成年大鼠骨骼肌成肌细胞的原代培养(一)解读

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大鼠骨骼肌细胞培养实验指导

大鼠骨骼肌细胞培养骨骼肌是一种横纹肌，通常是通过肌腱固定到骨骼上，其伸缩可以带动骨骼的移动，促进机体运动。

肌细胞呈纤维状，不分支，有明显横纹，核很多，且都位于细胞膜下方。

肌细胞内有许多沿细胞长轴平行排列的细丝状肌原纤维，每一肌原纤维都有相间排列的粗肌丝及细肌丝。

肌纤维收缩并不是肌纤维中肌丝本身的缩短或卷曲，而是细肌丝在粗肌丝之间滑行的结果，肌丝滑行使肌节长度缩短，肌原纤维缩短表现为肌纤维收缩。

体外培养大鼠骨骼肌细胞，为临床肌肉损伤的治疗提供理论依据.一、实验前准备实验开始前，将眼科剪刀、眼科镊子、培养皿，15ml离心管、移液管、移液枪、枪头等放入无菌超净工作台，以紫外线照射30min。

按照含0.2%的XI胶原酶、0.2%的中性蛋白酶、0.1%的胶原酶进行配制消化液，用0.22微米的PES微孔滤膜进行过滤除菌，置于50毫升离心管中，可直接用于组织消化。

瓶口消毒后室温待用。

取出无菌培养皿，分别作好标记，吸取适量PBS置于相应标记的培养皿中。

无菌条件下，准备好各种大小的眼科剪刀、止血钳、眼科镊子和手术刀。

将断颈处死后浸泡于体积分数为 75%乙醇的SD大鼠仰卧在超净台内的干净培养皿上。

二、骨骼肌提取眼科剪刀剪开大鼠后肢皮肤，暴露腿部肌肉，用手术刀小心割取后肢大腿肌肉，同样方法分离另一后肢大腿肌肉。

小心剪取表面无附着膜和脂肪组织的肌肉，置于装有PBS的无菌培养皿中。

吸取适量消化液于相应标记的培养皿中。

将剪取的骨骼肌在无菌PBS浸泡清洗，去除脂肪组织后放置于含消化液的培养皿中，采用眼科剪刀剪碎骨骼肌组织，成1平方毫米不规则碎片。

轻轻摇匀，室温静置消化30分钟收集组织悬液于50毫升离心管中，用消化液反复冲洗培养皿，直至将全部组织块收集到离心管内。

轻轻吹打混匀组织块悬浮液。

配平离心：每分钟1000转，室温离心十分钟。

三、骨骼肌悬液制备及培养离心后小心去除上清，不要吸到底部的组织块沉淀，用含20%胎牛血清的DMEM培养基重悬，轻轻吹打混匀，制成悬液，均匀转移至六孔板中，轻轻摇匀，标记时间后放于37 ℃、体积分数为 5%的CO2饱和湿度培养箱中培养。

