体外诊断试剂研制常用技术指标之分析性能评估

1 定量标记免疫分析方法分析性能评估的主要指标1.1 灵敏度1.1.1 分析灵敏度：试剂盒的灵敏度即最低检出量是指在统计学意义上能与零剂量区别的量。

一般用95％可信限计算：重复测定零剂量点（n≥10），计算反应量的均（x_）和标准差（SD），以x_+2SD（夹心法试剂盒）或均值x_-2SD（竞争抑制法试剂盒）的反应量计算出相应的浓度，即为该试剂盒的分析灵敏度，这是我们医疗器械注册资料所需提供的内容。

1.1.2 功能灵敏度：将低值样本倍比稀释后重复测定（n≥10），计算反应量的变异系数（CV%），CV%大于20％时所对应的剂量点，即为该试剂盒的功能灵敏度。

1.2 特异性诚如我们所认识到的，标记免疫分析是特定抗体对特定抗原的特异识别。

不同来源的抗体与结构类似物结合从而产生交叉反应是客观存在的，因此特异性检验是正确认识该试剂盒对结构类似物抗干扰能力的指标。

特异性检验通常有两种标定方法：1.2.1 交叉反应率：一定浓度的结构类似物在本试剂盒上的测定结果（物质的量）与该类似物的量的比值的百分率。

如：1 000 pmol/L的结构类似物，在某试剂盒上测定结果是5 pmol/L，其交叉反应率＝5 pmol/L/ 1 000 pmol/L * 100%=0.5%。

1.2.2 实际测量值：对于不能用物质的量表示的被测物，如糖蛋白激素FSH、LH、TSH 和HCG，这4种激素具有相同的α亚单位，仅仅是α亚单位上部分氨基酸不同，实际操作中很容易产生交叉反应，而这4种激素又分别有各自的同形异构物，其量的表达方法还不能用物质的量（mol/L，ng/mL）表示，而只能借助于生物测定的活性单位（IU/L，mIU/L）表示，而每一种激素的活性单位（IU）又有完全不同的生物学意义，相互之间没有任何关联，即并且每一种激素定义的单位意义完全不同，不同来源相同质量的某一种激素的活性单位也不同，它们之间的交叉反应绝对不能用交叉反应率表示，因此往往选择实测值表示。

1.2.3 选择交叉反应对照物：当交叉反应的测量结果高于我们期待的结果时，可以从两个方面分析：首先，该试剂盒抗体确实与这一交叉反应因子存在交叉反应，如FSH在结构上与另外3种激素仅仅是α亚单位上个别氨基酸的不同，其特征抗体与其它位点有一定程度的结合的可能性是存在的，这种非特异结合被限制在一定范围内是可以接受的。

在另一方面，如果选择的交叉反应对照物中含有少量的被测物，如：欲考察FSH试剂盒对LH的交叉反应，选择的LH抗原中含有少量的FSH，高浓度的这种抗原在FSH试剂盒中的测量结果很可能高于所期待的结果，应充分认识到这种结果并不是由于FSH抗体的交叉反应引起的。

因此，当交叉反应的测量结果高于我们期待的结果时，可以选择另一来源的交叉反应对照物重新测试，以排除由于抗原不纯而引起的对该试剂盒抗体交叉反应的误解。

1.2.4 交叉反应物对测定结果的影响：多大的交叉反应是可能接受的，主要取决于被测物和交叉反应物在人体内的相对含量。

如3，5，3’ -三碘甲腺原氨酸(Triindonhyroxine，T3)和甲状腺素(Thyroxine，T4)，因为血清中T4的含量是T3的近千倍，所以对于测量T4的试剂盒而言，与T3存在10%以下的交叉反应率都不会影响T4的测定，而如果对于测量T3的试剂盒而言，即使与T4存在1%的交叉反应率，都会严重影响T3的测定。

