真菌酵母细胞内氧化应激活性氧(ROS)MitoSOX红色荧光

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活性氧（ROS）测定试剂盒说明书

3、荧光检测： ①、将上述收集好的细胞沉淀用 PBS 重悬，并用于检测；
②、波长设置：最佳激发波长 500(50015nm)，最佳发射波长 525 (53020 nm)。也可按照 FITC 荧光检
测条件检测。 ③、结果以荧光度值表示。
四、细胞样本操作步骤：（可用激光共聚焦显微镜观察，也可用于流式细胞仪、荧光酶标仪、荧光分光度计测定）
二、试剂组成及保存： 1、0.1ml 10mM DCFH-DA in DMSO，20℃保存。 2、1ml 活性氧供氢体，4-8℃保存。
三、组织样本操作步骤：（可用激光共聚焦显微镜观察，也可用于流式细胞仪、荧光酶标仪、荧光分光度计测定）
1、单细胞悬液制备：方法 1、采用单细胞悬液制备仪制备单细胞悬液。方法 2、酶消化法：方法 3、机械法（网搓法）：
本试剂盒仅用于科研实验
1、直接将探针加入培养液中： ①、直接将 DCFH-DA 探针加入无血清培养基中：一般按照 1 ：1000 用无血清培养液稀释 CFH-DA。加入的体积以能充分盖住细胞为宜，通常对于 6 孔板的一个孔加入稀释好的 DCFH-DA 不少于 1ml。 ②、取一份不加探针，只加入培养基的细胞设为阴性对照管。阳性对照管：取一份已加入探针的细胞，同时加入活性氧供氢体诱导细胞，推荐该试剂的工作浓度为 20～100µM。 ③、37℃孵育细胞 30min～几小时，通常为 30～60min 即可，孵育时间长短与细胞类型、刺激条件、DCFH-DA 浓度有关。一般阳性对照在刺激细胞 30 分钟左右，即可观察到明显的绿色荧光。 ④、吸去培养液，利用无血清培养液或者 0.01MPBS 反复吹打，肉眼观察瓶底由半透明(细胞单层连接成片)转为透明，细胞层几乎全部吹打到 PBS 中。 ⑤、将细胞悬液全部收集到 1.5ml 离心管中。用无血清培养液或者 PBS 洗涤 2 次，以充分去除未进入细胞内的 DCFH-DA。1000rpm/min，5min，吸净上清后加入 PBS 重新悬浮细胞进行测定。

mitosox作用原理

mitosox作用原理Mitosox是一种常用的细胞荧光探针，可以用于检测细胞内活性氧（ROS）水平的变化。

它的作用原理主要基于其特殊的分子结构和化学性质。

Mitosox的分子结构包含一个具有阳离子性的三甲基咪唑（TMZ）基团和一个荧光染料基团。

由于TMZ基团的阳离子性，Mitosox 具有较强的亲脂性，可以穿过细胞膜进入细胞内。

一旦进入细胞内，Mitosox会受到细胞内ROS的氧化作用，从而发生化学反应。

在正常的细胞内，ROS水平较低，Mitosox的荧光基团处于非激发状态，不发出荧光信号。

然而，当细胞发生氧化应激或ROS水平升高时，Mitosox分子会被ROS氧化，导致荧光基团从非激发态转变为激发态，从而发出强烈的荧光信号。

这种荧光信号的强弱与细胞内ROS水平的变化成正相关。

通过检测Mitosox的荧光信号强度，可以间接评估细胞内ROS水平的变化。

这对于研究氧化应激、细胞衰老、炎症和肿瘤等疾病具有重要意义。

在实际应用中，使用Mitosox需要注意以下几个方面。

首先，由于Mitosox具有较强的亲脂性，它可以进入细胞内的线粒体，因此主要用于评估线粒体内ROS的水平。

其次，Mitosox的荧光信号受到许多因素的影响，如荧光素光照明条件、细胞固定和染色的时间等。

因此，在实验设计中需要进行严格的对照组和实验组的设置，确保结果的可靠性和可比性。

此外，为了更准确地评估ROS水平的变化，可以结合其他ROS探针和细胞生物学方法进行分析。

除了用于研究细胞内ROS水平的变化，Mitosox还可以应用于其他领域。

例如，在药物研发中，Mitosox可以用于评估药物对细胞氧化应激的影响；在环境污染监测中，可以利用Mitosox评估污染物对生物体的毒性作用等。

Mitosox作为一种常用的细胞荧光探针，通过荧光信号的变化间接评估细胞内ROS水平的变化。

其作用原理基于其特殊的分子结构和化学性质，可以应用于多个领域的研究和应用中。

活性氧调控免疫应答的作用及机制-免疫学论文-基础医学论文-医学论文

活性氧调控免疫应答的作用及机制-免疫学论文-基础医学论文-医学论文——文章均为WORD文档，下载后可直接编辑使用亦可打印——活性氧（Reactive oxygen species,ROS）是一群具有较强氧化能力的分子的总称[1].生物体内的ROS 包括超氧阴离子（O2 -）、羟自由基（OH）、过氧化氢（H2O2）、单线态氧（O2）.活性氧在免疫系统中主要来源于细胞膜的NADPH 氧化酶复合体 2 （Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxi-dase,NOX2）,并在淋巴细胞间的信号转导发挥巨大作用[2].早在1980 年人们就认识到ROS 在固有免疫中作为主要武器对抗病原体的重要作用，现今发现其在不同浓度的情况下在获得性免疫中的重要调节作用。

