蛋白浓度测定的各种方法
蛋白浓度的测定方法
蛋白浓度的测定方法蛋白质是构成生物体的重要基本成分之一，对于研究生物学和医学具有重要意义。
因此，准确测定蛋白质的浓度对于科研工作具有重要意义。
本文将介绍几种常用的蛋白质浓度测定方法。
一、Lowry法Lowry法是一种经典的蛋白质浓度测定方法，该方法利用蛋白质与硫酸铜在碱性条件下发生络合反应，生成紫色复合物。
复合物的吸光度与蛋白质的浓度成正比，可通过比色法测定吸光度来计算蛋白质的浓度。
二、Bradford法Bradford法是一种常用的快速、灵敏的蛋白质浓度测定方法。
该方法利用蛋白质与染料吸附后的吸收光谱变化来测定蛋白质的浓度。
Bradford染料在酸性条件下与蛋白质发生络合反应，形成蓝色复合物，其吸光度与蛋白质的浓度成正比。
三、BCA法BCA法是一种常用的蛋白质浓度测定方法，该方法利用还原性物质与蛋白质中的蛋白质酸和蛋白质酰胺反应，生成紫色复合物。
复合物的吸光度与蛋白质的浓度成正比，可通过比色法测定吸光度来计算蛋白质的浓度。
四、Ninhydrin法Ninhydrin法是一种常用的蛋白质浓度测定方法，该方法利用蛋白质中的氨基酸与Ninhydrin反应，生成紫色复合物。
复合物的吸光度与蛋白质的浓度成正比，可通过比色法测定吸光度来计算蛋白质的浓度。
五、UV吸收法UV吸收法是一种常用的蛋白质浓度测定方法，该方法利用蛋白质中芳香族氨基酸（如酪氨酸和色氨酸）的吸收特性来测定蛋白质的浓度。
在特定波长下，蛋白质吸收的光强与蛋白质的浓度成正比，可通过比色法测定光强来计算蛋白质的浓度。
六、生物传感器法生物传感器法是一种新兴的蛋白质浓度测定方法，该方法利用生物传感器与蛋白质结合后的信号变化来测定蛋白质的浓度。
生物传感器可以是抗体、酶或其他与蛋白质结合的生物分子，通过测定生物传感器信号的变化来计算蛋白质的浓度。
蛋白质浓度的测定方法有很多种，每种方法都有其特点和适用范围。
在实际应用中，根据研究需要和实验条件的不同，可以选择合适的蛋白质浓度测定方法进行实验。
蛋白浓度测定的各种方法
蛋⽩浓度测定的各种⽅法蛋⽩质的定量分析是⽣物化学和其它⽣命学科最常涉及的分析内容，是临床上诊断疾病及检查康复情况的重要指标，也是许多⽣物制品，药物、⾷品质量检测的重要指标。
在⽣化实验中，对样品中的蛋⽩质进⾏准确可靠的定量分析，则是经常进⾏的⼀项⾮常重要的⼯作。
蛋⽩质是⼀种⼗分重要的⽣物⼤分⼦：它的种类很多，结构不均⼀，分⼦量⼜相差很⼤，功能各异，这样就给建⽴⼀个理想⽽⼜通⽤的蛋⽩质定量分析的⽅法代来了许多具体的困难。
⽬前测定蛋⽩质含量的⽅法有很多种，下⾯列出根据蛋⽩质不同性质建⽴的⼀些蛋⽩质测定⽅法：物理性质：紫外分光光度法化学性质：凯⽒定氮法、双缩脲法、Lowry 法，BCA法，胶体⾦法染⾊性质：考马⽒亮蓝染⾊法、银染法其他性质：荧光法蛋⽩质测定的⽅法很多，但每种⽅法都有其特点和局限性，因⽽需要在了解各种⽅法的基础上根据不同情况选⽤恰当的⽅法，以满⾜不同的要求。
例如凯⽒定氮法结果最精确，但操作复杂，⽤于⼤批量样品的测试则不太合格；双缩脲法操作简单，线性关系好，但灵敏度差，样品需要量⼤，测量范围窄，因此在科研上的应⽤受到限制；⽽酚试剂法弥补了它的缺点，因⽽在科研中被⼴泛采⽤，但是它的⼲扰因素多；考马⽒亮兰染⾊法因其灵敏⽽⼜简便开始重新受到关注；BCA法⼜以其试剂稳定，抗⼲扰能⼒较强，结果稳定，灵敏度⾼⽽受到欢迎；胶体⾦法具有较⾼的灵敏度，可达到毫微克⽔平，⽤于微量蛋⽩的测定。
常⽤的测定蛋⽩质含量⽅法的⽐较⽅法测定范围（µg/ml）不同种类蛋⽩的差异最⼤吸收波长(nm)特点凯⽒定氮法⼩标准⽅法，准确，操作⿇烦，费时，灵敏度低，适⽤于标准的测定紫外分光光度法100—1000⼤280205灵敏，快速，不消耗样品，核酸类物质有影响双缩脲法1000—10000⼩540重复性、线性关系好，灵敏度低，测定范围窄，样品需要量⼤Folin-酚试剂法20—500⼤750灵敏，费时较长，⼲扰物质多考马⽒亮蓝G-25050—500⼤595灵敏度⾼，稳定，误差较⼤，颜⾊会转移BCA50—500⼤562灵敏度⾼，稳定，⼲扰因素少，费时较长由于凯⽒定氮法的操作作过于复杂，双缩脲法的灵敏度⼜太低，下⾯介绍Folin—酚试剂法，考马⽒亮蓝G—250染⾊法，紫外分光光度法、胶体⾦法等⼏种最常⽤使⽤的⽅法。
