中国药典-2019年版仪器分析方法应对

15
例：离子色谱（氯膦酸二钠）
照离子色谱法（附录Ⅴ J） 试验
用阴离子交换色谱柱或效能 相当），柱温30℃，
以水为流动相A，以0.1mol/L 氢氧化钾溶液为流动相B，梯 度洗脱，流速为1.2 ml/min。
检测器为电导检测器，检测 方式为抑制电导检测。
用于氯膦酸二钠原料药的有关物质与制剂的含量测定
HPLC法
2019年版
530 0
142
24 4 315 165 107 216 359
2019年版
580 73
707
97 45 414 219 132 372 694
4
色谱法在2019年版药典的应用
柱色谱 纸色谱 薄层色谱 气相色谱
• 高效液相色谱 • 离子色谱
正相色谱 反相色谱 离子对色谱
抑肽酶
亲水的改性硅胶，高分子蛋白质
注射用抑肽酶
亲水的改性硅胶，高分子蛋白质
乌司他丁
亲水改性硅胶，有关物质
乌司他丁溶液
亲水改性硅胶，有关物质
胰岛素
亲水改性硅胶，高分子蛋白质
中性胰岛素注射液
亲水改性硅胶，高分子蛋白质
精蛋白锌胰岛素注射液
亲水改性硅胶，高分子蛋白质
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2019版药典二部采用高效凝胶色谱的品种
注射用头孢替唑钠
头孢噻吩钠 注射用头孢噻吩钠 头孢噻肟钠 注射用头孢噻肟钠 阿洛西林钠 注射用阿洛西林钠 普鲁卡因青霉素 注射用普鲁卡因青霉素
阿莫西林 阿莫西林胶囊 青霉素V钾 青霉素V钾胶囊 青霉素钠
注射用青霉素钠
青霉素钾 注射用青霉素钾 苯唑西林钠 注射用苯唑西林钠 美洛西林钠 注射用美洛西林钠 磺苄西林钠 注射用磺苄西林钠
球形硅胶。
90年代早期，粒径为 5 µm 的高纯硅胶，即所谓的 B 型硅胶被发展，并成为
这个行业填料的标准，这种 B 型硅胶含有微量的金属。
90年代后期，为了满足快速分离的需求，发展了 3 µm 或 3.5 µm 的球形硅胶，
其作用和性能逐渐的获得了人们的认同和接受。手性色谱柱的开发。
21世纪早期，为适应超快速的分离要求，粒径小于 2 µm 的填料被开发出来，
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2019版药典二部采用高效凝胶色谱的品种
门冬酰胺酶（埃希）
分子量5000~60000色谱亲水改性硅胶,UV,纯度
门冬酰胺酶（欧文）
分子量5000~60000色谱亲水改性硅胶,UV,纯度
注射用门冬酰胺酶（埃希） 分子量5000~60000色谱亲水改性硅胶,UV,纯度
注射用门冬酰胺酶（欧文） 分子量5000~60000色谱亲水改性硅胶,UV,纯度
发展出了整体柱、无机和有机杂化硅胶。
目前，市场上流行的分析用的 HPLC 硅胶基质填料主要为 B 型硅胶。
填料发展史
9
色谱法的应用：高效液相色谱
填料发展史
10
色谱法的应用：高效液相色谱
2019版药典二部中色谱柱的使用情况
色谱柱类型 品种数
C18柱 C8柱 氰基柱 硅胶柱 苯基柱
1210个 93个 21个 31个 9个
20
色谱法的应用：电泳及毛细管电泳法
2019版药典二部采用电泳法的品种
乌司他丁 乌司他丁溶液 肝素钠乳膏
还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶，分子量 还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶，分子量 鉴别（琼脂糖电泳）
2019版药典二部采用CE的品种
盐酸头孢吡肟 注射用盐酸头孢吡肟 抑肽酶 注射用抑肽酶
有关物质 有关物质 有关物质 有关物质
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色谱法的应用：凝胶色谱法
固定相是有一定孔径的多孔性填料，流动相是可以溶解样 品的溶剂。小分子量的化合物可以进入孔中，滞留时间长； 大分子量的化合物不能进入孔中，直接随流动相流出。
它利用分子筛对分子量大小不同的各组分排阻能力的差异 而完成分离。
常用于分离高分子化合物，如多糖、多肽、蛋白质、核酸 等。
色谱柱类型 氨基柱 丁基柱
三甲基硅烷柱 二羟基丙基硅烷键合
硅胶柱
苯乙烯-二乙烯基柱
品种数 5个 3个 2个 1个
1个
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色谱法的应用：高效液相色谱
缬沙坦 盐酸帕罗西汀
a-酸性糖蛋白柱
瑞格列奈 瑞格列奈片
手性色谱柱α1酸性蛋白柱
苯磺酸顺阿曲库铵 注射用苯磺酸顺阿曲库铵 手性色谱柱chiralcel OD-RH
检测器类型
品种个数
紫外检测器
1333个
蒸发光散射检测器
28个