骨骼肌细胞原代培养

骨骼肌细胞原代培养骨骼肌细胞是我们身体中最重要的肌肉组织之一，通过细胞的原代培养可以帮助我们更好地研究肌肉的生理和病理过程。

本文将介绍骨骼肌细胞原代培养的方法和意义。

一、骨骼肌细胞原代培养的方法1. 细胞来源骨骼肌细胞可以从人体或动物体内获得。

人体来源的骨骼肌细胞可以通过手术获取，动物来源的骨骼肌细胞可以通过解剖或抽取组织获得。

2. 细胞分离将获得的骨骼肌组织进行消化，分离出单个的骨骼肌细胞。

常用的消化酶有胰蛋白酶和胶原酶，通过适当的温度和时间来进行消化。

3. 细胞培养将分离出的骨骼肌细胞放入培养皿中，加入适当的培养基，提供细胞所需的营养物质和生长因子。

培养基的配方和组成会因实验目的的不同而有所差异。

4. 细胞传代原代培养的骨骼肌细胞会在培养过程中逐渐增殖，达到一定的细胞数量后，可以进行细胞传代。

传代可以保持细胞的稳定性和生物学特性。

二、骨骼肌细胞原代培养的意义1. 生理研究通过骨骼肌细胞原代培养，可以研究肌肉的生理功能和调控机制。

例如，可以研究肌肉收缩机制、肌肉代谢和能量平衡等方面的问题。

2. 病理研究骨骼肌细胞原代培养还可以用于研究肌肉疾病的发生机制和治疗方法。

例如，可以利用培养的肌肉细胞模拟某些疾病的发生过程，寻找治疗的靶点和药物。

3. 药物筛选骨骼肌细胞原代培养可以用于药物的筛选和评价。

通过在培养的肌肉细胞中加入不同的药物，观察细胞的反应和变化，可以评估药物的疗效和毒副作用。

三、骨骼肌细胞原代培养的注意事项1. 细胞来源的选择在进行骨骼肌细胞原代培养前，需要选择合适的细胞来源。

不同的细胞来源可能会影响培养结果和实验的可行性。

2. 培养条件的优化骨骼肌细胞原代培养需要适宜的培养条件，包括培养基的配方、温度、湿度和CO2浓度等。

这些条件需要根据实验的要求进行优化。

3. 细胞的纯度和活性在骨骼肌细胞原代培养过程中，需要保证细胞的纯度和活性。

细胞的纯度可以通过筛选和分离的方法进行提高，细胞的活性可以通过细胞活力试剂盒进行检测。

成年大鼠骨骼肌成肌细胞的原代培养(一)解读

成年大鼠骨骼肌成肌细胞的原代培养(一)【摘要】目的探索成年大鼠骨骼肌成肌细胞的原代培养方法。

方法取成年Wistar大鼠的后肢肌肉,利用组织块法培养成肌细胞。

并对培养细胞进行形态学研究和细胞鉴定。

结果采用组织块培养成肌细胞的密度可达118/ml, 成肌细胞的分化鉴定显示94%以上的细胞呈骨骼肌特异的肌细胞。

结论利用组织块法成功培养成年大鼠原代骨骼肌成肌细胞,该方法实用性强,所得成肌细胞纯度高,为深入研究心力衰竭骨骼肌成肌细胞自体移植奠定了基础。

【关键词】骨骼肌成肌细胞原代培养大鼠成年【Abstract】 Objective： To explorean experimental method for primary culture of adult rat skeletalmuscle sarcoblast Methods: Muscle of posterior limb from wistar rat were cultured by tissue culture method. The cells were counted and observed by light microscopy combined with identification. Results:The number of skeletalmuscle sarcoblast118per millilitre. skeletalmuscle sarcoblast cell differentiation accredit showed that over 94% cells were stained positive for myogenin.Conclusions: Tissue culture method conveniently permits the purification and Proliferation of myoblast. These esults provide the basis for future studies to assess the ability of the cells to repair heart failure.【Key words】skeletalmuscle sarcoblast primaryculture rat adult心肌细胞是终末化组织，不能再生。

大鼠骨骼肌卫星细胞体外培养生长和成肌特性[1]

上海交通大学学报(医学版)Vol .28No .7Jul .2008Journal of Shanghai J iaotong University (Medical Science )基金项目:上海市科委基金(044119605)(Shanghai Science and Technol ogy Comm ittee Foundati on,044119605)。

作者简介:徐　可(1975-),男,上海人,主治医师,博士;电子信箱:huashanxuke @medmail 。

通讯作者:方祖军,电子信箱:huashanfangzujun @ 。

文章编号:　0258-5898(2008)07-0775-04・论　著・大鼠骨骼肌卫星细胞体外培养生长和成肌特性徐　可,　方祖军,　李映川,　郑　捷,　丁　强(复旦大学　华山医院泌尿外科,上海　200040)摘　要:目的建立大鼠骨骼肌卫星细胞分离和纯化方法,并观察骨骼肌卫星细胞的体外增殖和成肌特性。

方法采用改良两步酶消化法结合差速贴壁技术,获得高纯度的骨骼肌卫星细胞。

免疫组化染色鉴定体外培养的骨骼肌卫星细胞;MTT 法检测体外培养骨骼肌卫星细胞的生长情况;倒置显微镜观察不同培养条件下骨骼肌卫星细胞的分化特性。

结果获取的骨骼肌卫星细胞纯度高,细胞中肌源性标志中间丝蛋白des m in 呈强阳性表达。

体外培养时,骨骼肌卫星细胞有1～2d 的潜伏期,5～6d 进入平台期。

细胞汇合至60%～70%或降低培养基血清浓度时,开始相互融合形成肌管细胞。

结论酶两步消化法和差速贴壁技术是一种简便易行、获得较高纯度的骨骼肌卫星细胞的方法。

骨骼肌卫星细胞体外培养时无需特殊诱导即可相互融合,形成具有骨骼肌收缩特性的肌管细胞。

关键词:骨骼肌卫星细胞;　培养;　增殖;　分化中图分类号:Q 813.11 文献标志码:ACharacter isti cs of proli fera ti on and m yotube cell forma ti on of ra t skelet a l m uscle s a tellite cells cultured in vitroXU Ke,FANG Zu 2jun,L I Ying 2chuan,ZHENG Jie,D I N G Q iang(D epart m ent of U rology,Huashan Hospital,Fudan U niversity,Shanghai 200040,China )Abstract:　O bjective To establish a method of is olation and purificati on of rat skeletal muscle satellite cells,and observe the characteristics of p r oliferati on and my otube cell for mati on of skeletal muscle satellite cells cultured in vitro .　M ethods Purified skeletal muscle satellite cells were obtained by i mp r oved t wo 2step enzy matic digesti on method and p re 2p lating technique .I m munohistochem ical staining was emp l oyed t o identify the skeletal muscle satellite cells cultured in vitro .The gr owth of skeletal muscle satellite cells cultured in vitro was exam ined by MTT assay .The differentiati on of skeletal muscle satellite cells was observed by inverted m icr oscopy .　Resu lts The skeletal muscle satellite cells with higher purity were obtained and confir med by the high exp ressi on of des m in .W hen cultured in vitro ,the latent phase of skeletal muscle satellite cells was the first t o the second day,and the p latfor m phase was the fifth t o the sixth day .My otube cells gradually for med when cell confluence was more than 60%t o 70%or differential medium with l ower fetal bovine serum was used .Conclusion The co mbinati on of i mp r oved t wo 2step enzy matic digesti on method and p re 2p lating technique serve as an easyand p ractical way to obtain skeletal muscle satellite cells with higher purity .Skeletal muscle satellite cells can for m myotube cells with contraction characteristics without any s pecial induction .Key words:　skeletal muscle satellite cell;　culture;　p r oliferation;　differentiation 骨骼肌卫星细胞是存在于骨骼肌肌膜和基底膜之间的一些单个核细胞,被认为是一种具有一定自我更新能力[1]及已发生某种程度定向分化的成体组织内的专能干细胞[2],因此在组织工程和基因治疗领域有着良好的应用前景。

