肺炎链球菌检验
肺炎链球菌检测-菌落形态鉴定 Colony Morphology Test
中国疾病预防控制中心 传染病预防控制所呼吸道传染病室
肺炎链球菌相关实验技术操作手册
菌落形态鉴定
（Colony Morphology Test ）
试验开始前，请准备：
哥伦比亚血琼脂平板于室温下平衡至少20min。
试验步骤：
1.将疑似标本以三区划线方式接种于哥伦比亚血琼脂平板上。
℃2条件下培养18-20h。
2.35 5%CO
3.挑取疑似菌落，典型菌落形态：脐窝状，灰白色，半透明，草绿色溶菌环。
常见肺炎链球菌菌落形态：草绿色溶血环，灰白色、表面光滑、扁平的可疑菌落；或草绿色溶血环，中央塌陷、边缘隆起、呈脐窝状的可疑菌落；或草绿色溶血环，表面光滑、湿润有粘液的可疑菌落。
4.挑取单个疑似肺炎链球菌菌落，接种于哥伦比亚血琼脂平板上，35℃条件下
培养18-20h。
5.进行其他肺炎链球菌特异性鉴定。
将菌落形态观察结果及时添加至
Streptococcus pneumoniae isolates data bank。
本手册仅供实验室内部使用 2011年第1
版。
肺炎链球菌检测-革兰氏染色 Gram Stain
染色部位。 10.滴加 50µl 蕃红染色液，室温下静置 2 分钟后，蒸馏水冲洗载玻片，用吸水纸
吸去多余水分。不要让水流直接冲洗载玻片上染色部位。 11.镜检。100X 油镜下观察，肺炎链球菌革兰氏染色阳性，呈矛头状，常成对或
中国疾病预防控制中心
传染病预防控制所呼吸道传染病室
肺炎链球菌相关实验技术操作手册
革兰氏染色
（Gram Stain）
试验步骤： 1. 用移液器在载玻片上滴加 50µl 生理盐水或 PBS buffer。 2. 用无菌取菌环挑取可疑单个菌落溶于步骤 1 的液体中，制成均匀菌悬液。 3. 晾干载玻片。载玻片上的菌液必须完全干燥，才能进行下列操作。 4. 滴加 50µl 结晶紫溶液于载玻片上菌液干燥处，室温下静置 1min。 5. 蒸馏水冲洗载玻片。不要让水流直接冲洗载玻片上染色部位。 6. 滴加 50µl 碘液于染色处，室温下静置 1min。 7. 蒸馏水冲洗载玻片，用吸水纸吸去多余水分。不要让水流直接冲洗载玻片上
成短链排列。
图中箭头处为肺炎链球菌革兰氏染色后镜下观察结果。Leabharlann 本手册仅供实验室内部使用 版
2011 年第 1
肺炎链球菌活菌数含量的测定操作规程
肺炎链球菌活菌数含量的测定操作规程1.引言肺炎链球菌是一种常见的呼吸道病原微生物，对于疾病的防控具有重要意义。
测定肺炎链球菌的活菌数含量是判断疾病传播性和临床治疗效果的重要指标。
本文档旨在规范肺炎链球菌活菌数含量的测定操作，确保测定结果的准确性和可靠性。
2.实验所需材料肺炎链球菌培养基冰箱分装管微量移液管、移液器和吸头显微镜细菌计数板和计数室3.实验步骤1.取一小瓶肺炎链球菌培养基放置于冰箱中冷藏，保持4℃。
2.取适量肺炎链球菌培养基，分装于无菌分装管中，避免反复冻融，可存放在-20℃的冰箱内长期保存。
3.取一支肺炎链球菌分离菌株，用无菌吸头取适量细菌液，接种于肺炎链球菌培养基中。
4.将接种好的培养基放置于恒温摇床中，在37℃恒温箱中培养24小时。
5.取培养好的细菌液，用无菌吸头吸取适量的细菌悬液，放置在显微镜片上。
6.用显微镜观察细菌悬液中的活菌，计数并记录。
7.将细菌计数板放置在计数室中，将观察到的活菌在计数板上记录。
4.实验注意事项所用材料必须无菌，以防止其他微生物的污染。
活菌的计数应在24小时内完成。
活菌数的检测应重复3次并取平均值。
实验环境应保持洁净，避免灰尘和其他污染物对实验结果造成干扰。
5.结果记录与分析根据实验步骤所得的数据，计算平均活菌数含量，并记录在实验数据表中。