1.2.5 其它影响因素：评价试剂盒时还应注意其它因素，如：溶血、高血脂、抗凝剂、其它药物、异嗜性抗体及自身免疫性疾病患者等对样本测定结果的影响，这种影响对不同方法、不同检测项目的影响程度是不一样的，应逐一充分认识。

此部分内容可放入抗干扰能力。

1.3 剂量－反应曲线建立定量标记免疫分析的最主要特征就是建立剂量－反应曲线，通过已知浓度的校准物质（自变量，X）和相应的反应量（因变量，Y）建立剂量－反应关系，并同时测量待测品，通过待测样品的反应量（Y'），计算出未知样品的浓度（X'），因此，这种剂量－反应关系需要有良好的相关性，即统计学上的“相关系数（r）”（coefficient correlation），当相关系数越趋近于1时，表明剂量－反应关系越密切。

建立剂量－反应曲线时应注意：1.3.1 选择适当的数学模型拟合如前所述，在评价试剂盒时，我们通常用双对数（适用于非竞争性双位点夹心法标记免疫分析）数学模型和log-logit（适用于竞争法标记免疫分析）数学模型。

一般认为，经适当的函数转换后的标记免疫分析的剂量－反应相关系数或其绝对值（r或|r|）应不低于0.9900。

1.3.1.1 双对数数学模型：顾名思义，双对数数学模型因函数自变量（剂量）和因变量（反应量）都经对数转换而得名。

自然对数和常用对数对剂量－反应曲线的影响仅仅在于截距（A）的不同，通常我们取自然对数：lnY=A+B*lnX。

大量的经验表明：多数夹心法标记免疫分析（特别是微量或超微量分析，小于10－9克）经双对数函数转换后，相关系数都能大于0.9900；对于微克级的被测物，选择半对数函数有时能得到更好的相关系数。

1.3.1.2 log-logit数学模型：经验表明，对于抑制法标记免疫分析，log-logit数学模型因其计算方法相对简单，且大多数情况下可以得到较好的相关性，因此是评价这类试剂盒的首选数学模型。

方程式：logit Y = A + B*log X，式中：logit Y =B/B0 /( 1－B/B0)对于这类试剂盒，还应要求有效剂量值（ED25、ED50、ED75或ED20、ED50、ED80）应在剂量－反应曲线最高浓度点和最低浓度点之间，即25%（或20%）结合率（B/B0%）所对应的剂量浓度点应小于曲线最高剂量点，75%或（80%）结合率（B/B0%）所对应的剂量浓度点应大于曲线最低剂量点，使曲线在规定的剂量范围内有足够的落差。

1.3.2 标记免疫分析在选择了特异抗体对特异抗原的特定识别以后，剂量－反应曲线在适当浓度的抗原、抗体配伍下，在一定范围内，应呈现良好的相关性，相关系数或其绝对值（r或|r|）应不低于0.9900。

否则应从如下几个方面考虑：①抗体的浓度是否与抗原浓度相适应；②选择的剂量范围是否合适；③选择的函数方程是否合适。

1.4 精密度评价精密度是考察试剂盒对同一样本重复测定时能否得到相同实验结果的能力的指标，通常用重复多次样本测量结果的变异系数（CV%）表示，精密度评价是质量控制的重要内容。

1.4.1 分析内(intra assay)精密度：同一次实验内（同一块微孔板上或实验条件完全相同的情况下）同一样本（如：质控血清）重复测定（n≥10），测定结果的变异系数(CV%）应不高于10.0%。

分析内精密度的变化或异常升高，应从方法学改进、实验室条件改变、操作失当等方面排查原因。

1.4.2 分析间(inter assay)精密度：分析间精密度涵盖的内容非常广泛，至少应包含入下内容：同一试剂盒，不同批次之间；同一试剂盒，同一批次，不同实验室之间；同一试剂盒，同一批次，同一实验室，不同操作者之间；同一试剂盒，同一批次，同一操作者，有效期内不同时间之间等。