大鼠血管平滑肌细胞的原代培养及鉴定-最新年精选文档

[1] 。

大鼠血管平滑肌细胞的原代培养及鉴定血管平滑肌细胞（VSMC 的异常增殖是许多心血管疾病的共同病理基础，在高血压、动脉粥样硬化和血管成形术后再狭窄等许多血管性疾病中，都涉及到血管平滑肌细胞的异常增殖血管由 3 个部分组成，自内向外依次是内膜层、中膜层和外膜层，内膜层主要由血管内皮细胞和少量的平滑肌细胞组成，外膜层由要收缩调节机体的血流和血压，其功能障碍在心血管疾病中起着非常重要的作用，因此，对血管平滑肌细胞的生物学特性进行深入研究，才能探明上述血管疾病的发病机制。

在VSMC 勺研究中，组织块贴壁法培养 VSM （和胶原酶消化法是目前采用的非常广泛的技术。

本实验采用组织块贴壁法进行大鼠胸主动脉平滑肌细胞的培养，并采用平滑肌细胞的3种标记分子（SMASM22Calponin ）进行免疫细胞化学鉴定。

1 材料与方法成纤维细胞组成，中膜层由血管平滑肌细胞组成，平滑肌细胞主1.1 材料。

动物来源：健康 Wistar 大鼠，由第三军大学实验动物中心提供，雌雄不限，体重180 〜200g 。

DM EMS 糖培养基（美国 Gibco 公司）， Hepes 索莱宝），优质胎牛血清（原代培养浓度 20%，传代培养浓度 10%，美国 Hyclone ），胰蛋白酶，鼠单抗肌动蛋白 SMA 、SM22、Calponin 北京博奥森生物），DAB 显色试剂盒，通用型免疫组化检测试剂盒北京中杉金桥生物技术XX公司）其余试剂均为国产分析纯。

1.2 方法1.2.1 取材：断颈法处死Wistar 大鼠，消毒胸腹部，大组织剪、组织镊剪开胸腹部皮肤，更换器械，切开胸腹部，并切除部分胸壁以利于暴露胸主动脉，用眼科弯镊和眼科剪分离胸腹主动脉并放入盛有无菌PBS的细胞培养皿中。

转入超净工作台上，眼科直镊和弯镊清除结缔组织和血块，剥除动脉外膜。

放入另一盛有PBS的细胞培养皿中，减去血管外的细小分支，并放入含10%台牛血清的DMEI中，眼科直剪纵向剖开血管腔，用眼科弯镊轻轻刮除内膜面，以去除内皮细胞，放入另一含10%台牛血清的DMEM中，用眼科弯剪反复剪切成1mm*1m大小的组织块。

大鼠心肌骨骼肌肝脏以及培养细胞的线粒体提取解读

骨骼肌线粒体的提取 [160]麻醉取材,迅速分离相应骨骼肌,区分红肌和白肌。

分别用介质Ⅰ(0.12M KCl , 20mM Hepes, 5mM MgCl2, pH 7.4冲洗肌组织两遍,剔除脂肪及结缔组织、置于盛有适量介质Ⅰ的小烧杯中, 用剪刀剪碎, 加 100毫升介质 I , 分成 4-5份,电动匀浆器匀浆 1200转 /分钟,上下三次,加 40毫升介质 I , 0-4℃离心, 600g 离心 10分钟, 弃沉淀, 上清用两层薄纱布过滤以去除脂肪, 滤过液于 17000g 离心 10分钟,沉淀用 5毫升介质Ⅰ悬浮,混匀,加入 20毫升介质Ⅰ, 7000g 离心 10分钟,沉淀悬浮在 20毫升介质Ⅱ(0.3M Sucrose , 2.0mM Hepes , 0.1mM EDTA , 2mg 脱脂 BSA/ml, pH 7.4中, 3500g 离心 10分钟,沉淀悬浮于 1毫升介质Ⅱ中。

以上操作均在冰浴中进行。

2.6心肌线粒体的提取在每一个运动时间点即刻断头处死,迅速取出心脏,用分离介质 (0.25M Succose, 3.0mM Hepes, 0.5mM EDTA, pH 7.4冲洗两遍,剔除脂肪及结缔组织、剪碎,加 100ml 分离介质,分成 4-5份,电动匀浆器匀浆 800转 /min,上下三次,加 40ml 分离介质, 0-4℃离心, 800g 离心 10min , 弃沉淀, 上清液于 10000g 离心 10min , 沉淀用 1ml 分离介质悬浮,混匀,加入 20ml 分离介质, 10000g 离心 10min ,沉淀悬浮于 1ml 分离介质中。

以上操作均在冰浴中进行。

大鼠肝脏线粒体的制备运动后即刻敲击鼠头部处死 , 迅速取出肝脏 , 置于冷生理盐水中洗净 , 称重后置于液氮中冷冻 , 低温保存待用。

采用同样的方法处死对照组动物并取样。

将样品在 0~4 ℃放置 10min ,然后将其移至预冷的匀浆缓冲液中剪碎 , 组织 / 缓冲液为 1∶ 10 (w/ v ,用电动匀浆器制备匀浆液。

骨骼肌成纤维细胞分离培养

骨骼肌成纤维细胞分离培养
骨骼肌成纤维细胞（skeletal muscle fibroblasts）的分离和
培养是一种常用的实验技术，用于研究骨骼肌相关的生物学过程以及
肌肉疾病等。