通过对不同样本的活菌数进行比较和分析，可以了解肺炎链球菌的传播程度和感染风险。
6.结论本操作规程提供了一种测定肺炎链球菌活菌数含量的标准化方法，经过验证具备准确性和可靠性。
科学使用本操作规程可以为疾病的早期预防和传播控制提供重要的实验数据支持。
注意：本操作规程仅供参考，具体实施过程请根据实验条件和要求进行调整。
肺炎链球菌鉴定流程
肺炎链球菌鉴定流程肺炎链球菌（肺炎链球菌属）是导致人类社区获得性肺炎（CAP）最常见的病原体之一。
准确鉴定肺炎链球菌对于指导适当的抗菌治疗和监测抗菌剂耐药性的出现至关重要。
该鉴定过程涉及多个步骤，包括：革兰氏染色：革兰氏染色是鉴定肺炎链球菌的第一步，因为它是一种革兰氏阳性球菌，通常成链状排列。
形态学检查：通过显微镜检查革兰氏阳性标本，可以观察到肺炎链球菌的典型的链球菌形态。
链条的长度和排列模式可能因菌株而异。
荚膜染色：肺炎链球菌具有多糖荚膜，可通过荚膜染色技术（例如，奎肯斯泰特染色）显现出来。
荚膜的存在是肺炎链球菌鉴定的关键特征。
血清学检测：血清学检测，如奎肯斯泰特试验，可用于确定肺炎链球菌的荚膜血清型。
肺炎链球菌的荚膜由不同的血清型组成，每种血清型与不同的抗原性决定簇（PSA）相关。
生物化学测试：多种生物化学测试可用于确认肺炎链球菌的鉴别，包括：溶血反应：肺炎链球菌通常在绵羊红细胞琼脂平板上显示β溶血反应。
胆盐耐受性：肺炎链球菌可耐受高浓度的胆汁盐，这是区分其与其他链球菌的重要特征。
尿素酶活性：肺炎链球菌通常产生尿素酶，可水解尿素。
分子诊断：分子诊断方法，如聚合酶链反应（PCR），可用于快速鉴定肺炎链球菌，尤其是在培养困难的情况下。
PCR检测靶向肺炎链球菌基因，如lytA或cpsA。
抗菌剂敏感性测试：进行抗菌剂敏感性测试对于指导针对肺炎链球菌的适当治疗至关重要。
通常使用琼脂稀释法或扩散法来确定肺炎链球菌对各种抗菌剂的敏感性。
鉴定肺炎链球菌的流程通常涉及以下步骤：1. 革兰氏染色：确定标本中是否存在革兰氏阳性球菌。
2. 形态学检查：观察革兰氏阳性球菌的链球菌形态。
3. 荚膜染色：显示肺炎链球菌荚膜的存在。
4. 血清学检测：确定肺炎链球菌的荚膜血清型。
5. 生物化学测试：进行溶血反应、胆盐耐受性和尿素酶活性测试以确认鉴别。
6. 分子诊断：如有必要，进行PCR检测以快速鉴定肺炎链球菌。
7. 抗菌剂敏感性测试：确定肺炎链球菌对各种抗菌剂的敏感性。
肺炎链球菌检测-奥普托欣试验 Optochin Test
中国疾病预防控制中心 传染病预防控制所呼吸道传染病室
肺炎链球菌相关实验技术操作手册
奥普托欣敏感性检测
（Optochin Test）
试验开始前，请准备：
MH血琼脂平板于室温下平衡至少20min。
试验步骤：
1.取新鲜培养的肺炎链球菌，以0.85%NaCl溶液配制0.5 麦氏单位菌悬液。
2.用无菌棉签蘸取菌悬液均匀涂抹于MH血琼脂平板培养基上；涂抹方向每次
旋转60°，均匀涂抹3次。
3.涂抹后的平板室温下放置10min；用镊子夹取，在培养基中央贴放奥普托欣
（Optochin）纸片一片。
在平板背侧标记菌株编号、试验时间“年年年年-月月-日日”
4.将培养基放置于5% CO2，35℃条件下培养18h-20h。
5.用游标卡尺测量抑菌环直径，抑菌环直径≥14mm为敏感。
将试验结果及时
添加至Streptococcus pneumoniae isolates data bank。
图片左侧为奥普托欣检测阳性，右侧为阴性。
Reference
*Laboratory Menthods for the Diagnosis of Meningitis. WHO/CDS/CSR/EDC/99.7.
