实验 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化1. 引言大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛应用于生物学研究和工业生产中。
其中，大肠杆菌感受态细胞的制备与转化是生物工程领域中的重要技术，对于基因工程、药物研发等方面具有广泛的应用价值。
2. 大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌感受态细胞的制备是通过基因工程手段将目标基因（外源基因）导入大肠杆菌细胞内，使其表达目标蛋白或产生目标产物。
通常情况下，制备大肠杆菌感受态细胞需要进行以下步骤：2.1 培养基的选择在进行大肠杆菌感受态细胞的制备过程中，需要选择适合的培养基。
常用的培养基包括LB培养基、SOB培养基等，这些培养基中含有适量的氨基酸、碳源等，能够满足大肠杆菌细胞的生长需求。
2.2 载体的构建在进行大肠杆菌感受态细胞的制备时，需要将目标基因导入大肠杆菌细胞内。
这一过程中，通常需要将目标基因插入至载体（如质粒）中，构建重组质粒。
2.3 转化大肠杆菌细胞转化是将重组质粒导入大肠杆菌细胞内的过程。
常用的转化方法包括热激转化、电穿孔法等。
通过这些方法，可以将构建好的重组质粒导入大肠杆菌细胞内。
3. 大肠杆菌感受态细胞的转化大肠杆菌感受态细胞的转化是基因工程中的一个重要步骤，该技术可以使外源DNA片段导入并稳定集成到大肠杆菌的染色体内。
3.1 转化方法大肠杆菌感受态细胞的转化有多种方法，如热激转化法、化学转化法和电穿孔法等。
这些方法都是通过改变细菌细胞膜通透性，使外源DNA片段能够进入细胞内。
3.2 转化效率的影响因素影响大肠杆菌感受态细胞转化效率的因素很多，包括DNA片段的长度、外源DNA的纯度、细胞复活时间、转化温度等。
在进行大肠杆菌感受态细胞的转化时，需要考虑这些因素，以提高转化效率。
4. 个人观点和理解大肠杆菌感受态细胞的制备与转化是生物工程中的重要技术，对于基因工程、蛋白表达等方面具有重要意义。
通过对该技术的深入了解和实践，可提高对基因工程的理解与实践能力。
实验5：大肠杆菌感受态细胞的制备和质粒DNA转化报告
感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态 细胞总数
五、注意事项
1、冰上操作； 2、无菌操作； 3、重悬细胞时操作要轻； 4、实验应设有阳性对照，以估计转化效率；
应设立阴性对照，以消除可能的污染及查 明可能的失败原因。
实验四 大肠杆菌感受
态细胞的制备和质粒 DNA转化
实验目的和要求
学习CaCl2法制备大肠杆菌感受态 细胞；
学习用热激法将外源基因导入感受 态细胞。
实验原理 实验材料 实验步骤 预期结果 注意事项
一、实验原理（CaCl2法、热激法）
1、几个概念
转化( Transformation )是将异源 DNA 分子引入另 一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种 手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研 究的基本实验技术。
(一) 纯化及活化菌种（无抗生素的LB ）
单菌落
l mL培养液
冻存菌在新鲜LB
平板上，划线， 37℃培养16~20 h。
挑一单菌落接种到3 mL LB液体培养基 中，37℃培养过夜
取l mL培养液加到 100 mL LB液体培养 基中，37℃摇床培养 2~3 h ，当其OD600 为0.3～0.5时(细胞数 <108/mL)，立即取出， 冰浴10～15 min。
(二) CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞
l、将菌液转移到两个冰冷离心管中，平衡 后于4℃，5000 r/min离心10 min，弃尽上 清(可用加样器将残余液体尽量去净)。— —收集沉淀
2、各加10 mL 0.1 mol/L冰冷的无菌CaCl2溶 液重悬细胞，于冰上放置15 min．于4℃， 5000 r/min离心10min，弃上清。 —— CaCl2洗涤细胞转化效率的因素
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告摘要：本实验旨在研究大肠杆菌感受态细胞的制备和转化方法。
通过对感受态细胞的制备和转化实验的设计和操作，我们成功获得了转化子，并验证了转化效率。
实验结果表明，制备和转化感受态细胞是一种有效的基因工程技术，可用于基因克隆和表达研究。
引言：大肠杆菌是一种常见的细菌，在基因工程领域被广泛应用于基因克隆、表达和蛋白质生产等研究。
然而，大肠杆菌在自然状态下对外源DNA的吸收能力较差，因此需要将其转化为感受态细胞，以便进行基因操作。
感受态细胞的制备和转化是基因工程研究中的重要步骤。
本实验旨在探究大肠杆菌感受态细胞的制备和转化方法，并验证其可行性。
材料与方法：1. 大肠杆菌菌种：选用E. coli DH5α菌株作为实验对象。
2. 培养基：LB培养基。
3. 转化子：选用pUC19质粒作为转化子。
4. 热激转化：将感受态细胞与转化子混合后，通过热激转化的方法将外源DNA转化入细胞。
5. 酒精沉淀：将转化子沉淀后，通过酒精沉淀的方法提取转化子。
结果与讨论：在本实验中，我们首先制备了感受态细胞。