以下是骨骼肌成纤维细胞分离培养的一般步骤：
1.准备离体骨骼肌组织。

从小鼠或人的骨骼肌中取出组织，最好是新鲜组织以确保细胞的活力。

2.组织消化。

将骨骼肌组织切成小块，用胶原酶或胰蛋白酶等消化酶进行消化，使细胞从组织中释放出来。

3.细胞筛选。

通过过筛网或离心的方式将消化后的细胞悬浮液筛选，去除大部分的纤维束和其他细胞类型。

4.细胞培养。

将筛选后的细胞悬浮液转移到培养皿中，添加含有合适培养基和补充物的培养液，将培养皿放置在适当的培养箱中。

5.培养条件。

骨骼肌成纤维细胞通常在37°C的孵育箱中，与5% CO2的空气保持湿润的环境中培养。

6.细胞生长和传代。

骨骼肌成纤维细胞会在培养皿中黏附并开始增殖。

当细胞达到一定密度时，可以进行传代，将细胞分离并分散到
新的培养皿中。

需要注意的是，分离和培养骨骼肌成纤维细胞需要一定的实验技巧和设备，以保证细胞的存活和生长。

同时，细胞的培养基选择和培
养条件的控制也对细胞的生长和功能有重要影响。

因此，在进行这项
技术时，需要按照具体实验要求和相关文献中的方法进行操作。

大鼠心肌细胞原代培养

实验二大鼠CM的体外分离、培养及鉴定1、材料与方法1.1 材料1.1.1实验动物新生3天清洁级Wistar大鼠乳鼠（中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心，动物许可证号：scxk2005-0001）。

1.1.2主要仪器与试剂 5％CO2恒温培养箱（model TC2323 CO2incubator）；倒置相差显微镜（XD-101 98010）；PH计（mettler toledo320-s）；立式自动电热压力蒸汽灭菌器（LDZX-40BI），上海申安医疗器械厂；SW-CJ-2FD型单人双面净化工作台；微量移液枪（法国Gilson）；血球记数板（上海市沪江医疗器材经营部）；HH-6数显恒温水浴锅；离心机（LDZ5-2）；75cm2培养瓶、50ml离心管（美国corning公司）；无菌手术器械；磁力搅拌器；电子天平板（BS1101S 德国）；一次性滤器（22μm, GILSON）；DMEM/F12培养基 (美国GIBCO)；特级胎牛血清（FBS， Hyclone）；青、链霉素（Hyclone）；D-Hank’s液（NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4、NaOH、NaHCO3，苯酚红,南京化学试剂厂）；心肌肌钙蛋白T(Santa cruz) ;FITC连接的兔抗山羊IgG(Santa cruz);Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶(Sigma)；Triton-X-100(AMRESCO);BrdU(solarbio)。

1.2方法于无菌操作下开胸取出心脏，仔细去除心脏相连大血管和心房组织（留心尖部），于4℃的D-Hank’S液中漂洗3～4次，以去除残存血液，眼科剪将心尖部组织剪成1 mm3碎块后，加入4 ml的0.0625%胰蛋白酶液，于37℃恒温水浴箱中消化3 min，然后弃上清。

于剩余沉淀中加入混合消化液5 ml（0.0625％胰蛋白酶+0.1％Ⅱ型胶原酶），置37℃水浴消化8～10 min，其间振荡2～3次，静置后将上清液移入离心管中，加含10％胎牛血清预冷的DMEM/F12培养液终止消化。

成年大鼠骨骼肌卫星细胞的原代培养、鉴定及体外增殖

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预冷的ＰＳ抗生素缓冲液漂洗３次。将肌肉组织分Ｂ离成若干细小的肌束，剪成１ｍｍａ右的肌肉碎左
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肌卫星细胞纯度在９％以上。细胞体外培养时在第３Ｏ天进入对数生长期，５６ｄ－进入增殖平台期。
细胞体外培养时无须特殊诱导可以自出现成肌定向分化，发相互融合形成具有自发收缩特性的肌管细胞。结论体外培养获取的骨骼肌卫星细胞数量可以满足组织工程研究的需要。【关键词】骼肌卫星细胞：殖：化；定骨增分鉴【中图分类号】３２＋【Ｒ２．４文献标识码】【７Ａ文章编号】０４８４（０７０ —０００１０ —４８２０）１２—５０
ＰＢＳ抗生素缓冲液（／霉素，２０Ｕ／）青链０ｍ１，
Ｉ型胶原酶（ｉｍａ，胰蛋白酶（ｉａ，胎牛血清Ｓｇ）Ｓｇ）ｍ
有一定的自我更新能力【。在个体的生命发育过程２】中，骨骼肌卫星细胞随着年龄的增长逐渐减少［。３】因此，如何利用少量的肌肉组织分离、培养得到数量足够的骨骼肌卫星细胞是相关领域细胞移植治疗的关键。研究旨在通过建立骨骼肌卫星细胞的本体外培养、增殖体系，为细胞移植治疗泌尿外科疾病做好技术上的准备。

骨骼肌的原代培养法

骨骼肌的原代培养一.试剂1.包被用多聚赖氨酸poly-lysine的配制与包被1）准备0.94%硼酸溶液称取0.94硼酸粉末溶于80ml水中，用NaOH将pH值调至8.4，再定容。

2）按每4.9mg多聚赖氨酸粉末溶解于98ml0.94%硼酸溶液配制100ml.3）0.22µM过滤分装，-20°C储存，避免反复冻融。

4）包被：按10cm皿用4ml包被液进行包被，4°C过夜或37°C 2 小时后，吸干，回收包被液，包被过的皿置4°C保存可达一个月，临用前用PBS或灭菌的去离子水洗3遍再使用，整个包被过程均为无菌操作。

