鼠，不过注射3-4周后的小鼠仍可用）腹腔注射细胞。
3) 打腹水时，细胞要处于对数生长期，细胞数量过多过少都不好，我一般是注射10^6/鼠，每株杂交瘤打3只。
4) 约7天后，触摸小鼠腹部有肿胀感时，即可用16号针头采集腹水，针头刺入腹腔后，一般即有腹水喷出，若没有腹水流出，可轻旋针头，操作时要有耐心。
我每次可采集4-5ml 腹水/鼠，有时甚至可达6ml，隔天后再次采集，一般可采集三次左右，每只小鼠可采集十多ml腹水。
有时一只小鼠采到20多ml腹水后仍然活得很好（这也很烦）。
还有一点，采集用的针头要事先灭菌！小鼠对不同杂交瘤细胞的敏感性不同，有的注射后一周即死亡，有的会出现血性腹水，有的可以反复收取腹水2-3次。
我做过2种类别10株细胞的腹水，以下供参考：1、每组细胞准备2只小鼠，8-10周龄，最好与制备单抗的小鼠同系；接种杂交瘤细胞前预先使用致敏剂，可以用石蜡油（提前一周）或不完全弗氏佐剂（提前三天）；2、第一只接种细胞数可以控制在10的6次方，如果出现腹水少、死得快的现象，则第二只小鼠接种细胞数不能超过5*10的5次方；注射细胞少腹水形成慢但效价会更高；3、待第7天左右开始密切观察小鼠的腹水及存活情况，如果活力佳，有明显移动性腹水，可以放腹水2次左右；一旦发现小鼠活动受限，要立即处死放腹水；4、一般每次可以收取2-3ml。
制备小鼠腹水细节剪刀剃毛，酒精消毒止血钳、镊子夹提腹部皮毛小号针头，越细越好，减少损伤eppendorf管或玻璃试管装均可，但要高压灭菌刺入针头时注意先提起腹部皮毛，在腹部中线旁刺入空隙，勿扎住内脏腹水采集分成两类：1：活着是抽取腹水2: 处死抽取腹水活着抽取腹水主要用到的是酒精棉球与注射器（2-5ml）以及灭后菌的eppendorf管(因为腹水还要分离所以用这个最好，便于离心）。
抗体制备-自己整理
制备单克隆抗体是复杂而费时的工作，整个技术流程如图：单克隆抗体制备（免疫2-3月，总周期4-6月）准备抗原动物免疫选择免疫动物Elisa测抗血清分离脾细胞细胞融合（融合剂:PEJ）HAT培养基筛选杂交瘤细胞筛选阳性细胞（三天内做完流式）阳性克隆并扩大培养细胞冻存扩大培养收集上清动物接种收集腹水单克隆抗体纯化保存抗原提纯与动物免疫对抗原的要求是纯度越高越好，尤其是初次免疫所用的抗原。
如为细胞抗原，可取1×107个细胞作腹腔免疫。
可溶性抗原需加完全福氏佐剂并经充分乳化，如为聚丙烯酰胺电泳纯化的抗原，可将抗原所在的电泳条带切下，研磨后直接用以动物免疫。
选择与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c健康小鼠，鼠龄在8～12周，雌雄不限。
为避免小鼠反应而不佳或免疫过程中死亡，可同时免疫3～4只小鼠。
免疫过程和方法与多克隆抗血清制备基本相同，因动物、抗原形式、免疫途径不同而异，以获得高效价抗体为最终目的。
免疫间隔一般2～3周。
一般被免疫动物的血清抗体效价越高，融合后细胞产生高效价特异抗体的可能性越大，而且单克隆抗体的质量（如抗体的浓度和亲和力）也与免疫过程中小鼠血清抗体的效价和亲和力密切相关。
末次免疫后3～4天，分离脾细胞融合。
骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备选择瘤细胞株的最重要的一点是与待融合的B细胞同源。
如待融合的是脾细胞，各种骨髓瘤细胞株均可应用，但应用最多的是Sp2/0细胞株。
该细胞株生长及融合效率均佳，此外，该细胞株本身不分泌任何免疫球蛋白重链或轻链。
细胞的最高生长刻度为9×105/ml，倍增时间通常为10～15h。
融合细胞应选择处于对数生长期、细胞形态和活性佳的细胞（活性应大于95％）。
骨髓瘤细胞株在融合前应先用含8-氮鸟嘌呤的培养基作适应培养，在细胞融合的前一天用新鲜培养基调细胞浓度为2105/ml，次日一般即为对数生长期细胞。
在体外培养条件下，细胞的生长依赖适当的细胞密度，因而，在培养融合细胞或细胞克隆化培养时，还需加入其他饲养细胞（feedercell）。
11.7小鼠腹水纯化
2．方法：
1、把小鼠腹水和binding buffer按1：2或者更高的比例混合，之后用0.45um滤膜过滤。
2、把填料小心的装入合适的柱子中，等待大约30min填料就会沉淀好。
3、用binding buffer平衡柱子直至平衡，测流出液体的pH值为9.0，流速设置为1.00ml/min