通过在LB培养基中培养大肠杆菌DH5α菌株，使其进入对外源DNA的吸收状态。
然后，我们将感受态细胞与转化子pUC19质粒混合，并进行热激转化。
转化子中的抗生素抗性基因能够在转化后表达，从而筛选出转化子。
最后，我们通过酒精沉淀的方法提取转化子。
为了验证转化效率，我们进行了转化效率测试。
将转化子接种到含有抗生素的LB平板上，培养一夜后，我们观察到形成了菌落。
通过计算菌落的数量，我们可以得出转化效率。
实验结果显示，转化效率达到了10^6 CFU/μg DNA，表明我们成功转化了感受态细胞。
感受态细胞的制备和转化是基因工程研究中的关键步骤。
通过转化外源DNA，我们可以将目标基因导入大肠杆菌，实现基因克隆和表达。
本实验中使用的热激转化和酒精沉淀方法是常见的转化方法，其简单易行，且转化效率高。
3-大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
实验四：大肠杆菌感受态细胞的制备与重组质粒转化一、目的1.了解感受态细胞生理特性及制备条件，掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。
2.掌握质粒DNA 转化大肠杆菌的方法，了解转化的条件和利用半乳糖苷酶基因插入失活选择重组质粒DNA 的原理。
二、原理（一）大肠杆菌感受态细胞制备的原理所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。
感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA的结合和加工等。
细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA 分子的受体位点等。
本实验为了把外源DNA（重组质粒）引入大肠杆菌，就必须先制备能吸收外来DNA分子的感受态细胞。
在细菌中，能发生感受态细胞是占极少数。
而且，细菌的感受态是在短暂时间内发生。
目前对感受态细胞能接受外来DNA 分子的本质看法不一。
主要有两种假说：1、局部原生质体化假说——细胞表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA 分子能通过质膜进细胞。
证据有：（1）发芽的芽孢杆菌容易转化；（2）大肠杆菌的原生质体不能被噬菌体感染，却能受噬菌体DNA 转化；（3）适量的溶菌酶能提高转化率。
2、酶受体假说——感受态细胞的表面形成一种能接受DNA 的酶位点，使DNA分子能进入细胞。
证据是：（1）蛋白质合成的抑制剂如氯霉素，可以抑制转化作用；（2）细胞分裂过程中，一直有局部原生质化，但感受态只在生长对数期的中早期出现；（3）分离到感受态因子，能使非感受态细胞转变为感受细胞。
目前对感受态细胞的转化理论尚未有统一结论，但是许多实验室一直进行探索，试图从实验中获得明确回答。
有人根据pBR322 质粒DNA对E·coli K——12X1776菌株的转化结果，认为：（1）大肠杆菌受体菌培养时间为OD550=0.2—0.3（5—6107细胞/毫升）最好；（2）菌体用预冷的CaCl2洗涤二次，效果较好；（3）100mmol/LCaCl2处理可获得最高转化率；（4）菌体在pH 为6.0 的溶液悬浮时最为适宜。
大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒DNA的转化[荟萃知识]
![大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒DNA的转化[荟萃知识]](https://img.taocdn.com/s3/m/293188f5561252d381eb6e72.png)
行业知识
• CaCl2 法是目前常用的感受态细胞制备方 法，简便易行，且其转化效率完全可以 满足一般实验的要求，制备出的感受态 细胞暂时不用时，可加入占总体积15％ 的无菌甘油于-70℃保存(半年)，因此 CaCl2法使用更广泛。
行业知识
③ 彻底弃去上清液，再加入0.6mL冰冷的 0.1mo1／L CaCl2溶液缓和悬菌，冰浴10 min ； ④ 4000r／min离心10min； ⑤ 弃去上清液，加入0.2mL冰冷的0.1mo1/L CaCl2溶液缓和悬菌，冰上放置待用。
行业知识
• 质粒DNA的转化
① 分别用2个100µl感受态细胞悬液(如是冷 冻保存液，则需化冻后马上进行下面操 作：
大肠杆菌感受态细胞的制备 与质粒DNA的转化
行业知识
• 实验目的 • 实验原理 • 实验试剂 • 实验步骤 • 注意事项
行业知识
一、实验目的
• 了解转化的概念及其在分子生物学研究 中的意义。
• 学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞 的方法。
• 学习将外源质粒 DNA 转入受体菌细胞并 筛选转化体的方法。
行业知识
四、实验步骤
• 大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2法)
①从E.coli DH5α菌平板上挑取一单菌落，接种于LB 液体培养基中，37℃振荡培养过夜。将该菌悬液 以1:30～100接种于LB液体培养基中，37℃ 250r/min活化培养2-3h至OD600=0.2-0.4时停止培 养;
②每人取1个离心管，加入1.5ml菌液，在冰上放置 10min后，于4℃，4000r／min离心2min（从这一 步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而 稳）；