多聚赖氨酸溶液是广泛应用的组织切片与玻片黏合剂，该多聚阳离子分子与组织切片上的阴离子相互作用会产生较强的黏合力。

也可用于细胞培养，增加细胞贴壁能力。

多聚赖氨酸包被培养板使用前是用灭菌的去离子水稀释，最好不要用双蒸水或别的，因为多聚赖氨酸包被的原理是通过改变器皿表面的电荷而促进细胞的黏附。

2. 0.1% I型胶原酶（1mg/ml）100mg I型胶原酶溶于100ml D-hank’s液中，过滤后4°C保存。

3. D-hank’s液（可以直接购买使用）KCl 0.40g，KH2PO4 0.06g，NaCl 8.00g, NaHCO30.35g, NaH2PO4·7H2O 0.09g，酚红0.01g。

以上均为分析纯，加三蒸水定容至1L后高压灭菌，4℃分装备用;4. 血清的灭活:常用的血清要先在56℃水浴中灭活30min方可使用。

灭活后-20℃保存备用;5. 细胞生长液的配制(100mL):即含20%胎牛血清的DMEM/F12培养液。

取20ml灭活的血清，再加青、链霉素各100IU，然后用DMEM/F12培养基补充到100 mL，4℃保存备用。

6. 0.1%胶原酶II(100 mL)的制备:称取胶原酶II 100mg用100mL DMEM/F12液充分溶解，0.22µM过滤后分装备用，-20℃保存;7. 75%乙醇8. Mini-Q(超纯水)--灭菌无离子水二.实验器械1、培养皿2、培养瓶3、直剪和眼科剪4、眼科镊和止血钳5、烧杯6、15ml离心管三、正常小鼠原代骨骼肌细胞培养实验流程取肌肉于平皿，Hank’s洗3次↓剔除脂肪、结缔组织↓肌肉标本剪约0.1cm3小块↓移至离心管，Hank’s洗3次↓静置1min，弃去上层液及漂浮组织↓0.25%胰酶，37度水浴消化20min，每5min摇动或吹打1次↓生长培养基终止消化，反复吹打，依次100，200，400目过筛↓离心，1000rmp,10min，弃去上清↓重悬，计数细胞，接种密度以5 × 105个/ml↓悬液加入未经PPL包被培养瓶中，差速贴壁去除成纤维细胞，37度，1h↓转移包被瓶中，生长培养基培养，培养37℃，5%CO2↓4d换液，以后每天换四、实验操作1、新生小鼠拉颈椎处死，乙醇消毒腿部，在超净工作台内，取肌肉于平皿，Hank’s 洗3次，剔除脂肪、结缔组织，将肌肉标本剪约0.1cm3小块；2、将剪碎的肌肉移至离心管，Hank’s洗3次，静置1min，弃去上层液及漂浮组织；3、向上述离心管中加入0.25%胰酶，37度水浴消化20min，每5min摇动或吹打1次离心管，然后加入生长培养基终止消化；4、反复吹打后，依次100，200，400目过筛，滤液收集后，1000r/min离心10min；5、弃去清夜，用生长培养基重悬细胞，悬液加入未经PPL包被的培养瓶中，差速贴壁去除成纤维细胞，37度培养1h后，转移包被瓶中，生长培养基培养，4d 换液，以后每天换液1次。

大鼠血管平滑肌细胞的原代培养及鉴定

１．１材料。动物来源ｔ健康Ｗｉｓｔａｒ大鼠，由第三军大学实验动物中心提供。雌苏后任能旺盛生长。雄不限，体重１８０～２００ｇ。ＤＭＥＭ高糖培养基（美国Ｇｉｂｃｏ公司），Ｈｅｐｅｓ（索莱３讨论宝），优质胎牛血清（原代培养浓度２０，传代培养浓度１ｏ，美国Ｈｙｃｌｏｎｅ），胰蛋血管平滑肌细胞异常增殖和迁移是所有损伤性血管疾病的共同病理生理学改血管损伤后狭窄严重制约了这些疾病的远期疗白酶，鼠单抗肌动蛋白ｓＭＡ、ＳＭ２２、Ｃａｌｐｏｎｉｎ（北京博奥森生物），ＤＡＢ显色试剂盒，变，由其造成的动脉粥样硬化形成、５］。因此．研究防治ＶＳＭＣ异常增殖在细胞和分子生物通用型免疫组化检测试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）其余试剂均为国产效，威协患者的生命安全［学中的变化成为血管生物学领域研究的热点［６，７ｌ。体外大鼠胸主动脉平滑肌细胞分析纯。
２０１刚嘲蘼
大鼠血管平滑肌细胞的原代培养及鉴定
曾羽熊伟（贵州遵义医学院贵州遵义５６３００３）
【摘要】目的：探讨大鼠胸主动脉平滑肌细胞原代培养的方法，观察其生长特性，为相关研究提供实验材料。方法：组织块贴壁法培养大鼠血管平滑肌细胞，胰酶消化法进行传代，倒置显微镜观察细胞生长特点，用平滑肌细胞的３种标记分子（ＳＭＡ、ＳＭ２２、Ｃａｌｐｏｎｉｎ）免疫细胞化学法鉴定细胞的纯度，掌握细胞的冻存与复苏。结果：织块接种于培养瓶内４ — ６天即可见数个细胞以垂直方向从组织块边缘游出，培养至２周游出细胞逐渐向组织块周围生长形成细胞晕，进而形成细胞簇，镜下可见细胞呈典型的“ 蜂” “ 谷” 样生长，免疫细胞化学显示平滑肌细胞的３种标记分子均为阳性表达。结论：组织块贴壁法简便、经济，培养的平滑肌细胞数量多、生长状态良好，为研究心血管疾病提供良好的体外模型。【关键词】大鼠－血管平滑肌细胞；原代培养；冻存；复苏【中圈分类号】Ｒ３２９【文献标识码ＩＡ