1 ROS 的功能之前的观点认为ROS 是一类细胞内毒性物质，到后来从被证明可以激活胞浆内的第二信使鸟苷酸环化酶（cGMP）开始，ROS 在细胞信号转导中发挥的作用越来越受到人们的重视。

O2 -是线粒体产生ROS 的前体，其他形式都是由生物体内各种酶催化O2 -而来。

其中超氧岐化酶（SOD）可以催化O2 -转化为H2O2.H2O2是ROS 中最稳定的形式且扩散能力较强，但是据资料显示它的稳定会受到细胞内的pH 和氧化还原平衡影响[3].H2O2的强扩散力主要因为它可以自由进出细胞膜，而最近证据表明：过氧化氢可能通过细胞水通道蛋白优先进入特定的细胞[4].H2O2主要通过氧化多种蛋白质的半胱氨酸残基（-SH）来实现信号转导。

它具有靶向可逆的氧化半胱氨酸的硫化物（-SH）为次磺酸（-SOH）.带电的氨基酸可以使正常的半胱氨酸残基pKa8. 5 降低到pKa5 以下，这种低pKa 半胱氨酸可以成为H2O2的氧化目标。

这个发现支持过氧化氢可以作为第二信使[13,14].H2O2可以以模仿配体的方式来激活多种受体信号通路。

活性氧与内质网应激

活性氧与内质网应激周映彤;肖洪彬;毕明刚【摘要】内质网(endoplasmic reticulum,ER)是细胞加工蛋白质和贮存Ca2+的主要场所,对应激极为敏感,其功能紊乱时出现错误折叠与未折叠蛋白在腔内聚集以及Ca2+平衡紊乱的状态,称为内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS).活性氧( reactive oxygen species,ROS)作为第二信使,在细胞生物学功能的调节中起着重要作用.细胞内氧化还原状态的改变促进了ROS的产生和凋亡诱导因子的激活,致使细胞凋亡的同时又加剧了细胞内氧化还原状态的改变.研究发现细胞内氧化还原水平的改变在ERS介导的细胞凋亡过程中承担重要的角色,推测ROS可能是ERS介导的凋亡通路的上游信号分子,该文就ROS与ERS之间的关系作一综述.%The endoplasmic reticulum( ER ) is a major site for protein processing and Ca2+ storage and it is extremely sensitive to the stress. In the state of dysfunction, unfolded or misfolded protein accumulation and Ca2+ disbalance occur, known as endoplasmic reticulum stress ( ERS ). Reactive oxygen species ( ROS ), as a second messenger plays an important role in the regulation of biological function in cells. Intracellular changes in redox state promote the generation of ROS and the activation of apoptosis inducing factor, leading to apoptosis which in turn exacerbate the intracellular redox state change. Recent studies have found that intracellular redox changes in the level of ERS mediated apoptosis assumes an important role in the process, and it is speculated that ROS is the upstream signal molecule in ERS-mediated apoptosis pathway. This paper provides a review of the relationship between ROS and ERS.【期刊名称】《中国药理学通报》【年(卷),期】2011(027)005【总页数】4页(P597-600)【关键词】活性氧;内质网应激;未折叠蛋白反应;钙;细胞凋亡;氧化还原【作者】周映彤;肖洪彬;毕明刚【作者单位】黑龙江中医药大学药理毒理研究中心,黑龙江,哈尔滨,150000;黑龙江中医药大学药理毒理研究中心,黑龙江,哈尔滨,150000;中国医学科学院药用植物研究所,北京,100193【正文语种】中文【中图分类】R-05;R329.24;R329.25;R341;R348.1内质网(endoplasmic reticulum，ER)是一个膜性细胞器，广泛存在于真核细胞中，是细胞内重要的细胞器，是调节蛋白质合成及合成后折叠、聚集的场所，是调节细胞应激反应的场所，同时也是调节Ca2+稳态水平和Ca2+信号转导的主要部位。

动物组织氧化应激活性氧鲁米诺化学发光法定量检测试剂盒产

动物组织氧化应激活性氧鲁米诺化学发光法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）主要用途动物组织氧化应激活性氧（ROS）鲁米诺化学发光法定量检测试剂是一种旨在通过自由基探针鲁米诺和强化剂的参与下，植物样品中的活性氧族使发光物氧化降解并发光，在化学发光仪（Luminometer）的帮助下定量检测样品中活性氧族（过氧化氢）的生成和数量的权威而经典的技术方法。