4、加入处理好的样品，此时要把流速设置为0.5ml/min
5、继续用binding buffer洗脱杂蛋白直至平衡。
6、用elution buffer洗脱目的蛋白，待等到目的蛋白波峰出现时立即收集。
7、使用洗脱液洗脱柱子直至平衡
8、使用保存液（不含叠氮钠）洗脱直至平衡
9、取出填料用含有叠氮钠的保存液4℃保存。
试验结果
1．纯化得到纯抗体
2．
3．
4．
5．
试验分析
问题分析
1．
2．
3．
4．
5．
结果分析
1．
2．
3．
4．
5．
试验进一步设计方向
问题解决设计
1．
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3．
4．
整体试验设计
1．
2．
3．
4．
备注说明
试验记录整理说明：
1．学生每天试验务必进行试验记录，并进行规范整理；此工作为实验进行过程中的例行工作；
2．试验目的、方法应与试验日期当天记录整理；试验结果、试验分析和试验进一步设计应予试验完成后及时记录整理；
试验技能训练记录整理表
实验室名称
动物传染病与基因芯片实验室
试验学生姓名
李俊材
试验日期
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腹水抗体制备(实验室级别)
2012-8-27
一、实验原理：
将稳定分泌单抗的细胞株，通过扩大培养，接种于Balb/c小鼠腹腔内，使其以腹水瘤形式在小鼠腹腔内增殖，从而得到大量含单抗的腹水。
二、实验材料：
药品：血清培养基、液体石蜡、生理盐水
仪器：电热恒温水浴箱、CO2培养厢、超净工作台、低速自动平衡离心机
三、制备步骤：
1.打石蜡
在细胞培养前两周，取8周-10周的Balb/C小鼠，按每个细胞株注射3只，1ml/只，以促进小鼠肠道蠕动，进行分笼，写好标记，十天后准备注射细胞；
2.杂交瘤细胞复苏与扩大培养
(1)12孔细胞培养板，每孔中加入的细胞培养液约2ml。
(2)按冻存细胞的液氮罐位置，取出冻存的细胞管，在37℃水浴箱中搅动1min
左右，快速融化冷冻的杂交瘤细胞。
(3)将融化的细胞吸入5mL的细胞培养液中，尽量收集细胞，装入EP管，然后
平衡EP管，800rpm，8min，进行离心。
(4)将离心好的细胞上清液吸除，吸取3mL细胞培养液混匀沉淀细胞，将该细胞
液吸出，按1ml/孔混匀到相应培养板孔中，显微镜下观察复苏后的细胞数量，生长形态和背景是否有污染及杂质，然后放入细胞培养厢中进行孵育。
3.杂交瘤细胞收集与注射
(1)待细胞处于对数生长期，即可收集。
吸取上清1ml后，吹打细胞，使贴壁细
胞脱落，然后收集到15ml离心管中，800rpm，8min离心，
(2)吸取离心上清液(冻存备用)，然后每管加入4ml生理盐水，混匀后，同样条
件再次离心，弃去上清液，每管再加人2-3ml生理盐水，混匀后吸入5ml注射器，按约1ml-0.5ml/只，注射小鼠腹腔。
从注射后起一周后，每天注意观察小鼠腹腔隆起程度和小鼠生命状态，防止小鼠死亡。
4.腹水收集
(1)取经过免疫的腹部隆起的小鼠，颈部处死，用消毒酒精浸泡，用剪刀剪开腹
部上皮，撕开腹部皮肤，挑起腹腔膜，剪开，注意不要全部剪开，将吸管插进去，挤压腹水后，再吸取腹水到15ml离心管中，800rpm，30min离心，收集油脂层一下淡黄液体，即为腹水抗体。
(2)正常情况下，每只小鼠可收集2-3ml腹水。
抗体浓度0.5-5mg/ml。
按1ml/
管，用1.5mlEP管分装后放-80℃冻存。
5.抗体纯化
(1)ProteinG亲和层析柱准备:填料（1ml）装柱后，超纯水流洗3-5个柱床体积
以洗掉乙醇，用平衡缓冲液洗5-10个柱床体积平衡柱子。
(2)上样：将样品上柱，上柱前需将样品超滤浓缩至1ml上柱。
(3)洗涤：平衡缓冲液洗5-10个柱床体积，直至洗涤液用检测液检测无明显显
色反应为止。
(4)洗脱：洗脱缓冲液洗脱吸附在填料上的目标抗体，收集洗脱峰(1-6管)，洗
脱液立即用中和缓冲液中和到中性。
(5)平衡层析柱：立即用5-10个柱床体积平衡缓冲液平衡柱子到中性。
(6)再生：再生缓冲液流洗2-3个柱床体积。
(7)保存：先后用平衡缓冲液、20%乙醇分别流洗3-5个柱床体积。
层析柱内保
留适当体积的20%乙醇，置于4~8℃保存。