成年大鼠骨骼肌成肌细胞的培养和鉴定

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（尔滨医科大学第二临床医学院老年病科，龙江哈尔滨１００）哈黑５０１
【摘要］目的探索成年大鼠骨骼肌成肌细胞的高浓度培养方法。方法以成年同种系ｗｉａ大鼠为研究对象，ｓｒｔ
采用两步消化法获取大鼠骨骼肌卫星细胞，进行体外培养，对获得的细胞进行形态学研究，以免疫组织化学方法进行鉴定。结果细胞增殖旺盛，分化良好，可融合成肌管。免疫细胞化学染色显示，骨骼肌卫星细胞呈弱阳性，肌管呈强阳性。结论两步消化法体外培养的骨骼肌卫星细胞具有良好的增殖与分化能力，用此种方法可培养出高纯度的骨骼肌成肌细胞，操作简单、污染少。［关键词］骨骼肌；成肌细胞；培养［中图分类号］３Ｒ２［文献标识码］Ａ［文章编号］０ｏ一１０（０９Ｏ０３０１ｏ９５２ｏ）２— １７— ３
ｍｙｂａｔｎｄｏｘｌｒｔｅｉｌｇｃｌｈＩｃｅｉｔｃ０ｔｅｕｔＩｄｅｌ．ＭｅｈＯｓ０ｌｓｓａｔｅｐ０ｅｈｂ００ｉａｃａｌｔｒｓｉｓｆｈｃｌｕ－ｃｌｓａｅｔｄＲａｓｅｅａｔｋｌｔｌｍｕｓｌａｅｌｅｃｌｓｗｅｅ０ｔｉｅｔｈｗｏｓｅｉｅｔｏｓｎｙｅＩｃｌｇｎｓｎ巧ｐｉｎｃｅｓｔｌｉｅｌｒｂａｎｄｗｉｈｔｅｔ－ｔｐｄｇｓｉｎｕｉｇｔｐ０ｌｅａｅａｄｔｓｎａｄｔａｐｓａｅ０ｌｗｉｒｍａｙｃｌｕｅａｓｇｄｆｌ０ｎｇｐｉｒｕｔｒｒ．Ｔｈｅｌｓ０ｅｅｌｗｅｅ０ｎｅａｄｂｓｒｅｉｈｍｉｒｓ０ｙｒｃｕｔｄｎ０ｅｖｄｂｙｌｇｔｃ０ｃｐ

原代培养心肌细胞

原代培养心肌细胞1新生大鼠鼠龄的选择新生大鼠心肌细胞在出生后3 d内具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖能力.因此，大鼠出生时间越短，其心肌细胞分离后成活率越高，越容易贴壁生长.大量观测表明，选择1~3 d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养较为理想.其中尤以半日龄大鼠心肌细胞培养效果最佳.2消化酶的选择及使用新生大鼠心肌细胞的分离可采用组织块法和消化法，前者因不易获得密度均一的细胞且难控制成纤维细胞的生长而较少采用.消化法中常使用的酶有3种：胰蛋白酶、胶原酶I或Ⅱ以及透明质酸酶.透明质酸酶多与胰蛋白酶或胶原酶联合应用.胰蛋白酶作用较强，容易造成心肌细胞损坏.胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤小，且在新生大鼠心肌组织，以胶原I为主,故我们选用胶原酶I.文献报道胶原酶的工作浓度一般在0.6~1 g?L1,我们使用的为0.8 g?L1.胶原酶最好现用现配.3消化程度的把握新生大鼠心肌细胞对酶消化极为敏感.消化过度可使肌原纤维出现萎缩，细胞死亡率增加或丧失贴壁能力及搏动能力；消化不足，细胞聚集成团，无法分清细胞边界，难以形态学观测.消化过程中使用磁力搅拌器时应注意1)转速一般控制在60~80 r?min1左右.(2)每次消化的时间须结合消化酶浓度确定.(3)将粘附在搅拌子上的心肌组织吹散，使酶液充分接触组织.(4)适宜温度为35~37℃.(5)当组织由红转白呈半透明状态时，应停止消化.4接种的细胞密度心肌细胞接种密度不仅影响细胞间的相互接触，进而影响细胞对肥大刺激的反应，而且影响长期培养细胞的成活率.接种细胞的绝对数量应经精确计算.一般而言，应根据实验的观测目的决定单位面积上的细胞数量.例如，如作形态学观测,六孔板中每孔的接种细胞数量应控制在1×105~2×105个；若需收获心肌细胞作mRNA或蛋白表达水平的观测，则每孔的接种密度可增加到5×105~6×105个.5细胞的分散度与接种的均匀性分离出的心肌细胞，在溶液中Ca2+作用下较容易出现集聚现象.因此，在进行差速贴壁前后，均应反复多次地轻柔吹打使心肌细胞成单个分散状态.接种后，应小心使心肌细胞均匀地分布于培养板上,避免细胞向培养孔的中央集聚.此外，可将培养板放入孵箱后用滴管轻轻吹打各孔中央部位2~3次，但应格外注意避免污染.6对成纤维细胞的抑制与血清种类的选择成纤维细胞较心肌细胞更容易贴壁且具有分裂增殖能力，经差速贴壁后仍有少量成纤维细胞混杂于心肌细胞之中，若处理不当，很容易生长成优势细胞.溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine, BrdU)可干扰细胞的有丝分裂，故常规使用BrdU抑制成纤维细胞的生长.但是，如果使用胎牛血清培养细胞，由于胎牛血清所含的促细胞有丝分裂的因子较多，BrdU很难完全抑制成纤维细胞的生长.改用小牛血清则可克服这种现象的出现，获得高达90％以上的心肌细胞.7换液时间进行心肌细胞形态学观测时，接种密度较低，贴壁的心肌细胞数量减少，为避免成活心肌细胞随换液而被丢弃，应在接种48 h后换液.这样不仅使贴壁的心肌细胞数量明显增加，而且BrdU作用时间较长，对成纤维细胞的抑制作用更确实.此外，去血清后可用ITS和0.1 g?L1BSA对心肌细胞进行营养支持，对心肌细胞贴壁率与凋亡率均不产生明显影响.8抗污染措施除应注意无菌操作等常规技术方法外，还应特别注意以下几点：(1)获取心脏时避免剪破消化道.比较稳妥的办法是在剑突上一肋处入剪，这样做不涉及腹腔，也就减少了污染机会.(2)如条件允许，应避免乳鼠心肌细胞与其他细胞在同一孵箱内共同培养，以防止发生交叉污染.(3)对于培养心肌细胞的观察、照相每次时间不可过长，否则既会导致培养液pH改变，又能增加污染机率.9培养液pH值适宜的pH范围在7.2~7.4之间，配制及使用培养液时应注意：(1) pH值会在过滤后上升0.1~0.3.(2)培养液中加入血清后pH值会有降低，降低程度与血清品质和含量有关.(3)应及时换液.(4)配制好的培养液不宜长时间贮存在4℃.这是因为培养液中的CO2会溢出，使培养液pH上升.每次配好的培养液尽量在2 wk内用完，否则应部分置于－20℃保存，使用前应补充谷氨酰胺和NaHCO3，再次过滤后方可使用.。