该技术经过精心研制、成功实验证明的。

适用于各种动物和人体组织的活性氧族的检测。

可以被用于细胞凋亡、衰老、代谢和营养学，以及发育生物学（男性不育）等的研究。

产品严格无菌，即到即用，操作简易，性能稳定，检测敏感。

技术背景超氧自由基阴离子（superoxide radical；O2-）、过氧化氢（hydrogen peroxide；H2O2）、羟自由基或氢氧基（hydroxyl radical；OH-）、过氧化基（peroxyl radical；ROO-）、氢过氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO-）、过氧亚硝基阴离子（peroxynitrite anion；ONOO-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、单线态氧气（singlet oxygen）等细胞内活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的产生和增多，甚而导致诸如男性不育、冠心病、风湿性关节炎、肿瘤、退行性病变等各种病理状况。

鲁米诺（luminol），又称氨基邻苯二甲酰肼（luminol;3-aminophthalic hydrazide 5-amino-2,3-dihvdro- 1,4-phthalazinedione），是一种脂溶性的发光剂，氧化后生成鲁米诺自由基而化学发光，具有460nm左右峰值的带状光谱，肉眼可观察到鲜明的紫蓝色。

冰冻切片氧化应激活性氧超氧阴离子MitoSOX红色荧光测定试

冰冻切片氧化应激活性氧超氧阴离子MitoSOX红色荧光测定试剂盒产品说明书（中文版）主要用途冰冻切片氧化应激活性氧超氧阴离子MitoSOX红色荧光测定试剂是一种旨在通过透膜荧光染色剂MitoSOX，在线粒体氧化损伤条件下，产生红色荧光，来检测冰冻组织细胞线粒体内超氧阴离子活性氧族的存在状况的权威而经典的技术方法。

该技术经过精心研制、成功实验证明的。

适宜于冰冻动物组织细胞线粒体内的超氧阴离子分析。

可以被用于细胞凋亡、信号传递、衰老、代谢和营养学等的研究。

产品严格无菌，即到即用，操作简易，定性检测，性能稳定。

其中线粒体氧化磷酸化副产物之一是超氧阴离子，为线粒体内最主要的活性氧族，与心血管疾病，包括高血压、冠状动脉硬化、糖尿病相关的血管疾病、神经退行性疾病（巴金森氏症、阿茨罕默症、肌萎缩硬化症）相关。

MitoSOX 是一种完全自由通过细胞膜，并选择性在活体细胞线粒体内长期滞留而不外漏的染色剂。

一旦被超氧自由基阴离子氧化，便产生荧光。

据此证明细胞线粒体内超氧阴离子活性氧族的存在。

产品内容清理液（Reagent A）20毫升染色液（Reagent B）40微升稀释液（Reagent C）20毫升产品说明书1份保存方式保存染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，严格避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保证6月用户自备1.5毫升离心管：用于工作液配制的容器培养箱或恒温水槽：用于染色孵育（共聚焦）荧光显微镜：用于观察荧光组织细胞实验步骤实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，稀释液（Reagent C）置于室温预热。

活性氧检测试验方案

活性氧检测试验方案活性氧检测是一种用于评估物质或生物体中产生的活性氧（ROS）水平的方法。

ROS是一类极具活性的氧化物质，可在正常细胞代谢中产生，并参与多种生理过程。

然而，当ROS的产生超过细胞的抗氧化能力时，就会导致氧化应激，对细胞和组织造成损害，并与一系列疾病的发生和发展相关。

为了测量活性氧的水平，可以使用一系列的试剂和方法。

以下是一个可能的活性氧检测实验方案：实验材料：1.活体组织样本（例如细胞培养物、小鼠肝脏组织等）2.PBS缓冲液3.DCFDA（二氟荧光二乙酸盐）染料溶液4.活性氧产生剂（例如H2O2）5.抗氧化剂（例如维生素C）6.血红素（免疫染色用）实验步骤：1.准备工作：a.将DCFDA溶液按照说明书的要求稀释到适当的浓度。