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肺炎链球菌检验
3
生物标记物发现
质谱技术可以发现与肺炎链球菌感染相关的生物 标记物，有助于疾病的早期诊断和预后评估。
生物信息学在肺炎链球菌检验中的应用
数据整合与分析
01
生物信息学可以对来自不同实验平台的数据进行整合和分析，
挖掘肺炎链球菌感染相关的生物标志物和药物靶点。
药物设计
02
基于生物信息学方法，可以预测和设计针对肺炎链球菌的新型
兼性厌氧菌
肺炎链球菌为兼性厌氧菌，在 有氧或无氧环境下均能生长。
营养要求高
肺炎链球菌对营养要求较高， 需要丰富的铁、维生素B等才
能正常生长。
肺炎链球菌的致病性
01
02
03
致病物质
肺炎链球菌主要通过产生 毒素和酶致病，如荚膜多 糖、溶血素等。
感染途径
感染主要通过呼吸道飞沫 传播，也可通过接触污染 物品传播。
设备和专业操作。
药敏试验
总结词
药敏试验用于检测肺炎链球菌对抗菌药物的敏感性和耐药性，指导临床合理用药。
详细描述
药敏试验通过在培养基上接种肺炎链球菌，并添加不同抗菌药物，观察细菌的生长情况，从而判断细菌对抗菌药 物的敏感性和耐药性。药敏试验对于临床医生选择合适的抗菌药物具有重要意义，能够指导临床合理用药，提高 治疗效果并减少耐药性的产生。
疾病类型
感染后可引起大叶肺炎、 脑膜炎、中耳炎等多种疾 病。
肺炎链球菌的流行病学
季节性流行
肺炎链球菌感染有明显的 季节性，冬季和春季是高 发季节。
人群易感性
儿童、老年人、身体虚弱 者及免疫功能低下者易感。
地区分布
全球范围内均有肺炎链球 菌感染的报道，但发病率 和病死率存在地区差异。
02
肺炎链球菌的检验技术探析
肺炎链球菌的检验技术探析作者：田贺宁赵莹来源：《医学信息》2016年第23期摘要：肺炎链球菌临床上容易引起大叶性肺炎，对人体造成较大的危害，特别是有荚膜的肺炎球菌可以抵抗吞噬细胞的吞噬，细菌可以在寄主体内大量繁殖。
而由于临床长期药物使用的不规范，造成了肺炎链球菌的耐药性变化，致使多种药物治疗效果降低或无效，临床对肺炎链球菌检验主要为明确肺炎链球菌的类型，并依据不同的类型进行治疗的数据支持，意义重大。
本次研究主要为肺炎链球菌的检验技术和进展分析，探讨近年来肺炎链球菌检验方法和手段，并对肺炎链球菌的耐药性和分子流行病学的研究方法进行总结，具有一定的临床参考意义。
关键词：肺炎链球菌；检验技术；进展；耐药性分析肺炎链球菌（Setrt Pococcuspneumoinae）简称肺炎球菌，是1881年首次由巴斯德及G.M.Stembegr分别在法国和美国分离出来。
肺炎球菌菌体似矛头，呈短链状排列或成双排列的球菌，革兰氏阳性，绝大多数兼性厌氧，偶有专性厌氧，肺炎链球菌的主要致病物质是肺炎球菌溶血素和荚膜[1]。
近年来，越来越多的国家和地区出现耐药性肺炎链球菌菌株的报道，严重威胁着肺链感染的临床治疗，已成为一个呛待解决的健康问题。
1药敏试验1.1微量稀释法该法是美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）推荐的肺炎链球菌药敏试验的参考方法。
该法主要使用经过离子校正的M-H肉汤+2%～5%的溶血马血作为培养基的，然后将抗生素稀释后加人培养基中。
将在羊血平板上的菌落制备菌液，以0.5 浊度分装微量板。
在35℃普通条件下培养24h后，人工判断结果。
具体 MIC见NCCLS的判定标准[2]。
1.2纸片扩散法 NCCLS推荐使用的纸片法药敏试验，主要使用羊血平板，以0.5浊度的菌液接种平板。
对于临床分离株的药敏试验，CO2是必备的环境。
平板应于35℃条件下在5%的CO2中培养24h后进行测量，从正面量取。
抑菌环的大小和质控标准详见NCCLS的规定。
肺炎链球菌的鉴定方法
肺炎链球菌的鉴定方法来源：检验医学网细菌学检验不仅对疾病的病原学诊断有重要价值，同时对临床治疗的药物选择也具有十分重要意义。
一、生物学性状肺炎链球菌革兰染色呈阳性。
球形或矛头状，成双排列，少呈链状。
在组织中可形成荚膜（人工培养荚膜逐渐消失），无鞭毛及芽孢。
2. 培养特点（1）培养基肺炎链球菌对营养要求较高，需采用质量好的哥伦比亚琼脂基础和新鲜血液（ 5％马血或羊血）。
琼脂浓度可适当下降至1％～1.2％，有利于肺炎链球菌的生长。
1）标本处理及时将采集标本接种到适当的培养基上是提高分离率的前提。
因为，肺炎链球菌对干燥、对寒冷的抵抗力均较弱，在标本离开机体暴露于外界复杂的环境中，其存活率十分低，不及时接种适当培养基是导致分离率低的主要原因。
2）选择性分离培养基培养基中添加5μg/ml庆大霉素有利于肺炎链球菌的分离。
3)培养环境5～10％CO2、35℃培养24～48h。
（3）肺炎链球菌的菌落形态在营养丰富的培养基上，肺炎链球菌形成扁平、中间有凹陷的典型菌落，少数菌可呈粘液型菌落。
3.抗原结构（1）种属特异性抗原：为菌体多糖抗原，存在于肺炎链球菌的细胞壁。