[指南]蛋白质浓度的测定方法总结
![[指南]蛋白质浓度的测定方法总结](https://img.taocdn.com/s3/m/9b0f826e30b765ce0508763231126edb6f1a7664.png)
一、蛋白浓度的直接测定（UV法）这种方法是在280nm波长，直接测试蛋白。
选择Warburg 公式，光度计可以直接显示出样品的浓度，或者是选择相应的换算方法，将吸光值转换为样品浓度。
蛋白质测定过程非常简单，先测试空白液，然后直接测试蛋白质。
从而显得结果很不稳定。
蛋白质直接定量方法，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。
紫外直接定量法相对于比色法来说，速度快，操作简单；但是容易受到平行物质的干扰，如DNA的干扰；另外敏感度低，要求蛋白的浓度较高。
（1）简易经验公式蛋白质浓度(mg/ml) = [1.45*OD280-0.74*OD260 ] * Dilution factor（2）精确计算通过计算OD280/OD260的比值，然后查表得到校正因子F，再通过如下公式计算最终结果：蛋白质浓度(mg/ml) = F *(1/d) *OD 280 * D其中d为测定OD值比色杯的厚度D为溶液的稀释倍数二．紫外吸收法测定蛋白质含量0【实验目的】01. 学习紫外吸收法测定蛋白质含量的原理。
02. 掌握紫外分光光度计的操作方法。
0【实验原理】0大多数蛋白质分子结构中含有芳香族氨基酸（酪氨酸和色氨酸）残基，使蛋白质在280nm的紫外光区产生最大吸收，并且这一波长范围内的吸收值与蛋白质浓度的成正比，利用这一特性可定量测定蛋白质的含量。
0紫外吸收法可测定0.1-0.5mg/ml的蛋白质溶液，此操作简便，测定迅速，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。
因此，此法在蛋白质的制备中广泛应用。
0【实验材料】01.实验器材0试管及试管架；50毫升容量瓶 2只；移液管；紫外分光光度计。
02.实验试剂0(1)标准蛋白质溶液：精确配制2mg／ml的酪蛋白溶液。
0(2)样品溶液：配制约0.5mg/ml的酪蛋白溶液作为未知样品溶液。
0【实验操作】01. 绘制标准曲线0取7支试管按下列各表加入各试剂：0二、比色法蛋白浓度测定蛋白质通常是多种蛋白质的化合物，比色法测定的基础是蛋白质构成成分：氨基酸（如酪氨酸，丝氨酸）与外加的显色基团或者染料反应，产生有色物质。
蛋白浓度测定方法
蛋白浓度测定方法引言：蛋白质是生物体内广泛存在的一类重要有机分子，其浓度的准确测定对于生物研究和医学诊断具有重要意义。
本文将介绍几种常用的蛋白浓度测定方法，包括比色法、BCA法、Lowry法和Bradford 法，并对其原理、步骤和应用进行详细说明。
一、比色法：比色法是一种常用的蛋白浓度测定方法，基于蛋白质与某些特定试剂反应产生颜色变化的原理。
常用的试剂有布拉德福试剂、科学试剂等。
该方法操作简便，结果准确可靠，广泛应用于蛋白质研究领域。
1. 原理：比色法的原理是蛋白质与某些试剂反应产生可测量的颜色变化，根据颜色的强度可以推算出蛋白质的浓度。
这种反应通常是由于蛋白质中存在的特定官能团与试剂之间的化学反应导致的。
2. 步骤：比色法的步骤主要包括样品制备、试剂配制、反应和测量。
首先，将待测样品制备成适当浓度的溶液；然后，配制试剂，并与样品混合反应；最后，使用光谱仪或分光光度计测量反应产生的颜色的光吸收值，并根据标准曲线推算出蛋白质的浓度。
3. 应用：比色法广泛应用于生物化学、分子生物学、药学等领域。
例如，可以用于蛋白质表达水平的测定、蛋白质纯化过程中的监测以及药物研发过程中的蛋白质浓度测定等。
二、BCA法：BCA法是一种基于铜离子与蛋白质中的蛋白质酰基反应产生紫色络合物的测定方法。
