在临床常见酵母样真菌鉴定中的应用

中意外ＤＮＡ污染，采用无菌双蒸水作为阴性对照。

选择克柔假丝酵母菌（ＡＴｃＣ６２５８）和白色假丝酵母菌（ＡＴｃｃ９００２９）为ＰＣＲ灵敏度参考菌株，以ｌ：１０倍比稀释以浓度为１０１～１０８／ｍｌ作为模板，ＰＣＲ反应最终灵敏度为１０２／ｍｌ。

（５）测序及序列分析ｊＰＣＲ产物回收采用琼脂糖凝胶回收试剂盒，连接反
应采用Ｂｅｃｋｍａｎ测序试剂盒，ｃＥＱ８０００双向测序。

获得序列提交美国国家生物技术信息中心（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎ０１０９ｙＩｎｆｏｎｎａｔｉｏｎ，ＮＣＢＩ）ＧｅｎＢａｎｋ数据库（ｈｔｔｐ：／／ｍ州．ｎｃｂｉ．Ｉｌｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）进行序列比对，分析待检真菌与参考序列相似度。

根据ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ的软件的ＦＡｓＴＡ计算法则，找出与最佳参照序列无法匹配的差异碱基，通过检查电泳峰图进行必要的修改，未知碱基Ｎ视为匹配碱基。

ＢＬＡｓＴ序列比对：由于目前真菌序列比对无明确判断标准，本研究采用细菌１６ＳｒＲＮＡ序列比对标准：①与某种系的代表参照序列相比，未知菌株序列的相似性≥９９％，未知菌株鉴定为该种；②与某种系的代表参照序列相比，未知菌株序列的相似性≥９７％，但＜９９％，未知菌株鉴定为该属；③如未知菌株序列相似性≤９７％，未知菌株不能鉴定为该种或属；④如存在两个或两个种系以上参照菌株与未知菌株序列相似性≥９９％，且两者相似性相差≤０．５％，则暂将未知菌株归为其中相似性较高种系，但不排除未知菌株为另一种的可能性¨０｜。

结果
一、质量控制
克柔假丝酵母菌（ＡＴＣｃ６２５８）、新型隐球菌（ＡＴＣＣ３２６０９）、季也蒙假丝酵母菌（ＡＴｃＣＡｓ２１５００）、葡萄牙假丝酵母菌（ＡＴＣＣ６６０３５）、近平滑假丝酵母菌（ＡＴＣＣ２２０１９）、光滑球拟假丝酵母菌（ＡＴＣＣ“５５０）、热带假丝酵母菌（ＡＴＣＣｌ４６３）及白色假丝酵母菌（ＡＴｃｃ９００２９）的１８ｓｒＲＮＡ基因序列比对相似性均为１００％：Ｖｉｔｅｋ３２ＹＢｃ和显色培养基鉴定符合率均为１００％。

不同种属真菌的ＰＣＲ产物均检测出目的片段（图１）。

二、不同方法鉴定结果比较
在１１５株酵母样真菌中，显色培养基、Ｖｉｔｅｋ３２ＹＢＣ、１８ｓｒＲＮＡ基因序列分析鉴定到种的比例分别为８８．７％（表１）、１００％和１００％，接近国内文献报道∽１２｜。

１．显色培养基与１８ｓｒＲＮＡ基因序列分析鉴定结果比较（表２、３，图２）：显色培养基仅能鉴定出白
注：１．标准带；２．白色假丝酵母菌（醌以池以６妇ｗ）；
３．热带假丝酵母菌（铂蒯池ｔ阳ｐ妇池）；４．光滑球拟假
丝酵母菌（如，ｌｄ渤ｇ缸６ｒ咖）；５．克柔假丝酵母菌
（ｃ口蒯池瓤西）；６．近平滑假丝酵母菌（ｃ口，娥如脚妣厶）；７．葡萄牙假丝酵母菌（仇ｒｌｄ池Ｚｗ妇ｎ沁）；
８．季也蒙假丝酵母菌（血，‘ｄ彘ｋｇ越髓诂嗍ｎ击￡）；９．挪威
假丝酵母菌（血，‘ｄ赴ｋ，ｌＤｎ孵ｎｉ厶）；ｌＯ．阿萨希丝孢酵母
（‰ｈ唧拼∞∞砒茹）；１１．类星形丝孢酵母（舭融妒Ｍ｝
∞姗，涵）；１２．ＡＴｃｃ９００２９白色假丝酵母菌（血，ｌ出如
口珈∞似）；１３．ＡＴｃｃ６２５８克柔假丝酵母菌（＆，‘也如
幻硼ｅｉ）；１４．无菌双蒸水
图ｌ不同种酵母样真菌提取ＤＮＡ的１８ｓｒＲＮＡ基因
ＰＣＲ扩增结果
表ｌ１８ＳｒＲＮＡ基因序列分析法与表型鉴定法
鉴定率比较［株（％）］
色假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、光滑球拟假丝酵母菌、克柔假丝酵母菌，有１３株无法鉴定，且鉴定结果有１１株与基因序列分析结果不同；基因序列分析法鉴定范围广，可鉴定出不同种属真菌，如挪威假丝酵母菌、葡萄牙假丝酵母菌。