（2）型特异性抗原：是存在于肺炎链球菌荚膜中的一种多糖多聚体，可溶于水，据此抗原可将肺炎链球菌分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ……等个型，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型致病性最强。
（3）菌体核蛋白抗原：存在于菌体深部，为蛋白质，无特异性。
二、肺炎链球菌鉴定肺炎链球菌的鉴定，主要应与甲型溶血性链球菌鉴别。
其中以胆汁溶菌试验、菊糖发酵和optochin试验最为常用。
必要时可作小鼠毒力试验加以鉴别。
在上述试验中，肺炎链球菌均应阳性，而甲型溶血性链球菌为阴性。
必要时可用特异性单克隆乳胶或自动化仪器等相应鉴定卡作鉴定。
1. 溶血性检查肺炎链球菌在厌氧或二氧化碳环境中溶血能力大大加强，草绿色溶血环很大，可与其他草绿色链球菌相区别。
2. Optochin(OP)敏感试验optochin即乙基氢化叩卟啉，因结构似于奎宁，故又称为乙基氢化羟基奎宁。
肺炎链球菌检测讲解
国外感染情况
在美国，每年侵袭性SP感染的发生率为72103/10万儿童，而欧洲为10-24/10万儿童/年。 每年约有600多万例中耳炎由SP引起，占急性 中耳炎30-50％；在发展中国家，每年约有 500万5岁以下儿童死于SP引起的肺炎，10-50 万儿童死于SP引起的脑膜炎。（2005年）
2 配制PBS溶液，并分装小试管，每管约 0.5mL，用亚甲蓝粉配制0.1％的亚甲蓝试剂。
SP血清学分型步骤：
3 用接种环挑取经次代培养后的肺炎链球菌菌 落，放入小试管中，制成菌悬液约0.5麦氏单 位浓度。
4 用接种环挑取约10μL菌悬液放入载玻片上， 再挑取同量的诊断血清（10μl）放入载玻片上， 并与菌悬液搅拌混匀。
本地区耐药情况
对红霉素、四环素、复方新诺明、 克林霉素和氯霉素的多重耐药情况较为 严重，多重耐药发生率为75%，高于北 京、上海、杭州地区。
SP培养呼吸道标本的运输和保存
尽快送检，要求2h内送到；
肺炎链球菌延迟送检极有可能死亡，而且不适合4℃ 保存；
标本处理前检测是否合格。
痰标本合格的标准：
痰标本 鳞状上皮细胞 白血球 细菌种类
合格
<=10/低倍 >=10
1-3种
不合格 >=25/低倍 <=10
>3种
培养特性
初次分离需要CO2，采用CO2培养箱较好； 18-24h形成细小、圆形、湿润、自溶的菌落，
保存 挑选新鲜培养物置于保存管中，-76℃ 保存。
复活 取出保存管自然平衡至室温，接种适合 平板。
SP血清学分型：
肺炎链球菌的血清分型可以为肺炎链球菌疫苗 研究提供可靠依据，也是一种流行病学调查手 段。
肺炎链球菌的检测与分型技术
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The Ct value corresponding to the detection level of RT-
PCR and MRT-PCR for pneumococcal serotyping
Serotype
RT-PCT
MRT-PCR
Combined with other serotypes
年龄组, 岁
458例死亡。死亡率 >65岁: 7.55/100 000 < 1岁: 0.71 / 100 000
*覆盖2800万 (占美国人口9%)
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13
/ncidod/DBMD/abcs/survreports/spneu06.pdf
欧洲1985 – 2006年<2岁儿童侵袭性肺炎球菌疾 病发病（发表的研究）
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沒有感染者
帶菌者
发病者
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肺炎链球菌疾病负担
突破血脑屏障 肺炎球菌菌血症
脑膜炎 脑脊液渗漏
鼻窦炎
突破呼吸道粘 膜纤毛防御系 统
中耳炎 鼻咽部移殖
腹膜炎 关节炎等
突破吞噬细胞防御系统
肺炎
2020/11/14 Salyers AA, Whitt DD. In: Bacterial Pathogenesis: A Molecular Approach. 2nd ed. Washington, USA: 10 ASM Press; 1994. p. 322-31
12A
19F
6C
12B
20
7A
12F
21
7B
13
22A
肺炎链球菌的分离和鉴定
1.肺炎链球菌的耐药机制
青霉素G耐药肺炎链球菌（PRP）的耐药机制 是肺炎链球菌有6种青霉素结合蛋白（PBP）发 生改变，因为PBP1a/1b和PBP2a/2x/2b是β-内酰 胺类抗生素的作用靶位，改变后使PBP与青霉 素G的结合力下降；