示差检测器
10个
电导检测器
5个
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色谱法的应用：蒸发光散射检测器
优点： 适用于没有特征紫外吸收或紫外吸收很弱的待测物，使用UV时
灵敏度更低；无需衍生化而直接测定，避免了衍生带来的误差。 可以应用有强紫外吸收的试剂，如氯仿、丙酮等。 适用于组分复杂样品的分析，可以进行梯度洗脱，基线平稳。 通用型检测器，只要待测物挥发性低于溶剂，即可适用。对不
《中国药典》2019年版 新仪器分析方法应对
李志伟
1
现代分析技术的应用进一步扩大
红外光谱 原料药、制剂
气相色谱 残留溶剂
HPLC 检测器
分析技术
毛细管电泳
总有机碳测定法 （TOC）
离子色谱
2
《中国药典》2019年版一部新修订项目
项目 类别
鉴别
检查
特
含量测定
征
重金
显微
TLC
HP LC
GC
理化
通则
属有 毒性 其 害元 成分 他
素
或 指 纹 图 谱
HPL C
TL CS
UV
GC
其 他
中成
10版 新增
259
1818
25
9
54 426
8
32
16 2
6
709 12 8 24 1
药
05版 收载
281
1144
11
16 102 627
8
10 90 1
321 33 16 19 4
10版
提取 新增
物 05版
收载
21 3 2 5 1 11
50 16 17
22
23
24
25
Minutes
供试品毛细管电泳谱图（杭州澳亚生物技术有限公司生产，批号：071015）
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例：毛细管电泳（抑肽酶）
编号
1 2 3 4 5 6 7 Sigma对照品 标准规定
去丙氨酸-去甘氨酸抑肽酶（%）
6.9
上海所结果
去丙氨酸-抑肽 酶（%）
面积归一化法计算抑肽酶 主峰含量（%）
6.2
21
AU
例：毛细管电泳（抑肽酶）
0.008 0.006 0.004 0.002 0.000 -0.002 -0.004 -0.006
15
1：保留时间为18.417分钟的是去丙氨酸-去甘氨酸-抑肽酶， 2：保留时间为18.617分钟的是去丙氨酸-抑肽酶， 3：保留时间为18.829分钟的是抑肽酶峰
18.829
63.6
6.9
6.7
83.0
7.0
6.2
84.3
7.7
6.0
81.4
5.8
4.3
15.2
4.3
4.8
14.8
5.2
4.3
14.3
6.2
6.9
81.5
8.0%
7.5%
/
24
色谱法的应用：毛细管电泳
分离模式 毛细管区带电泳CZE 胶束电动毛细管色谱MEKC 毛细管等电聚焦CIEF 毛细管凝胶电泳CGE 毛细管电色谱CEC
高分子化合物的分析 手性化合物的分析
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色谱法的应用：液相色谱常用检测器
光学检测器：紫外、荧光、示差折光、蒸发光散射（通 用型检测器）
电化学检测器：极谱、库仑、安培 电学检测器：电导、介电常数 质谱检测器 选择性检测器：灵敏度较高
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色谱法的应用：液相色谱常用检测器
2019版药典二部采用检测器情况
18.417 18.617
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
Minutes
sigma抑肽酶对照品毛细管电泳谱图
22
例：毛细管电泳（抑肽酶）
0.008
0.006
0.004
0.002
18.792
AU
0.000
-0.002
18.354 18.554
-0.004
-0.006
15
16
17
18
19
20
21
•离子交换色谱法主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸等离子型化合物的分离。
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色谱法的应用：离子色谱
阳离子交换柱 山梨醇及制剂 甘油果糖氯化钠注射液 甘露醇及制剂 利巴韦林及制剂 盐酸二甲双胍及制剂 苹果酸及制剂 富马酸及制剂
阴离子交换柱
肝素钠及制剂 帕米磷酸二钠及制剂 氯膦酸二钠及制剂 硫酸软骨素钠及制剂
硅胶G
254个品种
硅胶G254
148个品种
硅胶H
15个品种
硅胶HF254
12个品种
硅藻土
2个品种
微晶纤维素
3个品种
氧化铝
1个品种
7
色谱法的应用：气相色谱
进样方式 直接进样 顶空进样
品种数量 75个 112个
检测方式 FID ECD
品种数量 181个 6个