b.用PBS缓冲液洗涤和预处理样本，去除可能影响实验结果的其他物质。

2.观察基础水平：a.取一小部分样本，不加任何试剂，放入显微镜观察台下。

b.使用适当的增强型荧光显微镜观察样本的荧光强度和分布。

3.活性氧产生实验：a.取适量的样本放入显微镜观察台下。

b.添加一定浓度的活性氧产生剂（例如H2O2），混匀。

c.立即在显微镜观察荧光信号的变化。

d.记录荧光信号的强度和分布。

4.抗氧化剂实验：a.取适量的样本放入显微镜观察台下。

b.添加一定浓度的抗氧化剂（例如维生素C），混匀。

c.立即在显微镜观察荧光信号的变化。

d.记录荧光信号的强度和分布。

5.数据分析：a.使用图像分析软件测量荧光信号的平均强度和荧光染色的面积。

b.对每个样本的数据进行统计分析，如平均值、标准误差等。

c.使用统计学方法（如t检验或方差分析）比较不同处理组之间的差异。

总结：通过以上步骤，可以获得活性氧的水平，评估其在不同条件（如活性氧产生剂和抗氧化剂的存在与否）下的变化。

这个实验方案可以用于研究活性氧在细胞和组织中的作用，以及评估抗氧化剂的功效。

氧化应激的指标

氧化应激的指标
氧化应激的指标有很多，以下列出了一些常见的指标：
1. ROS（Reactive Oxygen Species，活性氧）：活性氧是氧化应激的主要物质，可以通过荧光染料或自由基捕捉剂等方法检测。

2. MDA（Malondialdehyde，丙二醛）：MDA是膜脂过氧化反应的产物，是氧化应激的重要指标之一，可以通过比色法或荧光法检测。

3. SOD（Superoxide Dismutase，超氧化物歧化酶）：SOD是一种重要的抗氧化酶，可以检测SOD的活性或基因表达水平来评估氧化应激的程度。

4. CAT（Catalase，过氧化氢酶）：CAT也是一种重要的抗氧化酶，可以检测其活性或基因表达水平来评估氧化应激的程度。

5. GSH（Glutathione，谷胱甘肽）：GSH是一种重要的抗氧化剂，可以通过比色法或荧光法等方法检测。

6. 线粒体膜电位（Mitochondrial membrane potential，MMP）：MMP是线粒体功能的重要指标，氧化应激可改变MMP，可通过荧光染料检测。

7. DNA氧化损伤：DNA氧化损伤是氧化应激的重要标志之一，可以通过单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）或8-OHdG 等指标检测。

8. 炎症因子：氧化应激可引起炎症反应，相关炎症因子如TNF-α（Tumor Necrosis Factor-α）和IL-6（Interleukin-6）等可以作为氧化应激的指标之一。

硝化应激相关指标

硝化应激相关指标
硝化应激是指细胞在受到外界刺激或内部损伤时，激活硝化酶产生一氧化氮（NO）的过程。

硝化应激与多种生理和病理过程密切相关。

硝化应激相关指标主要包括以下几个：
1. 一氧化氮（NO）：作为信号分子，NO在细胞内具有调节氧化应激、细胞凋亡、炎
症反应等多种生理功能。

2. 硝酸酯酶（NOS）：硝酸酯酶是NO合成的关键酶，分为诱导型NOS（iNOS）和内皮
型NOS（eNOS）两种。

iNOS在炎症和免疫反应中起重要作用，而eNOS主要参与血管舒张
和凝血等生理过程。

3. 活性氧（ROS）：活性氧是细胞氧化应激的主要产物，高水平的活性氧可导致细胞
损伤和凋亡。

硝化应激过程中，NO可与活性氧相互作用，进一步影响细胞功能。

4. 细胞凋亡相关指标：硝化应激可引起细胞凋亡，通过检测细胞凋亡相关指标（如凋亡细胞数量、凋亡相关蛋白等）可评估硝化应激对细胞的影响。

5. 炎症因子：硝化应激可导致炎症反应，检测炎症因子水平可反映硝化应激程度。

6. 抗氧化剂：抗氧化剂能抵抗氧化应激，减轻硝化应激对细胞的损伤。

检测抗氧化剂水平可评估细胞对硝化应激的应对能力。

7. 基因表达：硝化应激相关基因的表达变化可反映细胞对硝化应激的响应。

通过检测相关基因的表达水平，可了解硝化应激的作用机制和信号通路。

总之，硝化应激相关指标能够反映细胞在硝化应激状态下的生理和病理变化，为研究硝化应激的生物学效应和防治策略提供重要依据。

动物细胞氧化应激活性氧（ROS）光泽精化学发光法定量检测试剂盒说明书

动物细胞氧化应激活性氧(ROS)光泽精化学发光法定量检测试剂盒说明书一、检测原理动物细胞氧化应激活性氧(ROS)光泽精化学发光法定量检测试剂盒是血液卵磷脂胆固醇乙酰转移酶(LCAT)活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过非界面性的水溶性单体底物，在磷脂酶或乙酰转移酶的水解下，其释放的产物发生吸收峰值的变化，即采用比色法来测定血液样品中酶活性的权威而经典的技术方法。