该方法具有灵敏度高、稳定性好等特点，广泛应用于蛋白质浓度测定和蛋白质含量分析。
1. 原理：BCA法的原理是蛋白质中的蛋白质酰基与铜离子在碱性条件下反应生成紫色络合物，该络合物的吸收峰位于562 nm处。
蛋白质浓度与吸光度呈线性关系，可通过比色法测定吸光度来推算蛋白质的浓度。
2. 步骤：BCA法的步骤主要包括样品制备、试剂配制、反应和测量。
首先，将待测样品制备成适当浓度的溶液；然后，配制BCA试剂，并与样品混合反应；最后，使用分光光度计测量反应产生的紫色络合物的吸光度，并根据标准曲线推算出蛋白质的浓度。
3. 应用：BCA法被广泛应用于生物化学、分子生物学、生物技术等领域。
测蛋白浓度的方法
测蛋白浓度的方法
测蛋白浓度的方法有多种，常见的方法包括：
1. Bradford法：用Bradford试剂与蛋白质反应，形成蓝色的蛋白质-染料复合物。
根据复合物与蛋白质浓度成反比的关系，可以通过比色法或荧光法测定蛋白质浓度。
2. Lowry法：将蛋白质与碱式铜试剂和Folin-Phenol试剂反应，生成紫色蛋白质-复合物。
通过比色法或荧光法测定复合物的吸光度，计算出蛋白质浓度。
3. BCA法：将蛋白质与BCA试剂反应形成紫色的蛋白质-染料复合物，根据复合物与蛋白质浓度成正比的关系，通过比色法或荧光法测定蛋白质浓度。
4. UV分光光度法：利用蛋白质在280nm处的吸收峰测定蛋白质浓度。
该方法的优点是快速、简单，但需要纯化后的蛋白质，并且无法区分不同种类的蛋白质。
5. 二维凝胶电泳：分析各种蛋白在二维中的迁移距离，可以定量测定蛋白质的相对含量。
该方法需要复杂的操作和设备，但能够同时定量多种蛋白质。
蛋白质浓度测定方法
蛋白质浓度测定方法蛋白质是生物体内一类重要的生物大分子，其浓度的准确测定对于生物学研究和生物工程技术具有重要意义。
目前常用的蛋白质浓度测定方法主要包括比色法、BCA法、Lowry法和Bradford法等。
下面将对这几种常用的蛋白质浓度测定方法进行详细介绍。
比色法是一种常用的蛋白质浓度测定方法，其原理是利用蛋白质与某种试剂发生反应后产生显色物质，通过测定显色物质的吸光度来确定蛋白质的浓度。
比色法操作简单，结果准确，适用于大多数蛋白质的浓度测定。
BCA法是一种基于铜离子与蛋白质中的蛋白质和肽键发生还原反应而形成的紫色螯合物来测定蛋白质浓度的方法。
BCA法对于蛋白质的浓度测定具有较高的灵敏度和特异性，适用于各种类型的蛋白质。
Lowry法是一种经典的蛋白质浓度测定方法，其原理是利用蛋白质与碱性铜离子和蛋白质中的酚类物质在碱性溶液中发生离子还原反应，生成蓝色络合物，通过测定其吸光度来确定蛋白质的浓度。
Lowry法对于蛋白质的浓度测定具有较高的灵敏度和稳定性，适用于大部分蛋白质的浓度测定。
Bradford法是一种基于某种染料与蛋白质中的氨基酸残基之间的相互作用来测定蛋白质浓度的方法。
Bradford法对于蛋白质的浓度测定具有较高的灵敏度和线性范围，适用于多种类型的蛋白质。
在进行蛋白质浓度测定时，需要注意以下几点，首先，选择合适的测定方法，根据样品的特性和实验要求进行选择；其次，掌握好操作技巧，严格按照操作步骤进行，避免操作失误；最后，对测定结果进行准确的记录和分析，确保结果的可靠性和准确性。
总之，蛋白质浓度的准确测定对于生物学研究和生物工程技术具有重要意义，选择合适的测定方法并掌握好操作技巧是保证测定结果准确可靠的关键。
希望本文介绍的蛋白质浓度测定方法能够对您有所帮助。
蛋白质浓度测定集合
一、蛋白浓度的直接测定（UV法）这种方法是在280nm波长，直接测试蛋白。
选择Warburg 公式，光度计可以直接显示出样品的浓度，或者是选择相应的换算方法，将吸光值转换为样品浓度。
蛋白质测定过程非常简单，先测试空白液，然后直接测试蛋白质。
从而显得结果很不稳定。
蛋白质直接定量方法，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。
紫外直接定量法相对于比色法来说，速度快，操作简单；但是容易受到平行物质的干扰，如DNA的干扰；另外敏感度低，要求蛋白的浓度较高。