大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化_实验报告
分子生物学实验报告实验名称：大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化班级：生工xxxx姓名：xxx学号：xxx日期：xxx大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化1 引言在分子生物学日益普及的今天，基因操作已成为一项重要的常规技术。
体外连接的DNA重组体导入合适的受体细胞便能大量地复制、增殖和表达，从而得到大量的重组基因，其中尤以转化为主[1]。
感受态细胞的制备是分子生物学研究中的一个重要环节，其制备质量的好坏直接影响到后续实验工作的进行。
本次实验的目的旨在了解转化的概念，及其在分子生物学研究中的意义，学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。
2 材料和方法2.1 实验原理质粒DNA需经过转化过程（transformation），才能将其导入感受态细胞（competent cell）或者大肠杆菌体中，然后通过寄主细菌的系统来达到复制DNA 的目的。
进行细菌转化作用最常用的一种方法是加入大量的氯化钙（calcium chloride），导致大肠杆菌的细胞壁发生结构上的变化，变成感受态细胞，而有利于质体DNA进入细菌细胞内。
大部分大肠杆菌品系的转化效率在105-108之间，即每μg质粒DNA中成功的转化细胞数目，影响此效率的因子与感受态细胞状況或吸收DNA的能力有关。
而这2项因子又受细菌是否处于对数生长期、处理时是否将细胞保持在4°C以下，以及氯化钙处理细胞的时间影响。
感受态细胞制备完成后，利用热休克处理，使细胞质膜的油脂变性而刺激转化作用，而后给予一段时间恢复后，可用对抗生素之抗性标记，进行筛选工作。
本实验是利用冰冷的氯化钙溶液制备感受态细胞，其转化效率约在105-107之间。
转化（transformation）是将异源DNA分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传形状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
本实验以E coli DH5α菌株为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于感受态，然后与pMD18-T载体共保温，实现转化。
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
3. 将菌液快速置于冰上。以下步骤务必在超净工作台和冰上操作； 4. 吸收1.5ml培养好菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟； 5. 4℃下3000g冷冻离心5分钟； 6. 弃去上清，加入1500 l冰凉10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
第5页
试验步骤
CaCl2感受态细胞制备试验步骤 电转化法制备大肠杆菌感受态细胞试验步骤
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
第6页
CaCl2感受态细胞制备试验步骤
1. 前夜接种受体菌（DH5 或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中 37℃摇床培养过夜（约16小时）；
2 . 取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37℃摇床上猛烈振 荡培养约2.5-3小时（250-300rpm）；
热激法是利用冰凉CaCl2处理对数生长久细 胞, 能够诱导其产生短暂“感受态”, 易于摄取外源 DNA。转化效率为106 ～107转化子/µg DNA。
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
第3页
试验仪器
1 . 超净工作台 2 . 低温离心机 3 . 恒温摇床 4 . 恒温培养箱 5 . -70 ℃ 冰箱 6 . 制冰机 7 . 移液器 50ul 、200ul 、1000ul
悬浮；
7. 4℃下3000g冷冻离心5分钟 8. 弃去上清，加入750 l冰凉10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新
悬浮；
9. 4℃下3000g冷冻离心5分钟 10. 加入20 l冰凉10%甘油，用移液器轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮； 11. 马上使用或快速置于-70ºC超低温保留。
实验大肠杆菌感受态细胞制备及铺平板筛选转化子
大肠杆菌感受态细胞制备及质粒转化及铺平板筛选转化子一、实验目的了解大肠杆菌感受态细胞制备、质粒转化大肠杆菌、转化子筛选的原理和一般方法。
二、实验原理质粒是基因工程的常用载体，携带外源基因的质粒可进入经过一定处理、容易接受外源基因的受体细胞，即感受态细胞，并在受体细胞内扩增（基因克隆）或表达外源基因（基因表达）。