该技术经过精心研制、成功实验证明的。

其适用于各种血液样品(动物、人体等)卵磷脂胆固醇乙酰转移酶的活性检测。

产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

二、样品收集、处理及保存方法血液样品分为耳静脉采血、颈静脉采血、前腔静脉采血、心脏采血、翅静脉采血，应根据工作实际选择合适的采血方式。

全血样品是在样品中加抗凝剂，可用0.1%肝素、阿氏液、3.8%枸橼酸钠。

我们通常做免疫效果抗体检测需要血清，血液在采集后室温静置2小时以上，冬季需要加温，高速离心，或者4度过夜，抽取血清。

注意事项：1每份样品一定按要求采够量，比如禽血清一般要求不少于0.5毫升，猪血清一般要求不少于1毫升。

2血清样品要清亮、无溶血、无变质。

3样品容器上贴详细标签4尽量防止或避免反复冻融。

组织样品：采集的每个组织块要单独放一个已消毒的容器内，贴详细标签，防止组织间相互污染，注意消毒，以防散毒。

做好个人防护。

分泌物和排泄物：常用的就是禽流感咽喉拭子和泄殖腔拭子的采集。

容器中首先放入含有抗菌素的PH值为7.0-7.4的PBS液，原则上咽喉、泄殖腔拭子分别放置。

抗生素的浓度为青霉素2000IU/ml,链霉素2mg/ml,庆大霉素(卡那霉素)50ug/ml,制霉菌素10000IU/ml,粪便和泄殖腔拭子所用的抗生提高5倍。

加入抗生素后应调整PH值至7.0-7.4。

粪便样品：常用的是禽流感野鸟粪便的采集，注意样品一定为新鲜粪便。

皮肤样品三、储存条件14℃或-20℃四、试剂盒内容标准品样本稀释液检测抗体-HRP20×洗涤缓冲液底物A底物B终止液说明书自封袋五、操作方法1. 从室温平衡20min 后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

细菌氧化应激活性氧(ROS)高质荧光测定试剂盒产品说明书

细菌氧化应激活性氧（ROS）高质荧光测定试剂盒产品说明书（中文版）主要用途细菌氧化应激活性氧（ROS）高质荧光测定试剂盒是一种旨在通过透膜荧光染色剂氯甲基二氯二氢荧光素二乙酯，在细菌氧化条件下，产生荧光，来定量检测细菌活性氧族的生成和增加的权威而经典的技术方法。

该技术经过精心研制、成功实验证明的。

其适用于各种实验用细菌菌株氧化应激活性氧的分析。

产品严格无菌，即到即用，操作简易，活体检测，性能稳定，滞留持久，荧光清晰。

技术背景细菌作为模式生物，是环境化学毒性研究的常用工具。

活性氧的检测可以用于诸如多环芳烃化合物或重金属的毒性作用以及修复（remediation）的评价指标。

超氧自由基阴离子（superoxide radical；O2-）、过氧化氢（hydrogen peroxide；H2O2）、羟自由基或氢氧基（hydroxyl radical；OH-）、过氧化基（peroxyl radical；ROO-）、氢过氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO-）、过氧亚硝基阴离子（peroxynitrite anion；ONOO-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、单线态氧气（singlet oxygen）等细胞内活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的产生和增多，将导致细胞衰老或凋亡。

氯甲基二氯二氢荧光素二乙酯（6-chloromethyl-2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester；CM－H2DCFDA）是取代二氯二氢荧光素二乙酯（2´,7´-dichlorodihydrofluorescin diacetate；DCFH-DA）的升级产品，一种完全自由通过细胞膜，并在细胞内长期滞留而不易外漏的染色剂。

细胞ROS测定试剂盒说明书1

用户自备
胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（GMS12024）：用于细胞脱离完全细胞培养液（GMS12052）：用于细胞操作所需的培养基 15 毫升锥形离心管：用于细胞操作的容器 1.5 毫升离心管：用于细胞染色的容器血细胞计数仪：用于细胞计数台式离心机：用于沉淀细胞细胞流式仪：用于细胞荧光分析（共聚焦）荧光显微镜：用于观察荧光细胞
5
c) 或使用荧光分光光度仪检测（定量检测）：
1）移取 400 微升上述细胞悬液到 1 毫升比色杯
2）加入
微升 GENMED 保存液（Reagent D）
3）上下倾倒混匀数次
4）放进荧光分光光度仪：激发波长 540nm，散发波长 590nm――
RFU 增高，表明活性氧族（ROS）含量高
2
二、直接法
活体组织氧化应激活性氧（ROS）初级荧光测定试剂盒冰冻切片氧化应激活性氧（ROS）高质荧光测定试剂盒冰冻切片氧化应激活性氧（ROS）初级荧光测定试剂盒细胞内氧化应激活性氧（ROS）比色法定量检测试剂盒
细胞内氧化应激活性氧（ROS）红色荧光测定试剂盒冰冻切片氧化应激活性氧（ROS）红色荧光测定试剂盒
GENMED SCIENTIFICS INC. U.S.A
GMS10111.1 v.A
GENMED 细胞内氧化应激活性氧（ROS）红色荧光测定试剂盒产品说明书（中文版）
主要用途
GENMED 细胞内氧化应激活性氧（ROS）红色荧光测定试剂是一种旨在通过透膜荧光染色剂二氢溴化乙啶，在细胞氧化条件下，产生红色荧光，来定量检测细胞内活性氧族的生成和增加的权威而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。可以被用于细胞凋亡、信号传递、衰老、代谢和营养学等的研究。产品严格无菌，即到即用，操作简易，活体检测，性能稳定。