（1）简易经验公式蛋白质浓度(mg/ml) = [1.45*OD280-0.74*OD260 ] * Dilution factor（2）精确计算通过计算OD280/OD260的比值，然后查表得到校正因子F，再通过如下公式计算最终结果：蛋白质浓度(mg/ml) = F *(1/d) *OD 280 * D其中d为测定OD值比色杯的厚度D为溶液的稀释倍数二．紫外吸收法测定蛋白质含量【实验目的】1. 学习紫外吸收法测定蛋白质含量的原理。
2. 掌握紫外分光光度计的操作方法。
【实验原理】大多数蛋白质分子结构中含有芳香族氨基酸（酪氨酸和色氨酸）残基，使蛋白质在280nm的紫外光区产生最大吸收，并且这一波长范围内的吸收值与蛋白质浓度的成正比，利用这一特性可定量测定蛋白质的含量。
紫外吸收法可测定0.1-0.5mg/ml的蛋白质溶液，此操作简便，测定迅速，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。
因此，此法在蛋白质的制备中广泛应用。
【实验材料】1.实验器材试管及试管架；50毫升容量瓶 2只；移液管；紫外分光光度计。
2.实验试剂(1)标准蛋白质溶液：精确配制2mg／ml的酪蛋白溶液。
(2)样品溶液：配制约0.5mg/ml的酪蛋白溶液作为未知样品溶液。
【实验操作】1. 绘制标准曲线取7支试管按下列各表加入各试剂：试剂加完后摇匀，在紫外分光光度计上，于280nm处以0号管为对照，分别测定各管溶液的光密度值。
蛋白质浓度测定方法
蛋白质浓度测定方法1.低里德试剂法低里德试剂法通过测定蛋白质与试剂中碱式染料之间的吸光度来计算蛋白质浓度。
常用的低里德试剂有考马斯亮蓝G-250和试剂Folin-Ciocalteu。
这种方法操作简便，灵敏度高，但依赖于特定的蛋白质。
2.比色法比色法使用吸光度测定蛋白质溶液中特定波长的光的吸收程度。
常用的试剂有Bradford试剂、Biuret试剂和BCA试剂。
这些试剂与蛋白质发生化学反应后，形成显色物质，显色强度与蛋白质浓度成正比。
这种方法操作简便，灵敏度高，但对于一些物质干扰较大。
3.紫外吸收法紫外吸收法是通过测定蛋白质在特定波长下的吸光度来计算蛋白质浓度。
蛋白质在280 nm波长下的吸光度与其含量成正比。
该方法对纯度较高的蛋白质测定较为准确，但对于包含核酸、色素等物质的溶液会有干扰。
4.氨基酸分析法氨基酸分析法是通过测定蛋白质中的氨基酸含量来估计蛋白质浓度。
可使用色谱法或光谱法进行氨基酸测定。
该方法需要较复杂的实验设置和仪器，适合用于纯化蛋白质或特定氨基酸分析。
5.生物学活性测定法生物学活性测定法是通过测定蛋白质对生物系统或特定底物的活化能力来估计蛋白质浓度。
例如，酶活测定法通过测定酶活性与酶浓度之间的关系来计算蛋白质浓度。
这种方法直接反映了蛋白质的功能性，但前提是需要具备可靠的活性测定方法。
在实验中选择合适的蛋白质浓度测定方法需要根据实验目的、样品属性和仪器设备等进行综合考虑。
此外，为了减小误差，实验过程中应注意控制实验条件的一致性，并进行适当的平行样品测定。
测蛋白质浓度的方法
测蛋白质浓度的方法
测定蛋白质浓度的常用方法有：
1. 布拉德福法（Bradford法）：利用蛋白质与染料共存时发生吸光性变化的原理。
将样品与染料（布拉德福试剂）反应后，通过比色法测定吸光度，再与标准曲线进行比较以确定蛋白质浓度。
2. Lowry法：利用蛋白质与试剂（含铜离子和碱液）发生离子传递反应产生复合物，再与酚反应形成比色产物，通过比色法测定吸光度，再与标准曲线进行比较以确定蛋白质浓度。
3. BCA法（双硫仑法）：利用蛋白质与试剂（含双硫仑和铜离子）反应生成紫色螯合物，通过比色法测定吸光度，再与标准曲线进行比较以确定蛋白质浓度。
该方法适用于一般抗原浓度范围内。
4. 490 nm法：该方法利用酪氨酸与试剂（含酮氨酸和硫氰酸）发生反应生成紫色产物，通过比色法测定吸光度，再与标准曲线进行比较以确定蛋白质浓度。
需要注意的是，不同方法适用于不同类型和浓度的蛋白质，选择合适的方法进行测定非常重要。