２．Ｖｉｔｅｋ３２ＹＢｃ鉴定与１８ＳｒＲＮＡ基因序列分析鉴定结果比较（表２、３，图２）：Ｖｉｔｅｋ３２ＹＢＣ鉴定表２１１５株真菌１８ＳｒＲＮＡ基因序列分析法与
表型鉴定法鉴定率比较（株）
史堡捡验匡堂苤盍兰Ｑ塑生垒旦筮丝鲞筮垒翅￡塾垫』Ｌ坐丛盟：』！些！Ｑ堕：！些丝：塑垒垒
表３１８ＳｒＲＮＡ基因序列分析法与表型鉴定结果不同菌株比较
注：１、４、５为白色假丝酵母菌；２、３、６为热带假丝酵母
菌；７、１１、１２、１３为光滑球拟假丝酵母菌；８为克柔假丝
酵母菌；９、１０为其他假丝酵母菌
图２显色培养基鉴定结果
能将多种酵母样真菌鉴定到种，鉴定结果有１０株与基因序列分析结果不同，白色假丝酵母菌、葡萄牙假丝酵母菌、季也蒙假丝酵母菌鉴定结果无差异，热带假丝酵母菌、克柔假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌等其他假丝酵母菌鉴定则存在差异。

讨论
真菌的分类鉴定方法主要有两大类，一类是表型鉴定，另一类是分子生物学鉴定¨３ｌ。

显色培养基、Ｖｉｔｅｋ３２ＹＢＣ鉴定卡属于表型鉴定，１８ＳｒＲＮＡ基因序列分析法属于分子生物学鉴定。

显色培养基可以快速鉴定４种常见酵母菌（２４～４８ｈ），可同时发现２种以上酵母菌感染¨引，本研究显色培养基鉴定与序列分析鉴定的符合率为８９．２％（９１／１０２）。

这可能是因为：（１）菌株在显色培养基上显色不典型，如２株丝孢酵母属菌和１株热带假丝酵母菌在显色培养基上显绿色，而葡萄牙假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌应显白色却显出其他颜色。

（２）个人在辨色上的差异，蓝色、灰色、紫色色差不清晰。

Ｖｉｔｅｋ３２ＹＢｃ鉴定可根据真菌生化反应鉴定多种临床常见酵母样真菌，鉴定结果与序列分析鉴定的符合率为９１．３％（１０５／１１５），低于国外文献报道（９８．２％）¨５｜，文献中采用Ｖｉｔｅｋ２鉴定系统，比本研究采用的Ｖｉｔｅｋ３２ＹＢＣ鉴定的生化反应多，分类更精细。

热带假丝酵母菌等其他酵母菌鉴定存在差异的原因可能有以下几点：（１）真菌的生长阶段不同，生理生化反应能力不同；（２）某些长期使用免疫抑制剂的患者，培养鉴定之前应用抗真菌药的患者，如血液病患者，重症监护室的患者，其病原菌有可能失去了典型的生理生化特性，甚至变得难于培养¨副；（３）Ｖｉｔｅｋ３２ＹＢｃ数据库有限；（４）环境因素导致表型与基因型不符。

１８ｓｒＲＮＡ基因序列分析法从基因水平明确种
属分类，基因序列分析以核酸为基础，受到外界环境。