不同层次的分析间精密度的意义不尽相同，在评价试剂盒质量时应引起质量控制工作者的足够认识。

评价分析间精密度时，同一样本（如：质控血清）在上述条件下重复测定（一般n≥10），测定结果的变异系数（CV%）应不高于15.0%。

1.5 准确性评价准确性评价通常指测量结果趋近于真值的程度。

但是，正如我们所认识到的，对于标记免疫分析，特别是具有多种同形异构体的大分子物质而言，目前的分析方法还很难得到真值，因此，还没有真正意义上的“准确性评价”方法，目前通常是通过标准品核对实验或回收率实验进行考察。

1.5.1 标准品核对实验：试剂盒内校准品与相应浓度的国际或国家标准品同时进行分析测定，要求两条剂量－反应曲线不显著偏离平行（t测验），以国际或国家标准品为对照品，试剂盒内校准品的实测效价与标示效价之比应在0.900～1.100之间。

标准品核对实验应注意：①配制国际或国家标准品的稀释液应与试剂盒校准物质稀释液相同，以保证两条剂量－反应曲线在相同反应体系下反应；②配制国际或国家标准品的浓度范围应与试剂盒校准物质实际浓度范围相当，以保证反应能在试剂盒工作范围内进行。

1.5.2 回收率实验1.5.2.1 添加回收率：选择经纯化、分析过的，性能稳定的已知高浓度的抗原定量加入低浓度被测样本中，并进行分析测定，测定结果与已知理论浓度相比较，应在90.0%～110.0%范围内。

1.5.2.2 稀释回收率：同样选择经纯化、分析过的，性能稳定的已知高浓度的抗原，按照一定比例稀释成系列溶液，并与试剂盒剂量－反应曲线同时测定，高浓度抗原系列与剂量－反应曲线相比较，应不显著偏离平行（t测验），效价比应在0.900～1.100之间。

添加抗原溶液和稀释液同样应与试剂盒校准物质稀释液相同，以保证反应在相同体系下进行。

注意：至少配制3个不同浓度添加到空白中的测试物，每一浓度配制2份样品，每1次试验对6份样品重复测定3次，比较测定值和真实值求出回收率（%），即偏差。

1.6 检测范围（range）剂量-反应曲线的工作范围(working range)是指能达到一定精密度、准确性和直线性时，测定方法适用的高低限度或量的区间，应使其最精密的部分即曲线斜率最大的部分适合于临床试验测定需要的范围。

它既可以包括全部正常范围(适合于高于和低于这个数值均有诊断意义的物质，如血清胰岛素、地高辛测定)，也可以在正常范围的一端(即低于或者高于这个数值，不是两者均有诊断意义的物质，前者如血清雄烯二酮测定，后者如血清肿瘤标志物分析)。

1.7 高剂量钩变效应（HOOK效应）当标本中被测物浓度超过线性范围上界时，所得结果反而降低或呈阴性，这种现象被形象地称为高剂量钩变效应（HD-hook effect）。

由Miles等于1974年用双位点IRMA测血清铁蛋白时发现。

产生这种现象的原因可以归纳为：在一步法试剂盒中是由于大量过剩抗原与被捕获抗原竞争结合限量的标记二抗，二步法试剂盒与抗原的“质”（表位数量及其重复表达数量）有关。

固相捕捉抗体过量或有重复表达表位的抗原，呈饱和结合，标记二抗与抗原交叉重叠结合，产生立体效应，使抗原“异构”，与一抗的亲和力减弱。

洗涤时，标记二抗体与抗原形成的复合物自固相脱离。

用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩变效应的发生。

使用时，可以将这些样本进行稀释，使其测量结果落在剂量－反应曲线内，这一测量结果与稀释倍数的乘积即为该样本的原始浓度。

1.8 稳定性评价试剂盒在有效期内，在规定的条件下保存应保持稳定，各项性能指标应符合质量标准要求。