同时，测定结果可能受到样品的酸碱度、离子浓度、存在的干扰物等因素的影响，应尽可能控制这些条件以获得准确的测量结果。
蛋白浓度测定方法
蛋白浓度测定方法蛋白浓度是生物学和化学研究中非常重要的参数，因此需要准确测定。
下面介绍两种常用的蛋白浓度测定方法。
一、比色法1. 原理比色法是利用蛋白质与某些试剂反应后形成的复合物吸收特定波长的光线，从而确定蛋白质含量的方法。
2. 实验步骤（1）制备标准曲线：取不同浓度的已知蛋白标准溶液，分别加入试剂，使其形成复合物。
然后使用分光光度计在特定波长下测量吸光度值，并记录下来。
将吸光度值作为纵坐标，标准溶液的蛋白质浓度作为横坐标绘制曲线。
（2）待测样品处理：将待测样品加入相同试剂中，形成复合物。
然后使用分光光度计在特定波长下测量吸光度值，并根据标准曲线计算出样品中蛋白质含量。
3. 注意事项（1）试剂选择：常用试剂有Bradford试剂、Biuret试剂和Lowry试剂等。
不同试剂的灵敏度和选择性不同，应根据实验需要选择合适的试剂。
（2）标准曲线制备：标准曲线中应包含待测样品中可能出现的蛋白质种类，以确保准确性。
二、BCA法1. 原理BCA法是利用还原剂将蛋白质中的酰胺键还原为游离氨基，然后使用BCA试剂与游离氨基反应生成紫色络合物。
络合物吸收特定波长的光线，从而确定蛋白质含量的方法。
2. 实验步骤（1）制备标准曲线：取不同浓度的已知蛋白标准溶液，加入还原剂和BCA试剂，使其形成络合物。
然后使用分光光度计在特定波长下测量吸光度值，并记录下来。
将吸光度值作为纵坐标，标准溶液的蛋白质浓度作为横坐标绘制曲线。
（2）待测样品处理：将待测样品加入相同还原剂和BCA试剂中，形成络合物。
然后使用分光光度计在特定波长下测量吸光度值，并根据标准曲线计算出样品中蛋白质含量。
3. 注意事项（1）还原剂选择：常用还原剂有DTT和β-巯基乙醇等。
不同还原剂的灵敏度和选择性不同，应根据实验需要选择合适的还原剂。
（2）标准曲线制备：标准曲线中应包含待测样品中可能出现的蛋白质种类，以确保准确性。
种常用蛋白浓度测定方法的比较
种常用蛋白浓度测定方法的比较在生物化学和分子生物学的研究中，蛋白质浓度的准确测定是至关重要的。
这不仅有助于了解生物体的基本生命活动，也为疾病诊断和治疗提供了重要依据。
随着科学技术的发展，有多种方法可以用于蛋白质浓度的测定。
以下是对三种常用方法的比较。
原理：蛋白质分子中的肽键在紫外光下有特征吸收，其吸光度与蛋白质浓度成正比。
通过测定特定波长下的吸光度，可计算出蛋白质浓度。
缺点：仅适用于较纯净的蛋白质样品，对于含有其他杂质或色素的样品，测定结果可能受到影响。
适用范围：主要用于生化试剂和标准蛋白溶液的浓度测定。
原理：Bradford法是一种基于染料的蛋白质测定方法。
考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合后，其吸收光谱发生变化。
根据染料溶液在加入蛋白质前后的吸光度差值，可计算蛋白质浓度。
优点：灵敏度高，操作简便，可用于多种蛋白质的测定。
缺点：由于染料特异性不高，易受其他物质干扰，导致结果偏差。
适用范围：多用于初步估计蛋白质浓度，如组织匀浆、细胞培养上清等样品的快速筛查。
原理：BCA法是利用双缩脲反应测定蛋白质浓度。
在碱性环境下，蛋白质与Cu2+反应生成紫色复合物。
通过测定该复合物对562nm波长光的吸光度，可计算蛋白质浓度。
优点：灵敏度高，准确性好，受干扰物质影响较小。
缺点：操作较复杂，需要使用专用的BCA试剂盒。
适用范围：适用于血清、尿样等生物体液中蛋白质浓度的精确测定。
通过对紫外吸收法、Bradford法和BCA法三种常用蛋白质浓度测定方法的比较，我们可以看到每种方法都有其独特的优点和适用范围。
在选择测定方法时，需要根据实际样品性质和实验需求进行综合考虑。
对于生化试剂和标准蛋白溶液的浓度测定，紫外吸收法是一种经济实用的选择；对于组织匀浆、细胞培养上清等样品的快速筛查，Bradford 法能够满足要求；对于血清、尿样等生物体液中蛋白质浓度的精确测定，BCA法是更好的选择。