ECD
伊曲康唑 联苯苄唑 恩氟烷 林旦乳膏 林旦 异氟烷
合计
05版 收载
620
1507
பைடு நூலகம்
16
16 298 1363 37
28
21 7
1
505 47 37 31 34
3
2019年版二部与2019年版药典主要项目收载情况比对表
增修订项目
红外光谱鉴别
原料 制剂
有关物质
HPLC方法
残留溶剂 渗透压摩尔浓度 溶出度或释放度 含量均匀度 无菌检查方法 细菌内毒素 含量测定
右旋糖酐20 右旋糖酐20葡萄糖注射液 右旋糖酐20氯化钠注射液 右旋糖酐40 右旋糖酐40葡萄糖注射液 右旋糖酐40氯化钠注射液 右旋糖酐70 右旋糖酐70葡萄糖注射液 右旋糖酐70氯化钠注射液 右旋糖酐铁 右旋糖酐铁注射液 头孢地嗪钠 注射用头孢地嗪钠
亲水性球形高聚物，分子量与分子量分布 亲水性球形高聚物，分子量与分子量分布 亲水性球形高聚物，分子量与分子量分布 亲水性球形高聚物，分子量与分子量分布 亲水性球形高聚物，分子量与分子量分布 亲水性球形高聚物，分子量与分子量分布 亲水性球形高聚物，分子量与分子量分布 亲水性球形高聚物，分子量与分子量分布 亲水性球形高聚物，分子量与分子量分布 亲水性球形高聚物，分子量与分子量分布 亲水性球形高聚物，分子量与分子量分布 球状蛋白色谱用亲水硅胶（分子量1000~10000），有关物质 球状蛋白色谱用亲水硅胶（分子量1000~10000），有关物质
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色谱法的应用：离子色谱
基本原理
离子色谱中发生的基本过程就是离子交换，
因此，离子色谱本质上就是离子交换色谱。 色谱柱类型
在离子色谱的基本组成中，重要的和与其 他高效液相色谱不同的就是抑制器和电导 检测器，离子色谱用的泵是PEEK材料衬里的不
阳离子交换柱 阴离子交换柱
锈钢泵。
品种个数 23个 14个
响雾化过程。 被分析物的浓度和体积质量决定了进入光散射池的气溶胶
甲氨蝶呤
甲氨蝶呤片
牛血清白蛋白键合硅胶柱
注射用甲氨蝶呤
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色谱法的应用：高效液相色谱
2019版药典主要修订项目
1、色谱柱 （1）常用色谱柱填料粒径3～10μm （2）微径柱填料粒径 约2μm（UPLC或UFLC） 硬件须匹配 色谱条件可适当调整 以品种正文规定条件的测定结果为准
2、柱温 （1）通常为室温 （2）以硅胶为载体的普通色谱柱，最高使用温度不得超过60℃，（HTLC）
同物质，ELSD相应因子的变化比其它检测器要小得多。 对环境影响不灵敏，室温下即可操作。 没有溶剂前缘峰，适用于保留时间短的物质的检测。 与LC-MS的色谱条件一致，可直接进行方法转换。
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色谱法的应用：蒸发光散射检测器
影响ELSD响应的因素 载气流速、雾化器设计与温度、流动相的组成和流速等影
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2019版药典二部采用常压凝胶色谱的品种
常压凝胶色谱
头孢尼西钠 注射用头孢尼西钠 头孢他啶 注射用头孢他定
头孢曲松钠
注射用头孢曲松钠
头孢呋辛钠 注射用头孢呋辛钠 头孢拉定 头孢哌酮钠 注射用头孢哌酮钠 氯唑西林钠 注射用氯唑西林钠
头孢唑肟钠 注射用头孢唑肟钠 头孢唑林钠 注射用头孢唑林钠
头孢替唑钠
7
16
17 10 12 1 56
9 115
中药
10版 新增
374
526
3
材
05版 收载
339
347
5
2 26 1127 12 14 31 179 726 17 17 71
412 3 17 9 34 175 13 20 7 30
10版 新增
633
2492
31
12 134 1554
31
40
24 3
22
1138 15 25 16 32
• 凝胶色谱
• 毛细管电泳
5
色谱法的应用：纸色谱
纸色谱的基本原理-分配色谱 固定相-吸附在滤纸上的水 移动相-展开剂 样品在水和展开剂中的溶解度不同，故分
配不同而达到分离。例：盐酸苯乙双胍
6
色谱法的应用：薄层色谱
2019版药典（二部）采用TLC的品种数量，共435个
TLC
品种数量
检查项目 残留溶剂 残留溶剂 残留溶剂，有关物质 含量，六六六 六六六 残留溶剂，有关物质
8
色谱法的应用：高效液相色谱
20世纪70年代中期，HPLC仪开始出现，主要填料：10 µm 的无定型硅胶颗粒。 70年代后期，发展了反相液相色谱。 80年代，HPLC 被广泛应用于化合物的分离，主要填料：粒径为5 ～ 10 µm