质粒载体或携带外源基因的质粒进入受体细胞的过程称为转化，质粒转化的受体细胞称为转化子。
（一）制备感受态细胞常用方法：1.电击法（电穿孔法）。
电转法需要仪器，超螺旋质粒转化效率大于109转化子 /μgDNA)。
2.化学诱导法：a. CaCl2法：CaCl2试剂便宜、易得，超螺旋质粒转化效率大约为106－108转化子 /μgDN。
b. PEG法：PEG法制备方法更简便（一步完成），超螺旋质粒转化效率大约为106－108 转化子 /μgDNA。
（二）关于质粒：1.质粒是一种寄生于宿主细胞中染色体外裸露的双链DNA分子。
2.质粒的特点a.在宿主细胞中，质粒一般以超螺旋共价闭环DNA分子b.能自主复制、但其复制受到宿主细胞的控制，需要利用宿主的酶系统。
c.复制产物可正确分配给子代细胞3.质粒的用途: 主要作为基因重组的一种载体。
4.提取质粒的大致过程：扩增宿主菌：加适宜的抗生素（特异抗生素、氯霉素）。
裂解宿主菌：碱处理法、加热处理法、去污剂处理法、酶法。
提取质粒：变性沉淀其他物质、分离质粒。
纯化质粒：琼脂糖凝胶电泳、离子交换层析、氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心。
5.选择裂解方法原则选择裂解方法主要取决于质粒的大小。
(1)大质粒(大于15kb)选用缓和裂解法。
用溶菌酶和EDTA进行处理，破坏细胞壁和细胞外膜，再加入SDS一类去污剂溶解原生质体。
(2)小质粒用较剧烈的方法分离。
在加入EDTA后让细菌暴露于去污剂，通过煮沸或碱处理使之裂解。
受体细胞经过一些特殊方法处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，使外源DNA能够进入；进入受体细胞的DNA分子可表达其携带的某些基因（如抗生素抗性、酶等选择标记基因），使转化细胞在选择培养基上表现出不同于未转化细胞的特征，从而可将转化细胞选择出来。
大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验反思
大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验反思【原创版3篇】目录（篇1）1.实验目的与原理2.实验步骤3.实验结果与分析4.实验反思正文（篇1）一、实验目的与原理大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验旨在通过转化方法将外源基因导入大肠杆菌中，从而实现目的基因的表达。
实验原理主要基于重组 DNA 技术，通过外源 DNA 与载体 DNA 的连接，形成重组表达载体，然后将载体转化入大肠杆菌细胞内，使外源基因得以在细胞内表达。
二、实验步骤1.制备大肠杆菌感受态细胞（1）将 500 ml DH5a 的培养物在 LB 中培养至 OD 0.4-0.5（2）将培养瓶在冰浴中摇动 1-2 分钟以预冷细胞（3）将细胞置于无菌预冷离心瓶中，在 5K、4 下旋转 10 分钟（4）弃上清，并将菌液重浮于 1/10 体积 (即 50 毫升) 的冰冷的TSS 中（5）将 05 ml 样品放入预冷的无菌 Eppendorf 试管中，在液氮中快速冷冻。
在一 70C 下储存 KCM 感受态细胞2.转化实验（1）加入 20ul 5XKCM，加入 DNA 和 dd H20 至总体积为 100ul，保持冰上（2）加入 100ul 感受态细胞，混合并在冰上保持 20 分钟（3）37 热激 90 秒（4）向试管中加入 1ml 预热的 LB，在 37 温育 40-60 分钟（5）离心，剩余 50uL 菌体涂布在选择性培养基 (LB-amp/kana) 上。
三、实验结果与分析实验结果主要观察转化后大肠杆菌菌落是否具有抗生素抗性。
将涂布后的培养基在适当条件下培养，观察菌落生长情况。
若菌落生长，说明转化成功；若无菌落生长，则转化失败。
四、实验反思本次实验中，制备感受态细胞及转化过程均较为顺利，但需要注意实验过程中的无菌操作，避免因操作不当导致实验失败。
目录（篇2）1.实验目的与原理2.实验步骤及操作要点3.实验结果与分析4.实验反思与建议正文（篇2）一、实验目的与原理大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验旨在通过转化方法将外源基因导入大肠杆菌，从而实现基因的表达和功能研究。
大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法
大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法(Jin-Lab)随着基因工程和生物技术的发展，基因克隆和DNA转化技术已经成为生命科学研究的基本技术之一。
大肠杆菌是广泛应用的微生物基因克隆和表达系统，其中电转化是一种常用的DNA转化方法。
在电转化过程中，使用感受态细胞进行DNA 转化可以提高转化效率和获得更多的转化子。
因此，制备感受态细胞及其转化方法研究对开展基因克隆和表达等方面的研究具有非常重要的意义。
感受态细胞制备方法1.大肠杆菌菌株及培养基选择本实验使用大肠杆菌DH5α菌株，培养基为Luria-Bertani（LB）培养基。
2.细胞质壁分离方法将DH5α菌株经过预培养后，用LB培养基洗涤一次，收集菌落后进行以下步骤。
•在含有1mM EDTA的冷0.5M葡萄糖缓冲液中洗涤细胞三次；•加入60mg/mL的亚胺青钾（IPTG）处理4小时取得感受态细胞。