在实际操作过程中，我们还需要注意规范操作，避免误差，提高测定结果的准确性。
检验蛋白质浓度的方法
检验蛋白质浓度的方法
常用检测蛋白质浓度的方法有比色法、质谱法、时间分光光度法、电泳法等。
1、比色法：利用蛋白质及其衍生物吸收光谱的特点，分别用不同浓度的染色剂对标准品和样品进行染色，然后比较染色后的色度强度多少，可确定蛋白质浓度。
2、质谱法：其原理是，利用质谱仪，通过电离质谱图，分析样品中各种分子量物质，通过其他组分中已知浓度的比较，考察来蛋白质浓度。
3、时间分光光度法：该法是利用偶联反应，比如蛋白质与某种琼脂糖结合反应等，在短时间内达到最高点，然后用某种光度测定仪检测，由其浓度变化来推测蛋白质的浓度。
4、电泳法：电泳法是检测蛋白质最常用的方法，原理是把样品放在凝胶泳道中，加上电压，使分子带电而沿正负极移动，然后根据电泳图判断蛋白质浓度。
蛋白定量试剂
兼容大多数去垢剂
蛋白定量方法中，测定最快速，方法最简单，且在室温下进行
蛋白质间差异性小于Bradford法
与大多数盐离子、溶剂、缓冲剂、硫醇、还原性物质和金属螯合剂兼容
缺点
能还原铜离子的物质也能造成显色，影响定量的准确性
与通常用于溶解膜蛋白的高浓度去垢剂不兼容
与铜离子螯合的试剂，DTT 等常见还原剂和特定的单个氨基酸也会在BCA检测中显色（半胱氨酸或胱氨酸、酪氨酸和色氨酸）
1
2
3
4
5
6
7
8
0
1
2
4
8
12
16
20
20
19
18
16
12
8
4
0
0
0.025
0.05
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
每份标样分别加入BCA试剂200μl。
2、配制待测样品：准确吸取20μl样品溶液于酶标孔中，加入BCA试剂200μl。如待测样品需稀释，稀释倍数需根据原始样品浓度进行适当调整，一般保证稀释后样品浓度标曲浓度范围内。
2、配制待测样品：准确吸取50μl样品溶液于孔板中，加入考马斯亮蓝G250试剂200μl。静置10min后检测。如待测样品需稀释，稀释倍数需根据原始样品浓度进行适当调整，一般保证稀释后样品浓度在0.1-1.0mg/ml。
3、用酶标仪在595nm波长下测定溶液的吸光度。以BSA含量为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。以标准曲线空白为对照，根据样品的吸光值从标准曲线上查出样品的蛋白质含量。
考马斯亮蓝G250
6104-58-1
磷酸
7664-38-2
乙醇(95%)
蛋白质定量的五种方法
蛋白质定量得五种方法方法一双缩脲法测定蛋白质浓度[目得］掌握双缩脲法测定蛋白质浓度得原理与标准曲线得绘制。
[原理]双缩脲（NH2CＯNHCOＮH2)在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色化合物,称为双缩脲反应，蛋白质分子中含有许多肽键（—ＣＯＮH—)在碱性溶液中也能与Cu２＋反应产生紫红色化合物。
在一定范围内,其颜色得深浅与蛋白质浓度成正比。
因此,可以利用比色法测定蛋白质浓度。
双缩脲法就是测定蛋白质浓度得常用方法之一.操作简便、迅速、受蛋白质种类性质得影响较小,但灵敏度较差，而且特异性不高.除—CONH—有此反应外，—CＯNＨ2、—CＨ2ＮＨ2、-CS－NＨ2等基团也有此反应。
[操作］取中试管7支，按下表操作．各管混匀、放置37℃水浴中保温20分钟.用5４0nｍ比色,以空白管调零点,读取各管光密度值。
[计算］（一）在座标纸上以光密度为纵座标,以蛋白质浓度为横座标绘制标准曲线。
(二)从标准曲线中查出待测血清样本得蛋白质浓度(ｇ／L),并求出人血清样本得蛋白质浓度.（三）再从标准管中选择一管与测定管光密度相接近者，求出人血清样本得蛋白质浓度(ｇ／L)。
[器材]中试管7支,l毫升刻度吸管3支,10毫升刻度吸管１支，水浴箱，７21型分光光度计、坐标纸。
[试剂］(—)6Ｎ NaOH:称取240ｇ氢氧化钠溶于1000mｌ水中。
(二）双缩脲试剂:称取CuS04·5H２O 3。