青霉素G耐药肺炎链球菌（PRP）始发现于 1967年；
肺炎链球菌的分离和鉴定
卫生部北京医院
陈东科
精品PPT
概述
肺炎链球菌（S.pneumoniae），俗称 肺炎球菌（pneumococcus）。经常寄居于 正常人的鼻咽腔中，一般不致病，只形成 带菌状态。当机体免疫力下降时才致病。 尤其在呼吸道病毒感染后或婴幼儿、老年 体弱者易发生肺炎链球菌性肺部感染。
*d.不同菌株
精品PPT
三、肺炎链球菌的药敏试验
K-B法：采用Mueller-Hinton琼脂＋5％羊血 培养基。直接菌落悬液法(0.5麦氏单位菌液， 在15分钟内接种完)作为接种液。
稀释法：包括琼脂稀释法、肉汤稀释法和 Etest法。
培养条件：为35℃ 、5％CO2培养20～24小 时。质控菌株ATCC 49619。
精品PPT
2）选择性分离培养基
培养基中添加5μg/ml庆大霉素有利于肺炎链球 菌的分离。
精品PPT
3） 培养环境 5～10％CO2、35℃培养24～48h。
精品PPT
（3）肺炎链球菌的菌落形态 在营养丰富的培养基上，肺炎链球菌形
成扁平、中间有凹陷的典型菌落，少数 菌可呈粘液型菌落。
精品PPT
精品PPT
4.肺炎链球菌感染的治疗
青霉素G敏感均可直接用青霉素G进行治疗; 青霉素G中度耐药株可用大剂量青霉素G进
行治疗； 如重度耐药可选用三代头孢菌素加万古霉
肺炎链球菌分离与鉴定
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肺炎链球菌药敏报告（续1）
当苯唑西林抑菌圈≤19mm时应确定青霉素、头 孢 噻 肟 或 头 孢 曲 松 MICs ， 因 为 抑 菌 环 ≤ 19mm 可以发生在青霉素耐药、中介或敏感菌株中。
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肺炎链球菌药敏报告（续2）
当从血液或脑脊液中分离出肺炎链球菌，应常 规报告MICs。测定药物应包括青霉素、头孢噻 肟或头孢曲松、美罗培南和万古霉素。
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4.乳胶凝集试验
结果准确、快速、特异性高。
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5. 荚膜肿胀试验
取一滴抗血清及一滴菌悬液混匀，加少量
美蓝液混合后加盖片，室温10~20min后，用油
镜检查，如查到菌体呈兰色，周围绕有界限明
显未染色膨大空白圈为阳性。可用于肺炎链球
*d.不同菌株
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三、肺炎链球菌药敏试验
K-B法：采用Mueller-Hinton琼脂＋5％羊血 培养基。直接菌落悬液法(0.5麦氏单位菌液， 在15分钟内接种完)作为接种液。
稀释法：包括琼脂稀释法、肉汤稀释法和 Etest法。
培养条件：为35℃ 、5％CO2培养20～24小 时。质控菌株ATCC 49619。
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一、生物学性状
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1. 形态及染色
肺炎链球菌革兰染色呈阳性。球形或矛 头状，成双排列，少呈链状。在组织中 可形成荚膜（人工培养荚膜逐渐消失）， 无鞭毛及芽孢。
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2012+肺炎链球菌临床检验规程的共识
万方数据
万方数据
万方数据
万方数据
万方数据
万方数据
万方数据
肺炎链球菌临床检验规程的共识
作者：俞桑洁， 王辉， 沈叙庄， 倪语星， 王传清， 杨帆， 张泓， 朱德妹， 杨永弘
作者单位：俞桑洁,沈叙庄,杨永弘(100045,北京儿童医院儿科研究所微生物免疫室)， 王辉(北京大学人民医院检验科)， 倪语星(上海交通大学附属瑞金医院临床微生物科)， 王传清(复旦大学附属儿科医院检验科)， 杨帆
,朱德妹(复旦大学附属华山医院抗生素研究所)， 张泓(上海市儿童医院检验科)
刊名：
中华检验医学杂志
英文刊名：Chinese Journal of Laboratory Medicine
年，卷(期)：2012,35(12)
本文链接：/Periodical_zhyxjy201212003.aspx。
肺炎链球菌鉴定流程
肺炎链球菌鉴定流程肺炎链球菌是一种革兰阳性菌，可引起肺炎、脑膜炎和败血症等严重感染。
其识别需要准确可靠的实验室检测。
以下是肺炎链球菌鉴定的综合流程：显微镜检查：将疑似标本制成涂片，革兰染色。
在显微镜下观察革兰阳性球菌，通常呈卵圆形或兰氏链球菌排列。