大鼠成骨细胞的原代培养和鉴定

Li XF, Zhao JM, Su W, Fan Q, Luo SX, Ma AG. Primary culture and identification of rat osteoblasts.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2011;15(6):990-994. [ ]
Abstract
BACKGROUND: Tissue engineering requires a lot of seed cells. Osteoblasts have become an important seed cells in bone tissue engineering. However, there are the difficulties to derive osteoblasts and the different purity of osteoblasts was obtained. OBJECTIVE: To establish the methods of isolated culture and purification of neonatal rat calvarial osteoblasts, and to observe the biological characteristics of the osteoblasts from the skull. METHODS: Osteoblasts of Sprague-Dawley neonatal rats were primarily cultured and proliferated by the second enzyme digestion. Osteoblasts were purified by differential attachment method. Osteoblast proliferation and osteogenic activity were identified by morphology, alkaline phosphatase detection, Alizarin red staining and calcium nodules Von kossa staining, ultrastructure and cell proliferation curve. RESULTS AND CONCLUSION: Primarily cultured calvarial osteoblasts could proliferate by the secondary source of enzyme digestion. The amplification cells showed representative morphological and biological characteristics of osteoblasts. Alkaline phosphatase, Alizarin red staining and calcium nodules Von kossa staining presented positive results. Ultrastructural features appeared as high-differentiated active osteoblasts. Cell proliferation curves showed active cells. Results indicated that calvarial osteoblast of Sprague-Dawley rat has good proliferation and osteogenic activity and can be continuously passaged, with high purity, cell biological characteristics of stability. Calvarial osteoblast is suitable for experiment in vitro.

骨骼肌卫星细胞的原代、传代培养和鉴定

骨骼肌卫星细胞的原代、传代培养和鉴定作者：宋策来源：《新教育时代》2015年第08期一、骨骼肌卫星细胞简介骨骼肌卫星细胞最初被人们认为是骨骼肌的定向祖细胞，对骨骼肌的生长和伤后再生起重要作用。

1961年，Mauro在对青蛙的胫前肌做研究时，利用电子显微镜，从肌膜和基底膜之间发现了骨骼肌卫星细胞。

一般情况下，这些细胞处于静止状态，当骨骼肌受损、坏死或负荷过重等应激出现时，卫星细胞就能被激活，开始迁移至受损部位，然后增殖分化形成肌管，从而达到修复肌肉的目的。

二、骨骼肌卫星细胞的原代培养取SD大鼠一只，使用10%浓度水合氯醛进行腹腔注射麻醉，其计量约为0.4ml/100g。

静置大鼠数分钟直至其结膜反射消失，用镊子将其浸泡在75%酒精中消毒2-3分钟后，仰卧位固定，使用采血针吸除血液，提取腓肠肌和比目鱼肌，置入事先消毒并预冷的生理盐水中，然后迅速转移至超净工作台，取冰袋置于操作容器下方。

使用双抗PBS骨骼肌清洗液对获得的肌肉清洗3-4次，快速清除血管、肌筋膜以及脂肪等组织后，将肌肉均匀剪碎至1mm3 大小左右。

再次加入骨骼肌清洗液清洗，静置后弃漂浮物。

将适量的II型胶原酶消化液（0.1%）加入被剪碎的肌肉中，使用37℃磁力搅拌机让肌肉均匀消化约60分钟，转移至离心管，以1000rpm离心10分钟，吸除上清液。

根据沉淀体积加入适量的胰酶细胞消化液，磁力搅拌消化约20分钟，加入细胞种植液终止消化，将此时的肌肉悬液转移至离心管，以1000rpm离心10分钟，吸除上清液，在肌肉沉淀中加入10ml细胞种植液，均匀吹打成细胞悬液。

将细胞悬液依次加入200目、400目的细胞筛中过滤纯化。

均匀吹打滤液并接种于6孔细胞培养板中，置于培养箱（5%CO2，37℃，100%空气湿度）中培养2小时，细胞进行第一次差速贴壁后，将细胞液转移至新的6孔板中继续在培养箱（5%CO2，37℃，100%空气湿度）里培养2小时。