光反应性活性氧(ROS)测定试验方法

附件5光反应性活性氧(ROS)测定试验方法ReactiveOxygenSpecies(ROS)AssayforPhotoreactivity1范围本方法规定了化妆品用化学原料光反应性活性氧(RoS)测定试验的基本要求和方法。

本方法适用于预测化妆品用化学原料的潜在光毒性。

2试验目的预测化妆品用化学原料是否具有潜在光毒性。

3定义下列术语和定义适用于本方法。

3.1光反应性Photoreactivity化学物质由于吸收光子而与另一个分子发生反应的性质。

3.2光毒性Phototoxicity皮肤一次接触化学物质后，继而暴露于紫外线照射下所引发的一种皮肤毒性反应，或者全身应用化学物质后，暴露于紫外线照射下发生的类似反应。

本方法所述光毒性包括光刺激性、光过敏性和光遗传毒性。

3.3辐照度Irradiance照射到某一表面的紫外线或可见光的强度，单位为瓦每平方米(W∕m2)或亳瓦每平方厘米(m∖V∕cm2)o 3.4光照剂量Doseoflight照射到某一表面的紫外线或可见光的量[=强度X时间(秒)],单位为焦耳每平方米(J∕m2)或焦耳每平方厘米(J∕cm2)。

3.5活性氧种类ReactiveOxygenSpecies,ROS活性氧种类，包括单线态氧和超氧阴离子。

3.6单线态氧SingIetOxygen,SO由光辐照化学物质通过11型光化学反应产生的一种自由基。

3.7超氧阴离子SuperoxideAnion,SA由光辐照化学物质通过I型光化学反应产生的一种自由基。

4试验原理一些具有光反应性的化学物质暴露于紫外线时，吸收某一波长光子，诱导发色团激发，激发能量转移到氧分子上，发生光化学反应，产生活性氧（包括单线态氧SO和超氧阴离子SA）,活性氧是光毒性反应中的重要中间物质。

单线态氧和咪哇反应生成的过氧化物中间体对N,N-二甲基-4-亚硝基苯胺（RNo）具有漂白作用，使其在440nm下的吸光度降低。

超氧阴离子与氯化硝基四氮嘎蓝（NBT）反应生成NBT+,其在56Onm波长下具有光吸收。

活性氧相关分子对唑类药物药效的影响

第二军医大学硕士学位论文活性氧相关分子对唑类药物药效的影响姓名：***申请学位级别：硕士专业：药理学指导教师：***2011-05活性氧相关分子对唑类药物药效的影响摘要白假丝酵母菌（Candida albicans）是临床最常见的条件致病性真菌，它寄居在人体不同的解剖部位，包括皮肤、口腔、胃肠道、阴道等，约占所有医院真菌感染的50－60%，能够引起多种疾病，尤其是皮肤感染、粘膜感染以及侵入性深部真菌感染。

在正常宿主中，念珠菌是一种无害的共生物，检出率几乎达50%。

正常机体有足够的免疫力阻止白假丝酵母菌感染，但是当外界因素打破菌群平衡，白假丝酵母菌在局部大量生长繁殖，就会导致感染。

随着氟康唑长期大量应用导致真菌耐药性普遍产生，成为临床上治疗失败的主要原因。

目前抗真菌药物的联合应用已经成为临床抗真菌治疗的发展方向之一。

但国内外报道的联合用药多局限于少数抗真菌药物之间的合用，有些抗真菌药物合用反而产生拮抗作用。

活性氧簇（Reactive Oxygen Species，ROS）是细胞有氧代谢过程中产生的一组带有未成对电子的化学性质活泼的含氧自由基，主要包括超氧阴离子、羟基自由基、单线态氧和过氧化氢等。

许多国内外文献认为白假丝酵母菌耐药性与活性氧相关，但是直接针对体外应用过氧化氢对唑类药物药效影响的报道较少。

本课题首先通过体外实验棋盘式微量稀释法检测了过氧化氢与氟康唑、伊曲康唑、咪康唑、酮康唑、硫康唑合用对8株临床耐药白假丝酵母菌的MIC80值，计算其相应的FIC指数。