3.细胞计数及保存使用平板计数器计数，将细胞用LB培养基稀释至约1 x 10^9/mL，添加10% v/v的甘油保存在-80℃。
电转化方法1.大肠杆菌菌株及培养基选择本实验使用大肠杆菌DH5α菌株，培养基为SOC培养基（Super Optimal broth with Catabolite repression）。
2.DNA处理方法将所需构建质粒经过酶切和纯化等操作处理后，加入所需菌株中进行转化。
3.转化操作•取感受态细胞保存液用LB培养基洗涤3次；•加入所需DNA，静置30分钟使其与感受态细胞充分结合；•以1mm间隔安置两条电极在电转化仪中；•用微管脚吸取约50μL细胞转移到抗电极侧的铝箔上，用蒸馏水润湿铝箔；•将铝箔上细胞转移到电极之间的空间内，使用脉冲电压脉冲电压 1.8 kV, 25 uF, 200Ω电阻取得转化产物。
以上是大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化的实验步骤。
感受态细胞制备方法和电转化方法的优化将提高转化效率和转化获得率，从而为生命科学研究提供更好的服务。
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化一、实验原理体外连接的重组DNA分子导入合适的宿主细胞中才能大量的进行复制、增殖和表达。
研究发现，用含Ca2+ 的溶液处理大肠杆菌细胞会易于吸收外源DNA。
大肠杆菌吸收外源DNA的过程被称为转化。
细菌处于容易吸收外源DNA的状态称为感受态。
用理化方法可以诱导细胞进入感受态，如电转化法、CaCL2法。
CaCL2法是目前实验室常用的制备感受态细胞的方法，其原理是使细菌处于0°C 、CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，细胞膜的通透性发生改变，外源DNA附着于细胞膜表面，经42°C短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物。
宿主细胞一般是限制?D修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，而质粒载体携带有某一抗生素抗性基因，如抗氨卞青霉素的基因（AP＋）。
若将转化的细胞涂布与于含氨卞青霉素的平板上，则只有那些含有被转化质粒的细胞才能生存并生长增殖。
从而可以筛选出哪个克隆含有质粒。
本实验以E.coli JM109菌株为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于感受态，然后与pUC18质粒共保温实现转化。
将经过转化后的全部受体细胞进行适当稀释，在含有氨卞青霉素的平板培养基上培养，只有转化体才能存活，而未有转化的受体细胞则因无抵抗氨卞青霉素的能力而死亡。
转化子经过扩增后，可将转入的质粒DNA分离提取出来，用于电泳分析、限制性内切酶图谱的制作以及DNA测序等实验。
二、仪器及试剂1. 仪器：恒温摇床、电热恒温培养箱、电热恒温水浴锅、超净工作台、分光光度计、高速冷冻离心机、台式离心机。
2. 材料E.coli JM109受体菌、质粒pUC18。
3. 试剂：LB培养液（1L）：胰蛋白胨 10g酵母粉 5gNaCl 10g（高盐）或5g（低盐）氨苄青霉素（Ampicillin） 100mg/ml在三角瓶中将胰蛋白胨 10g，酵母粉 5g以及 NaCl 5g溶于1L的重蒸水中并高压灭菌。
实验九大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
E.coli DH5a
37℃振荡
2mL LB 过夜
菌液
1mL
100mlLB
37℃振荡 2-3hrs
菌液
无菌 预冷
弃上清 4℃,4100r/min 收集细胞
10min
冰浴 10min
50mL聚丙烯管
倒
mL 1min
置 30
0.1M CaCl2
重复2次
2ml 预冷 0.1M CaCl2
重悬细胞
悬浮细胞
200ul 1.5mlEP
分装
800μl ＬＢ ４２℃,９０s 水浴 １０μl 40ng DNA 转化
冰浴２min
混匀、冰浴３０min
３７℃ ４５min
涂平板(Ampr)３７℃,１２～１６hrs 观察结果
冻存-70℃
2 转化
实验目的及背景 体外通过基因工程手段所构建的含目的基因
的重组质粒，选用转化和筛选技术， 可获得含 重组的阳性克隆。在此阳性克隆中，DNA可在 生物体系中大量扩增，繁殖， 保存以及表达目 的基因的产物，这是PCR体外扩增DNA所不能 替代的。配合DNA重组技术，所获得的，不同 目的需要的阳性菌株已广泛应用于科研，医药生 产和生物发酵等领域。
转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组 子导入细菌的过程。
转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基— 钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间 热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。将细菌 放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使 在转化过程中获得的新的表型(如Ampr等)得到 表达，然后将此细菌培养物涂在含有氨苄青霉 素的选择性培养基上。