培养和形态学特征：疑似标本接种于适当的培养基上，如血琼脂平板。
培养 24-48 小时，观察菌落形态、溶血性（α、β、γ）。
α溶血菌落周围出现绿色透明晕环。
生化反应：进行生化反应，如 katalase 试验、optochin 敏感性试验。
Katalase 阳性菌产生气泡，optochin 敏感菌在含 optochin 的培养基上生长受抑制。
抗原检测：利用免疫学方法检测肺炎链球菌荚膜多糖 (CPS) 抗原。
常见的技术包括乳胶凝集试验和酶联免疫吸附测定 (ELISA)。
不同血清型荚膜多糖抗原可用于区分不同的肺炎链球菌株。
分子检测：利用聚合酶链反应 (PCR) 等分子技术检测肺炎链球菌特异性基因。
PCR 可快速灵敏地检测出肺炎链球菌，即使在标本量少或菌载量低的情况下。
血清分型：根据肺炎链球菌荚膜多糖抗原的不同，将其分为 90 多种血清型。
血清分型对于流行病学调查和疫苗接种策略至关重要。
耐药性检测：检测肺炎链球菌对常用抗生素的耐药性。
常见的抗生素包括青霉素、头孢菌素和宏观内酯类。
耐药性检测结果指导临床治疗方案的选择。
综合解读：结合上述检测结果，综合解读以确定疑似标本中是否含有肺炎链球菌。
准确的鉴定有助于指导患者的管理和控制肺炎链球菌感染的传播。
优势和局限性：肺炎链球菌的鉴定流程提供了准确可靠的结果。
综合方法提高了检测的灵敏性和特异性。
分子检测技术在标本量少或难以培养的情况下尤为有用。
培养时间和抗生素耐药性检测结果的等待时间可能是局限性。
肺炎链球菌的微生物学检验方法与原理
肺炎链球菌的微生物学检验方法与原理肺炎链球菌（Setrt Pococcuspneumoinae）简称肺炎球菌，是1881年首次由巴斯德及G.M.Stembegr分别在法国和美国分离出来。
肺炎球菌菌体似矛头，呈短链状排列或成双排列的球菌，革兰氏阳性，绝大多数兼性厌氧，偶有专性厌氧，肺炎链球菌的主要致病物质是肺炎球菌溶血素和荚膜。
近年来，越来越多的国家和地区出现耐药性肺炎链球菌菌株的报道，严重威胁着肺链感染的临床治疗，已成为一个呛待解决的健康问题。
1、药敏试验1.1微量稀释法该法是美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）推荐的肺炎链球菌药敏试验的参考方法。
该法主要使用经过离子校正的M-H肉汤+2%～5%的溶血马血作为培养基的，然后将抗生素稀释后加人培养基中。
将在羊血平板上的菌落制备菌液，以0.5浊度分装微量板。
在35℃普通条件下培养24h后，人工判断结果。
具体MIC见NCCLS的判定标准。
1.2纸片扩散法NCCLS推荐使用的纸片法药敏试验，主要使用羊血平板，以0.5浊度的菌液接种平板。
对于临床分离株的药敏试验，CO2是必备的环境。
平板应于35℃条件下在5%的CO2中培养24h后进行测量，从正面量取。
抑菌环的大小和质控标准详见NCCLS的规定。
纸片扩散法的优点是简单方便，对非β-内酞胺药物的重复性、准确性均较高，但是在应用于青霉素和头抱类抗生素时准确性明显降低。
2、肺炎链球菌的耐药性检验目前有很多实验室在对血液、脑脊液等体液分离得到的肺炎链球菌耐药性测定时，只检测青霉素的耐药性。
事实证明，多重耐药和对三代头抱耐药的肺炎链球菌越来越多，因此，NCCLS已经明确要求，从脑膜炎者分离出来的肺炎链球菌必须做青霉素、头孢曲松或者头孢他啶的MIC，另外还应检测对万古霉素的耐药性。
对于中枢神经系统以外分离而来的肺链球菌，则首先应该选用苯唑西林来检测其是否对β-内酰胺类药物耐药。
若抑菌环>200mm，证明其对青霉素和β-内酞胺类药物敏感物耐药性；若抑菌环<19mm，则须进一步检测其对青霉素、头孢曲松或头孢他啶的耐药性。
肺炎链球菌检测
粘液性菌落
SP常见菌落
鉴定
Optochin（乙基羟化奎宁，奥普托新）敏感 （生长抑制）试验：在涂布细菌的血琼脂平板 上贴5μg的Optochin纸片，35℃有氧环境下过 夜，出现≥14mm的抑菌环为敏感，草绿色链球 菌仅小抑菌环或无抑菌环，肺炎链球菌有少数 菌株不敏感。 对疑似OP不敏感的肺炎链球菌可用胆汁溶菌 试验鉴定。
本地耐药情况趋势：
广东地区儿童PRSP低于匈牙利、韩国、 台湾，与香港接近，高于上海、北京， 表明广州地区儿童鼻咽部肺炎链球菌对 青霉素的耐药情况较为严重，且有上升 趋势，可能与滥用抗生素，使细菌产生 诱导性耐药有关，也可能由于青霉素不 敏感克隆株在国内的传播和蔓延。
本地区耐药情况
大环内脂类抗生素的耐药情况较为严重，其中红 霉素的耐药率达80.5%， 且多数为高度耐药， 其中59%的菌株MIC为256μg/ml，其耐药情况 与杭州地区的红霉素的耐药率90.1%、74%的 菌株MIC为256μg/ml比要低，大环内酯类抗生 素的广泛使用可能是造成其耐药率增加的重要 原因；
血清分型