结果发现以MIC80值为基础，两药合用对全部8株菌（100％）皆表现出协同作用（FICI<0.5）。

不同菌株的协同指数不同，但是均表现出协同效果。

其次通过平板纸片扩散试验看到，在加FLC平板上的含过氧化氢药物纸片的抑菌圈与空白平板有显著差异。

在各类唑类药物的琼脂平板纸片扩散试验均得到了阳性结果。

此外，我们运用另一升高活性氧的药物寡霉素进行纸片扩散实验，结果提示：寡霉素与各类唑类药物也具有协同效果。

流式细胞术检测活性氧

流式细胞术检测活性氧一，摘要活性氧（ROS）是包含羟基自由基或具有不成对电子的过氧化物的分子。

在健康的需氧细胞中，ROS是作为氧化磷酸化，氧化还原酶或金属催化的氧化产物以受控速率自然生成的。

但是，在某些应激条件下，尤其是暴露于环境氧化剂和某些导致氧化应激的药物中，可能会诱导产生ROS。

过量的ROS可能会破坏包括DNA，蛋白质和脂质在内的细胞构件，最终导致细胞死亡。

细胞渗透性2'，7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（H2DCFDA）是广泛使用的ROS指示剂。

还原的非荧光素H2DCFDA可被细胞内ROS氧化并转化为荧光2'，7'-二氯荧光素（DCF）。

本文应用H2DCFDA标记细胞内ROS，并通过流式细胞仪检测DCF强度。

二，材料和试剂1.需要分析的细胞(本方案在A549, CL1-0, 和IMR-90 细胞上成功实践过)2.Dulbecco's Phosphate-buffered saline (DPBS)3.2’,7’-dichlorofluorescein diacetate (H2DCFDA) (Life Technologies, InvitrogenTM, catalog number: D-399 )4.Anhydrous DMF (N,N-dimethylformamide) (Sigma-Aldrich, catalog number: 227056 )5.N-acetyl-L-cysteine (NAC) (Sigma-Aldrich, catalog number: A7250 )6.Hydrogen peroxide (H2O2) (Sigma-Aldrich, catalog number: 349887 )7.5 ml polystyrene BD falcon round-bottom tube with cell strainer cap (BD Biosciences, catalog number: 352235 )8.Sodium Chloride (NaCl)9.Potassium Chloride (KCl)10.Potassium Phosphate, monobasic (KH2PO4)11.Sodium Phosphate, dibasic (Na2HPO4)12.DPBS (参见配方)13.H2DCFDA stock (10 mM) (参见配方)14.NAC stock (1 M) (参见配方)15.H2O2 stock (1 M) (参见配方)三，设备1.流式细胞仪2.水浴锅3.离心机四，过程1.将细胞用完全培养基在37 °C和5% CO2的6cm皿中培养。

活性氧

活性氧的检测及生理机制摘要当植物所生长的外界环境如温度、湿度、土壤中的水分发生改变时植物体内会产生大量的活性氧，使作物遭到严重的损伤，即环境胁迫使植物体积累大量的活性氧，从而使植物严重损伤。

在本文中主要介绍了活性氧的测定方法、生理机制及对环境胁迫所产生的影响进行了具体的阐述。

关键词活性氧（ROS）环境胁迫1活性氧的定义人类发现活性氧已有100年的历史了，在距离地球表面15—25公里的高空，因受太阳紫外线照射的缘故，形成了包围地球外围空间的活性氧层，这厚厚的活性氧层正是人类赖以生存的保护伞。

活性氧又名三原子氧，因其类似鱼腥味的臭味而得名。

其分子式为O3，是氧气的同素异形体，具有它自身的独特性质：在自然环境下，它是淡蓝色的气体；具有很强的氧化能力，是已知最强的氧化剂之一；正常情况下，极其不稳定，容易分解为氧气；在空气中的半衰期一般为20—50分钟，随温度与湿度的增高而加快。

活性氧是一种强氧化剂，具有广泛杀灭微生物作用，包括细菌、芽胞、病毒、真菌等，其杀灭速度较氯快600—3000倍。

2活性氧的检测活性氧本身具有多样性及不稳定性，这就为活性氧的检测增加了复杂性。

通过研究，研究者们使用各种各样的方法和仪器去检测ROS在生物细胞内的影响，反映了ROS在调节细胞行为的许多方面增加的证据支持一个中心的角色。

其中的一些方法可以用于记录ROS和体内氧化损伤。

早期的关于ROS在发育中扮演的角色的研究是基于具有氧化还原敏感性的发色体物质的使用，尽管一般的荧光探针在用于荧光检测的方法中广泛使用。

大量的对于ROS水平敏感的ROS探针的一直在增加。

在检测细胞ROS过程中，要考虑到探针对于检测过程中的ROS 最佳特异性、保证细胞状态及荧光试剂的检测特异性。

最广泛应用的荧光探针，应该是与一定范围内的ROS相反应而使其能够被检测得到，如果要检测某一种ROS，这种方法是不可行的。

DCFH是目前应用最为广泛的荧光感受器检测ROS，用于在体外检测活性氧。

全面认识氧化应激的作用

全面认识氧化应激的作用氧化应激（Oxidation Stress, OS）是1990年美国RS.Sohal提出的一种病生理概念。

它是指机体在内外环境有害刺激的条件下，体内产生活性氧自由基（Reactive Oxygen Species，ROS）和活性氮自由基（Reactive Ntrogen Species，RNS）所引起的细胞和组织的生理和病理反应。