三、实验步骤
1．从大肠杆菌DH5α 的平板上挑取一个单菌落接于
实验九大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
02
在实验过程中，发现感受态细胞的质量和转化效率受到多种因素的影响，如试 剂浓度、温度、时间等。因此，需要严格控制实验条件，确保实验结果的可靠 性和可重复性。
03
实验中还发现，不同批次的大肠杆菌菌株对感受态细胞制备和转化的影响也较 大，这可能与菌株的遗传背景和生理状态有关。因此，在实验中应尽量使用同 一种菌株，以保证结果的稳定性。
序列分析
对转化子进行序列分析，进一步验证目的基 因的准确性。
05
结果与数据分析
转化效率的计算
转化效率计算公式
转化效率 = (转化子数量 / 菌落总数) × 转化体系中 DNA的总量。
转化效率的影响因素
感受态细胞的制备方法、DNA的质量和浓度、转化条 件等。
转化效率的优化
通过调整感受态细胞制备方法和优化转化条件，可以 提高转化效率。
实验材料与试剂
实验材料：大肠杆菌菌株
大肠杆菌菌株
用于制备感受态细胞和转化实验的基本材料，应选择生长旺 盛、纯度高的菌株。
注意事项
确保菌株无污染，并按照实验室规定进行菌株保存和使用。
试剂：CaCl2、LB培养基、Amp等
CaCl2
用于制备感受态细胞的试剂，能够提高大肠 杆菌的转化效率。
LB培养基
用于培养大肠杆菌的生长，提供必要的营养 物质。
02
实验过程中，通过调整试剂浓度、温度和时间等参数，优化了感受态 细胞的制备和转化条件。
03
成功将外源DNA导入感受态细胞，并通过抗生素筛选获得了转化子。
04
实验结果表明，感受态细胞的制备和转化是实现基因克隆和表达的关 键步骤，为后续的分子生物学实验奠定了基础。
结果分析与讨论
01
实验结果与预期基本一致，成功实现了大肠杆菌感受态细胞的制备和转化。
实验-大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
板。
2、Amp母液：
称取氨苄青霉素100mg溶于1mlddH2O中，0.22μm滤 器过滤除菌，用EP管分装后储存于-20℃冰箱.
3、0.1mol/L CaCl2 溶液: 称0.56gCaCl2(无水分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至
0.1mol/L CaCl2是一种低渗溶液,在0℃冷冻处理大肠杆菌细胞 时,细胞膨胀成球形，DNA可吸附在其表面。在短暂的热冲击下，细胞 可吸收外源DNA。
摄入了外援DNA的细胞在丰富培养基内复制并增殖，表达外源基 因。带有选择标记基因的外源载体在受体细胞内表达时，受体细胞表 现标记基因的表型，使转化子与非转化子在选择培养基上区分开来。
（五） 次日（12-14小时后）观察和计算转化率 ：观察记录转化情况并统计 转化率。
转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计 算出转化子总数和转化频率，公式如下：
转化子总数＝该皿的菌落数×稀释倍数 （注：稀释倍数 = 涂布前总体积／涂板用菌液体积 ）
转化频率＝转化子总数／质粒DNA加入量(μg) （注：理想值可达5×106～ 2×107转化子/ μg DNA）
3. 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的，并用超纯水 配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。
4. 防止杂菌和杂DNA的污染：严格来说，整个操作过程均应在无菌条件 下进行, 所用器皿, 如离心管, tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所 有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染, 否则均会影响转化效率或杂DNA的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必 要的麻烦。
100ml,用0.22μm滤器过滤除菌or高压灭菌。EP管分装于 0℃冰箱储存 .
实验-大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
实验仪器、材料、试剂
1、仪器：恒温摇床，恒温水浴锅，电热
恒温培养箱，无菌工作台，微
量移液枪。
2、材料：DH5α感受态细胞、质粒pGEX-4T2
3、试剂：LB液体及固体培养基、氨苄青霉
素Amp（50mg/ml）。
实验步骤
1、每100ul感受态细胞加入1ul质粒DNA， 同时做一个空白对照（由第一组完成） 。
Amp的平板上，直至液体被培养基全部吸收；
6、平板倒置，37 ℃，过夜培养。
时间。
4、悬浮细胞时动作要轻柔，以免造成菌
体破裂，影响转化。
思考题
1、影响感受态细胞转化效率的因素有哪
些？
内容二：质粒DNA的转化与转化体筛选
1
实验目的 实验原理
实验仪器、材料、试剂
2
3
4
实验步骤
注意事项 思考题
5
6
实验目的
了解转化的概念及其在分子生物学研究中
的意义。
学习将外源质粒DNA转入受体菌细胞及筛 选重组子的方法。
1、仪器：高压灭菌锅、恒温水浴锅、台式
离心机、无菌操作台、微量移液
器、恒温摇床；