0克,酒石酸钾9.0 克与碘化钾５.０克,分别溶解后混匀,加6ＮNaＯH l00mｌ，最后加水至1000mｌ,贮于棕色瓶中，避光，可长期保存.如有暗红色沉淀出现,即不能使用.（三)０、９%NａCl．(四）蛋白质标准液(１0ｍg／ｍ1),称取干燥得牛血清蛋白100、０mｇ，以少量生理盐水溶解后倒入ｌ0ml容量瓶中，淋洗称量瓶数次,一并倒入容量瓶中，最后加生理盐水至刻度线,或用凯氏定氮法测定血清蛋白质含量,然后稀释成ｌ0mg/ｍ1作为蛋白质标准液。
蛋白浓度测定的方法
蛋白浓度测定的方法蛋白浓度测定的方法：1. 紫外分光光度法紫外光谱吸收法测定蛋白质含量是讲蛋白质溶液直接在紫外分光光度计中测定的方法，不需要任何试剂，操作简单且易回收。
蛋白质溶液在280nm附近有强烈的吸收，这是由于蛋白质中酪氨酸、色氨酸残基而引起的，所以光密度受这两种氨基酸含量的支配。
另外核蛋白或提取过程中杂有的核酸对测定结果引起极大误差，其最大吸收在260nm。
所以同时测定280及260nm两种波长的吸光度，通过计算可得较为正确的蛋白质含量。
2. 双缩脲法利用半饱和硫酸铵或27.8%硫酸钠——亚硫酸钠可使血清球蛋白沉淀下来，而此时血清白蛋白仍处于溶解状态，因此可把两者分开，这种利用不同浓度的中性盐分离蛋白的方法称为盐方法。
盐析分离蛋白质的方法不仅用于临床医学，而且还广泛地用于生物化学研究工作中，如一些特殊蛋白质—酶、蛋白激素等的分离和纯化。
蛋白质和双缩脲一样，在碱性溶液中能与铜离子形成紫色络合物(双缩脲反应)，且其呈色深浅与蛋白质的含量成正比，因此可于蛋白质的定量测定。
3. Folin-酚试剂法目前实验室较多用Folin-酚法测定蛋白质含量，此法的特点是灵敏度高，较双缩脲高两个数量级，较紫外法略高，操作稍微麻烦，反应约在15分钟有最大显色，并最少可稳定几个小时，其不足之处是干扰因素较多，有较多种类的物质都会影响测定结果的准确性。
其原理是蛋白质中含有酚基的酪氨酸，可与酚试剂中的磷钼钨酸作用产生兰色化合物，颜色深浅与蛋白含量成正比。
4. 考马氏亮蓝G-250此方法是1976年Bradform建立。
染料结合法测定蛋白质的优点是灵敏度较高，可检测到微量蛋白，操作简便、快迅，试剂配制极简单，重复性好，但干扰因素多。
考马氏亮蓝G-250具有红色和青色两种色调、在酸性溶液中游离状度下为棕红色，当它通过疏水作用与蛋白质结合后，变成蓝色，最大吸收波长从465nm转移到595nm处，在一定的范围内，蛋白质含量与595nm 的吸光度成正比，测定595nm处光密度值的增加即可进行蛋白质的定量。
蛋白浓度测定的方法
蛋白浓度测定的方法蛋白质是生物体内的重要物质，对于许多实验室研究和临床诊断都有着重要的意义。
因此，准确测定蛋白质的浓度是非常关键的。
目前，常用的蛋白质浓度测定方法主要有生物学素法、分光光度法、BCA法、Lowry法、Bradford法和尿素法等。
下面将分别介绍这些方法的原理和操作过程。
1.生物学素法：生物学素法是一种通过测定蛋白质与棒状素之间的结合来确定蛋白质浓度的方法。
这种方法主要应用于血浆、血清和尿液等样品的蛋白质测定。
实验方法如下：a.准备一组具有不同浓度的棒状素溶液。
b.将待测蛋白质溶液与棒状素一起孵育一段时间。
c.通过酸甲醛试剂对母液进行反应，并测量光密度。
d.制作标准曲线，并根据待测样品的光密度与标准曲线的关系计算蛋白质浓度。
2.分光光度法：分光光度法是一种通过测定蛋白质对特定波长的紫外光吸收量来计算浓度的方法。
这种方法适用于纯度较高的蛋白质样品。
实验方法如下：a. 准备一组蛋白质标准溶液，并使用光度计测量其在280nm波长处的吸光度。
b.将待测蛋白质样品的吸光度值与标准溶液的吸光度值进行比较，并计算浓度。
3.BCA法：BCA法是一种通过测定蛋白质与巴氏试剂之间的反应产生的紫色络合物的吸光度来计算蛋白质浓度的方法。
该方法对于各种类型的蛋白质样品都适用。
实验方法如下：a.准备一组蛋白质标准溶液，并加入BCA试剂。
b.将待测蛋白质样品与BCA试剂孵育一段时间。
c.使用光度计测量吸光度，并通过标准曲线计算浓度。