丹麦Statens Serum Copenhagen公司产 pneumotest-kit 23价标准血清分型试剂盒； 原理：荚膜肿胀试验； 观察：相差显微镜观察最好，可以看到菌体周 围有一无色宽厚的环状荚膜。
血清分型
我们的做法：以亚甲蓝染色，普通显微镜可以 观察，菌体蓝色，周围有一圈着色较浅的宽的 荚膜。
SP培养呼吸道标本的采集
5.儿童以支气管镜抽吸为佳，肺泡灌洗液也不 错，或者用弯压舌板压舌，棉拭子伸入咽部取 样（临床医生操作）； 6.其他的经人工气道吸引分泌物、穿刺取样、 胃内取样均可以取得合格标本（临床医生操 作）。
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营养要求高，必须在含有血清或多种氨 基酸、无机盐的培养基上生长良好。
血平板：半透明，灰褐色，圆形，湿润 光滑露滴样菌落。
易自溶。
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巧克力平板，蓝灰色，半透明，光滑 湿润的菌落。
卵黄双抗（EPV）平板：为无色，光 滑湿润的菌落。
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Optochin敏感试验阳性：单个菌落涂于血 平板上，用optochin纸片贴于接种区中央， 35℃需氧培养过夜，抑菌圈 >18mm。
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4．抗原结构
荚膜多糖抗原：多糖抗原，型特异性，共85型，
Ⅰ~Ⅲ型引起大叶性肺炎。 菌体种属特异性抗原：多糖抗原，存在于细胞
兼性厌氧，C02 5-10%生长最好。 溶血性——菌落周围有草绿色溶血环。 液体培养基中培养24h，呈均匀混浊，
后期因产生自溶而变得澄清
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3．生化反应
可分解多种糖类，产酸不产气。 胆汁溶解试验阳性：加入胆汁或10%
去氧胆酸钠，37℃.，5-10min，激活 本菌的自溶酶，出现溶菌现象。
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3. 小鼠毒力试验 有毒力的菌株，接种后12-36h， 死亡。
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第四节
奈瑟菌属 （neisseria）
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为一群G-双球菌，严格寄生菌， 人是自然宿主
主要致病菌是脑膜炎球菌 ( merningococcus) 和 淋 病 球 菌 (gonorrhoeae)
血清肉汤：呈微混浊。
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3.生化反应
分解葡萄糖、麦芽糖 硝酸盐还原反应阴性，不分解尿素 氧化酶试验阳性
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4.抗原结构
可分9个血清群，对人致病的主 要试A群
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5．抵抗力特点
对寒冷、光、热力，干燥等十分敏感。 室温3h，60 ℃ 5min死亡。
病。如大叶性肺炎，支气管炎等。
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三、微生物学检验
(一) 标本采集 痰、脓液、血液等。
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(二) 检验方法及鉴定
1. 直接涂片 革兰氏色染色，荚膜染色
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2. 分离培养。 ① 胆汁溶菌试验。 ② 菊糖发酵。 ③ Optochin试验。
与草绿色链球菌鉴别
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2．检验方法
①直接涂片检查 脑脊液或瘀斑渗出液，干燥固定后 革兰染色，若发现G-双球菌，呈肾形 成对，可初报
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②分离培养鉴定 过氧化酶试验：阳性 触酶试验：阴性 血清凝集试验：阳性
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二、淋球菌
即淋病奈瑟菌， 为淋病的病原体，人是唯 一天然宿主和传染源
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一、脑膜炎球菌