2、材料：菌种E.coli DH5α； 3、试剂：LB液体培养基、0.1M CaCl2。
实验步骤
1、将E.coli DH5α单菌落接种于3mlLB培 养液中，37℃震荡培养过夜。 2、取30μl液体培养液加入3mlLB液体培养 基中， 37℃下震荡培养，至光密度值 OD600在0.5~0.6之间（5×107 个/ml ）。
感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体
DNA分子导入受体细胞。
实验原理
用CaCl2处理大肠杆菌细胞使其处于感 受态后，通过热激处理可将质粒转化进入细 菌中。进入细菌细胞的质粒能够自主复制并 在宿主中实现其携带基因的转录、表达。
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告引言：大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛应用于生物学研究和基因工程领域。
在这个实验报告中，我们将讨论大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验。
实验目的：本实验的目的是制备大肠杆菌的感受态细胞，并将目标DNA转化到细胞内。
通过这个实验，我们可以研究细菌的基因表达和遗传变异。
实验材料和方法：1. 大肠杆菌培养基：含有适当营养物质的LB培养基。
2. 大肠杆菌感受态细胞：选择性培养基（如含有抗生素的培养基）筛选得到的细菌株。
3. 目标DNA：从其他生物体中提取的DNA片段。
4. 热激转化装置：用于将DNA转化到感受态细胞中的装置。
5. 热激转化条件：将感受态细胞与目标DNA和CaCl2在冰上混合，然后在热激转化装置中进行热冲击。
实验步骤：1. 制备感受态细胞：从大肠杆菌培养基中挑取一小部分细菌，接种到含有适当抗生素的选择性培养基中。
在37摄氏度下孵育过夜。
2. 提取目标DNA：从其他生物体中提取目标DNA片段，可以使用商业提取试剂盒或自制提取试剂进行操作。
3. 转化实验：将感受态细胞取出，进行适当的处理，如洗涤和离心。
将感受态细胞与目标DNA和CaCl2在冰上混合，并在热激转化装置中进行热冲击。
然后将细菌培养在含有抗生素的选择性培养基上。
4. 孵育和筛选：将转化后的细菌培养在含有抗生素的选择性培养基中，以筛选出成功转化的细菌。
在孵育过程中，可以使用PCR或其他方法进行确认。
结果和讨论：通过本实验，我们成功制备了大肠杆菌的感受态细胞，并将目标DNA转化到细胞内。
在筛选过程中，我们观察到在含有抗生素的培养基上生长出了抗性菌落，表明转化成功。
通过进一步的分析，如PCR检测，我们可以确认转化的目标DNA是否存在于细菌中。
这个实验的结果对于后续的基因表达研究和遗传工程应用具有重要意义。
大肠杆菌是常用的宿主细胞，可以用于大量表达外源蛋白和合成重组蛋白。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
1、细胞生长状态和密度：不要用经过多次转接或 储于4℃的培养菌，最好从-70℃或 -20℃甘油保存 的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。
细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好， 可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5α菌株的 OD600 为0.5时，细胞密度在5×107 个/ml左右 。
实验仪器、材料、试剂
1、仪器：恒温摇床，恒温水浴锅，电热 恒温培养箱，无菌工作台，微 量移液枪。
2、材料：DH5α感受态细胞、质粒pGEX-4T2 3、试剂：LB液体及固体培养基、氨苄青霉
素Amp（50mg/ml）。
实验步骤
1、100ul感受态细胞加入1ul质粒DNA，
同时做一个空白对照（由第一组完成）
实验原理
如果将转化后的菌液涂在无选择性抗生 素的培养基平板上，会出现成千上万的细菌 菌落，将难以确认哪一个克隆含有转化的质 粒。将经过转化后的细胞在选择性抗生素培 养基中培养，才能较容易地筛选出转化体， 即带有异源DNA分子的受体细胞。
实验原理
本实验使用的pGEX-4T-2质粒带有氨 苄青霉素抗性基因(Amp)，理论上只有转 入了质粒的大肠杆菌才能在含Amp的培养 基生长。但抗性筛选只是初步的筛选，可 能仍有部分未转进质粒的细菌能在抗性培 养基上生存（假阳性），因此还需要通过 提取质粒酶切、电泳作进一步的鉴定。
实验二
大肠杆菌感受态细胞的 制备及转化
内容一：大肠杆菌感受态细胞的制备
1
实验目的
2
实验原理
3
实验仪器、材料、试剂
4
实验步骤
5
注意事项
6
思考题
实验目的
❖ 掌握感受态细胞的概念及其意义。 ❖ 掌握感受态细胞的制备原理与操作方法。
实验原理
感受态：受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并 实现其转化的一种生理状态。它是由受体菌的遗传性状所 决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。
3、进行热激制备感受态细胞时要控制好 时间。
4、悬浮细胞时动作要轻柔，以免造成菌 体破裂，影响转化。
思考题
1、影响感受态细胞转化效率的因素有哪 些？
内容二：质粒DNA的转化与转化体筛选
1
实验目的