4. Lowry法：Lowry法是一种经典的蛋白质浓度测定方法，通过低里试剂和碱式铜试液与蛋白质样品反应，产生紫色或蓝色化合物，并通过比色计测量光密度来计算蛋白质浓度。
实验方法如下：a.准备一组蛋白质标准溶液，并加入低里试剂和碱式铜试液。
b.将待测蛋白质样品与低里试剂和碱式铜试液反应一段时间。
c.使用比色计测量吸光度，并通过标准曲线计算浓度。
5. Bradford法：Bradford法是一种快速、敏感且广泛应用的蛋白质浓度测定方法，通过考虑到蛋白质在酸性溶液中与染料试剂环氧化苏丹蓝的特异性作用来计算浓度。
蛋白质定量测定的方法有哪些
蛋白质定量测定的方法有哪些
蛋白质定量测定的常见方法有以下几种：
1. Bradford方法：基于蛋白质和Bradford试剂反应产生吸光度的变化，利用标准曲线来测定样品中蛋白质的浓度。
2. BCA方法：基于蛋白质和BCA试剂的反应产生的复合物的紫外吸收光谱变化来测定蛋白质浓度。
3. Lowry方法：基于蛋白质与染料（如Folin-Ciocalteu试剂）反应生成的蓝色化合物的峰值吸收度变化来测定蛋白质浓度。
4. UV吸光度法：利用蛋白质在特定波长下的紫外吸收光谱来测定浓度，如在280nm测量腺苷酸蛋白质的含量。
5. 比色法：利用蛋白质与染料或金属离子反应生成的复合物的颜色变化来测定蛋白质浓度，如利用Coomassie蓝染色法或浊度法。
6. 尿素-酸性PAGE测定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和二次洗脱凝胶电泳（acid-urea-Triton X-100-PAGE）相结合的方法，通过与已知浓度的标准蛋白进行定量。
7. 精氨酸测定法：利用精氨酸与二恶安脱水酶反应生成吲哚染料，测定蛋白质的含量。
需要根据具体实验目的和条件选择合适的测定方法。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
蛋白浓度测定的各种方法
蛋白质的定量分析是生物化学和其它生命学科最常涉及的分析内容，是临床上诊断疾病及检查康复情况的重要指标，也是许多生物制品，药物、食品质量检测的重要指标。
在生化实验中，对样品中的蛋白质进行准确可靠的定量分析，则是经常进行的一项非常重要的工作。
蛋白质是一种十分重要的生物大分子：它的种类很多，结构不均一，分子量又相差很大，功能各异，这样就给建立一个理想而又通用的蛋白质定量分析的方法代来了许多具体的困难。
目前测定蛋白质含量的方法有很多种，下面列出根据蛋白质不同性质建立的一些蛋白质测定方法：
物理性质：紫外分光光度法
化学性质：凯氏定氮法、双缩脲法、Lowry 法，BCA法，胶体金法
染色性质：考马氏亮蓝染色法、银染法
其他性质：荧光法
蛋白质测定的方法很多，但每种方法都有其特点和局限性，因而需要在了解各种方法的基础上根据不同情况选用恰当的方法，以满足不同的要求。
例如凯氏定氮法结果最精确，但操作复杂，用于大批量样品的测试则不太合格；双缩脲法操作简单，线性关系好，但灵敏度差，样品需要量大，测量
范围窄，因此在科研上的应用受到限制；而酚试剂法弥补了它的缺点，因而在科研中被广泛采用，但是它的干扰因素多；考马氏亮兰染色法因其灵敏而又简便开始重新受到关注；BCA法又以其试剂稳定，抗干扰能力较强，结果稳定，灵敏度高而受到欢迎；胶体金法具有较高的灵敏度，可达到毫微克水平，用于微量蛋白的测定。
常用的测定蛋白质含量方法的比较方法
测定范围
（μg/ml）
不同种类
蛋白的差异
最大吸收
波长(nm)
特点凯氏定氮法
小
标准方法，准确，操作麻烦，费时，灵敏度低，适用于标准的测定紫外分光光度法
100—1000
大
280
灵敏，快速，不消耗样品，核酸类物质有影响双缩脲法
1000—10000
小
540
重复性、线性关系好，灵敏度低，测定范围窄，样品需要量大Folin-酚试剂法
20—500
750
灵敏，费时较长，干扰物质多考马氏亮蓝G-250 50—500
大
595
灵敏度高，稳定，误差较大，颜色会转移BCA 50—500
大
562
灵敏度高，稳定，干扰因素少，费时较长。