ROS有超氧阴离子（.O2-）、羟自由基（.OH-）和过氧化氢（H2O2）等等；RNS有一氧化氮（NO）、二氧化碳（CO2）和过氧亚硝酸盐（.ONOO-）等等。

由于它们可以直接或间接氧化或损伤DNA、蛋白质和脂质，可诱发基因的突变、蛋白质变性和脂质过氧化，被认为是人体衰老和各种重要疾病如肿瘤、心脑血管疾病、神经退行性疾病（老年痴呆）、糖尿病------最主要的危险因子，是人类健康的大敌！现在社会上“抗氧化”的保健品满天飞，食品、饮料、美容-----都要贴上“抗氧化”的标签。

“氧化”和“抗氧化”成为一种时尚。

将ROS和氧化应激看为人类健康的洪水猛兽，大有人人喊打的剿灭之势！非也！生物氧化，氧化还原反应是人体最基本的生化反应，氧化应激亦是人体一种最基本的保护机制。

在我们体内，每一个细胞一天要产生2.5X1011个分子的ROS，人体内每天可产生40X1021个分子的自由基。

它们不仅为我们提供和传递为维持生命活动的能量，帮助我们消灭细菌和病原体，清除体内的毒素和“垃圾”。

它们还是我们体内多种代谢和信号通路的启动者和调节者，如JNK/SAPK、P38MAPK、IKK/NF-KB、P13K、Akt、CD40/CD40L、PKC等；激活和调控各种转录因子，如AP-1、Nrf2、NF-KB、p53、ATF-1、HIF、HSP、SIFT-1、MST/FOXO 等，影响体内各种基因的转录和表达，参与体内炎症、免疫、生殖、发育、代谢、细胞生长、增殖、细胞再生、修复------各种重要生命过程的调节，为我们提供进化的基础，生存的空间和净化的环境，促进和维护细胞、组织和机体的新陈代谢、维护和保证正常生命活动。

酵母样真菌 ROSCO 法药敏试验标准操作程序

酵母样真菌ROSCO 法药敏试验标准操作程序1正确进行酵母样真菌 ROSCO 法药敏试验操作，监测耐药性酵母菌的出现及其耐药性变化，为酵母样真菌治疗提供参考依据。

2将含有定量抗真菌药物的药片贴在已接种待测菌的琼脂平板，药片所含药物吸收琼脂上水溶解后向周围区域扩散，形成递减的梯度浓度，待测菌生长被抑制，形成透明的抑菌圈。

抑菌圈的大小反映了待测菌对测定药物的敏感性，根据厂家提供的药敏试验判读标准，判断抗真菌药物的体外敏感性。

33.1 培养基：采用 FMH 琼脂，同时添加氯霉素控制细菌的污染。

厚度严格控制为4cm。

3.2 接种液的配置：3.2.1 接种液的配制中，浓度的控制是最为重要的，接种液过浓会导致比咯类/咪唑类抑菌圈判读困难，而出现假阴性结果。

3.2.2 对于大多数的菌株，接种浓度为 5*105CFU/ml (先配 0.5 麦氏浊度，再用生理盐水1 ：1稀释)；3.2.2.1 对于克柔氏念珠菌(C.krusei)，先配0.5麦氏浊度，再用生理盐水1：10稀释；3.2.2.2 对于隐球菌属(Cryptococcus)，先配1.0麦氏浊度，无需稀释。

3.2.3 接种前，平板先置于 35℃干燥 20-25 分钟。

对于9cm平皿吸 0.5ml接种液，14cm吸1.0ml接种液，倾注于平板表面，涂布均匀，用移液管吸走多余液体。

然后，平板在 35℃干燥10分钟，帖药片。

最终要求，在琼脂表面，菌落恰呈合生长。

3.3 培养条件：在多数情况下，应在 35℃培养 18-24 小时后马上测量抑菌圈，因为培养时间过长会导致假耐药，特别是对于咪唑/吡咯类药物。

即培养过夜后应检查平板，如果抑菌圈清晰，应该马上测量。

如果对于某些菌株在培养过夜未见生长，那么应该再多培养 24 小时。

而对于隐球菌属在 30℃ 培养 42-48 小时。

4严重系统性感染株判读标准注：氟胞嘧啶 10ug 推荐用于黑曲霉试验，而氟胞嘧啶 1ug 适用于念珠菌和其他酵母菌 55.1.对于多烯类抗真菌药(包括两性霉素 B 和制霉菌素)，测量无可见生长的清晰的抑菌圈，抑菌圈出现的菌落必须视为耐药突变株；5.2 对于吡咯/咪唑类抗真菌药以及特比奈芬，在正常生长菌落形成的抑菌圈内，可能会出现由较小的部分被抑的菌落形成抑菌圈。