即脑膜炎奈瑟菌， 是流行性脑脊髓膜炎的病原体
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（一）、生物学性状
1．形态结构 2．培养特性 3．生化反应 4. 抗原结构 5. 抵抗力特点
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1．形态结构
G-，肾形成双排列 在患者脑脊液标本中位于中性粒细胞
一、生物学性状
1．形态结构 2．培养特性 3．生化反应 4．抗原结构 5．抵抗力特点 6. 变异性
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1.形态结构
G+，呈矛尖状，成双排列，标 本或液体培养中成链状。
有荚膜，无鞭毛，不形成芽胞。
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2.培养特性
营养要求较高，含血液或血清的培养 基中生长。
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20、把小鼠随机分成两组，进行肺炎球菌荚膜 形成试验，分别将两株细菌接种于不同组动物 腹腔（每组接种一株细菌）。12小时后杀死小 鼠解剖，取腹腔作荚膜染色试验。结果有一组 只有少量细菌，且未见荚膜主要原因是什么？
A、 动物对细菌不敏感
B、 染色试剂不合
标准 C、 细菌毒力发生了变异
壁，称C多糖。在钙离子存在时,C多糖可与正常 人血清中称为C-反应蛋白(C reactive protein,CRP)
的β球蛋白结合，发生沉淀。
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5．抵抗力特点
较弱，加热56℃ ，20min即死亡。 对一般消毒剂敏感，对干燥抵抗 力较强。
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6. 变异性
荚膜变异：有荚的光滑（S）型菌 有毒力，失去荚膜的粗糙（R）型 毒力减低或消失。
初次分离，须5-10%CO2才能生长发育 菌落：凸起，光滑、圆形，灰白色，半透
D、 采标本时间过早
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二、致病性
1．致病物质 2．所致疾病
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1. 致病物质
荚膜：肺炎球菌的致病力，主要是 荚膜的抗吞噬作用。
溶血毒素“O”：自溶后释放，能溶 解人和动物的红细胞，高浓度对动 物有坏死及致死作用。
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2. 所致疾病
存在于正常人上呼吸道。 仅在人体抵抗力下降时才引起疾
采集标本：注意保温迅速送检。 对磺胺类、青霉素、链霉素均敏感。
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12、对脑膜炎奈瑟氏菌的标本采送， 哪一种是错误的？
A、 低温 B、 保温 C、 防干燥 D、 快速
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（二）、致病性与免疫性
1．致病物质 2．所致疾病 3. 免疫性
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1. 致病物质：内毒素、荚膜，菌毛 2. 所致疾病：寄生在正常人鼻咽部， 存在易患人群，与患者补体介导的杀 菌活性缺陷有关。约2%-3%的人表现 为流脑症状
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3. 免疫性：病原可产生群特异性
抗体，但不持久。
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(三) 微生物学检验
1．标本采集 菌血症期病人采集血液 有出血点或瘀斑者，可取瘀斑渗出液 有脑膜刺激症状，抽取脑脊液
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（一）、生物学性状
1．形态结构 2．培养特性 3. 生化反应 4．抵抗力特点
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1．形态结构
G-，球形或肾形，成对排列 有荚膜，无芽胞和鞭毛
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2．培养特性
营养要求高，30-37 ℃生长，须在含有血 液或血清的培养基上培养，常用血液、巧 克力等培养基