2
实验原理
3
实验仪器、材料、试剂
4
实验步骤
5
注意事项
6
思考题
实验目的
❖ 了解转化的概念及其在分子生物学研究中 的意义。
实验步骤
4、快速的吸除上清，向沉淀中加入1ml冰 冷的0.1M CaCl2溶液，使沉淀充分悬浮，动 作要轻柔，置于冰上30min，4000rpm，4 ℃ 离心3min。 5、弃上清，加入lml 冻存液（含15%甘油的 0.1M CaCl2溶液）溶液，使沉淀充分悬浮， 以每管0.1ml的规格分装3管，冻存于-80 ℃ ，可保存4~6个月。
实验原理
3、试剂的质量：所用的试剂，如CaCl2 等均需是最高纯度的，并用超纯水配制 ，并用微孔滤膜过滤灭菌，最好分装保 存于干燥的冷暗处。
实验原理
4、防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过 程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离 心管， tip头等最好是新的，并经高压灭菌 处理，所有的试剂都要灭菌，且注意防止被 其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则 均会影响转化效率或杂DNA的转入，为以后 的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。
实验原理
CaCl2 法简便易行，用 CaCl2法制备的 感受态细胞，可使每微克超螺旋质粒 DNA 产生5106-2107个转化菌落。在实际工作 中，每微克有105以上的转化菌落足以满足 一般的克隆实验。
制备出的感受态细胞暂时不用时，加入 占总体积15％的无菌甘油于-70℃，可以保 存半年。
实验原理
制备感受态的细胞一般选择对数生长期，新鲜幼嫩的 细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。常用的感 受态制备方法包括KCl、CaCl2等方法；后者因为操作简便 且符合大多数的分子克隆要求，因而被广泛采用。
实验原理
CaCl2 法的基本原理： 细菌处于低温（0℃）和低渗的CaCl2溶液
中，菌体膨胀，细胞膜的通透性发生了暂时性 的改变，转化混合物中的DNA形成抗DNase的 羟基-钙磷酸复合物黏附于菌体表面，在42℃ 进行短时间的热激处理，促进DNA的吸收。
Amp的平板上，直至液体被培养基全部吸收； 6、平板倒置，37 ℃，过夜培养。
注意事项
1、不要用经过多次转接或储存与4℃的培养 菌，最好从-80℃甘油保存的菌种中直接 转接用于制备感受态细胞的菌液。
2、细胞生长密度以刚进入对数生长期时为 宜，可以通过监测培养液的OD600控制。 DH5α菌株的OD600为0.5时，细胞密度比 较合适。密度过高或不足均会影响转化 效率。
注意事项
实验仪器、材料、试剂
1、仪器：高压灭菌锅、恒温水浴锅、台式 离心机、无菌操作台、微量移液 器、恒温摇床；
2、材料：菌种E.coli DH5α； 3、试剂：LB液体培养基、0.1M CaCl2。
实验步骤
1、将E.coli DH5α单菌落接种于3mlLB培 养液中，37℃震荡培养过夜。 2、取30μl液体培养液加入3mlLB液体培养 基中， 37℃下震荡培养，至光密度值 OD600在0.5~0.6之间（5×107 个/ml ）。 3、取1ml E.coli液体培养液于1.5ml的离心 管中，4000rpm，4 ℃离心 3min。
。
感受态细胞 质粒DNA
蒸馏水
转化体系 100ul
1ul
空白对照 100ul
1ul
实验步骤
2、轻轻混匀，立即放在冰上30min； 3、42℃水浴90s，然后迅速冰浴1-2min； 4、加入0.8ml LB液体培养基，160r/min，37 ℃培养
40min； 5、稀释后，取培养液100ul，涂布于含有50ug/ml
实验原理
2、质粒的质量和浓度：用于转化的质粒DNA应主要 是超螺旋态DNA。转化效率与外源DNA的浓度在一 定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或 体积过大时，转化效率就会降低。
1ng的超螺旋态DNA即可使50μl 的感受态细胞达 到饱和。一般情况下，DNA溶液的体积不应超过感 受态细胞体积的5％。
实验原理
用CaCl2处理大肠杆菌细胞使其处于感 受态后，通过热激处理可将质粒转化进入细 菌中。进入细菌细胞的质粒能够自主复制并 在宿主中实现其携带基因的转录、表达。
实验原理
实验原理
转化体的筛选方法： 主要用不同抗生素基因筛选。 常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉 素、氯霉素、四环素、链霉素等。
❖ 学习将外源质粒DNA转入受体菌细胞及筛 选重组子的方法。
实验原理
转化：指质粒DNA或以它为载体构建的重组 DNA导入细菌细胞，并使其生物学特性发生 可遗传的变化的过程，是基因工程等研究领 域的基本实验技术。
实验原理
转化的方法： (1)化学的方法(热激法)：使用化学试剂(如 CaCl2)制备的感受态细胞，通过热激处理将 载体DNA分子导入受体细胞； (2)电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的 感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体 DNA分子导入受体细胞。