然后将细胞悬液转移至提前用0.001%多聚赖氨酸工作液包被过的6孔板中。

大鼠骨骼肌卫星细胞的原代培养和鉴定

显示，α-actin 蛋白和 Desmin 蛋白在两种细胞胞浆中均有分布。结论用组织块培养法获取的骨骼肌卫星细胞具有良
好的增殖与分化能力，用此种方法可培养出高纯度的骨骼肌卫星细胞。
关键词：骨骼肌卫星细胞；组织块培养技术；Desmin 蛋白
学研究及采用免疫荧光和免疫组织化学法测定两种细胞 α-actin 蛋白和 Desmin 蛋白的表达及分布，从而对骨骼肌卫
星细胞进行鉴定。结果通过组织块培养法获取的细胞增殖旺盛，分化良好。免疫细胞荧光和免疫组织化学实验结果
骨骼肌卫星细胞是机体骨骼肌组织中未分化的细胞，位于骨骼肌细胞基底膜与肌纤维浆膜之间，是源于胚胎中胚层的干细胞［1］。在正常状态下处于静止期，受外界刺激时或在应激状态下可以分裂、增生，并可融合成多核细胞及形成新的肌纤维。研究表明，骨骼肌受创伤后及肌纤维再生和修复过程中卫星细胞发挥了重要的生物学作用［2］。
中识码： A
文章编号：1672-3619 （2011）04-0395-03
Cultivation and identification of rat skeletal muscle satellite cells
CHEN Si-fan1，2，LI Wen-xue1，CHEN Jian-ling1，2，YANG Guang-yu1，LIU Hua-zhang1，ZHU Wei1 （1．Guangzhou Center for Disease Control and Prevention， Guangdong，Guangzhou 510080； 2．School of Public Health，Sun Yat-sen University， Guangdong，Guangzhou 510080，China）

新生大鼠肌源性干细胞的原代培养和鉴定解读

新生大鼠肌源性干细胞的原代培养和鉴定[ 11-03-31 13:04:00 ] 作者：刘福强编辑：studa20【摘要】目的探讨骨骼肌源性干细胞体外培养、鉴定的方法。

方法采用I型胶原酶和胰蛋白酶两步消化法分离大鼠骨骼肌源性干细胞，经差速贴壁法纯化后，培养液中培养。

倒置显微镜观察细胞形态，生长曲线分析肌源性干细胞的增殖能力，结蛋白细胞免疫荧光方法鉴定肌源性干细胞。

结果经过两步消化和差速贴壁后，成功培养出高纯度的肌源性干细胞，细胞免疫荧光结果为desmin(+)。

结论通过体外原代培养获得高纯度肌源性干细胞，结蛋白细胞免疫荧光可以对其早期鉴定，为组织工程的临床应用提供种子细胞。

【关键词】大鼠肌源性干细胞体外培养Abstract：Objective To establish the methods for culture and identification of rat muscle-derived stem cells invitro.Methods By two-step method, the rat muscle was digested with type I collagen and trypsin, and the isolated cell suspension was purified by different adhesion time . The proliferation ability of muscle-derived stem cells was analysed through studying growth curve, and the obtained cells were identified with cell immunofluroescence technique．Results Highly purified MDSCs were harvested and they showed desmin(+) by cell immunofluroescence technique．Conclusions MDSCs can be cultured in vitro and can be identified by desmin stain and used to tissue engineering as “seed”cells.Key words：rat ; muscle derived stem cells ; culture in vitro近年研究发现，成体骨骼肌中不但存在单能的成肌干细胞－卫星细胞，而且还含有多能的“肌源性干细胞”（muscle derived stem cells，MDSCs）。

成人骨骼肌细胞原代培养

成人骨骼肌细胞原代培养
吕捷;赵春礼;李玉成;张进禄;徐群渊
【期刊名称】《神经解剖学杂志》
【年(卷),期】2001(17)1
【摘要】本研究以获取基因治疗自体移植的载体为目的 ,观察了生长因子对成人骨骼肌卫星细胞增殖的影响。

用手术中取得的成人骨骼肌进行体外组织块培养及酶消化培养 ,用成纤维细胞生长因子及表皮生长因子进行处理 ,作动态观察。

结果证明 ,消化分离出的肌卫星细胞数量极少 ,培养不能成活 ;组织块培养肌卫星细胞的增殖与生长因子的作用有关 ,成纤维细胞生长因子及表皮生长因子处理组的增殖细胞数显著高于对照组。

提示 ,生长因子可促进成年人骨骼肌卫星细胞增殖 ,但与其年龄及部位有一定关系。

【总页数】3页(P75-76)
【关键词】成纤维细胞生长因子;表皮生长因子;卫星细胞;骨骼肌;成人;细胞培养【作者】吕捷;赵春礼;李玉成;张进禄;徐群渊
【作者单位】首都医科大学北京神经科学研究所;北京积水潭医院手外科
【正文语种】中文
【中图分类】R329.2;Q954.6－33
【相关文献】
1.大鼠骨骼肌细胞的原代培养及鉴定 [J], 侯士方;孟馨;相泓冰;王涤非
2.原代培养骨骼肌细胞胰岛素抵抗模型的建立 [J], 穆颖;季爱玲;刘寒强;许朝晖;王
枫
3.pCDNA3-AADC真核表达载体的构建及其在原代培养骨骼肌细胞中的表达 [J], 刘军;肖颂华;陶恩祥;梁秀龄;邢诒刚
4.成年大鼠骨骼肌成肌细胞的原代培养 [J], 徐丰
5.原代培养的成人心肌细胞及非肌细胞中心体的免疫荧光染色观察 [J], 易铁敏;陈享
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