等位基因特异性PCR原理和应用-2015.1.16-
高三生物pcr扩增知识点
高三生物pcr扩增知识点PCR（聚合酶链式反应）是现代生物学中一项重要的技术手段，它在分子生物学研究和遗传工程领域扮演着至关重要的角色。
本文将围绕PCR扩增的基本原理、关键步骤和应用领域展开介绍。
一、PCR扩增的基本原理PCR扩增是一种将DNA特异性扩增至大量的技术手段。
其基本原理是通过加热使DNA两个链分离，加入引物使其作为启动子，并在酶的作用下合成新链。
这个循环过程会重复多次，从而使DNA的数量指数增加。
二、PCR扩增的关键步骤PCR扩增一般包括三个基本步骤：变性、退火和延伸。
1. 变性：PCR反应开始时，将DNA样本加热至95℃，使正常结构的DNA分子解链成为两条单链DNA。
这个步骤通常称为变性。
2. 退火：在变性后，PCR反应体系降温至退火温度，引物与目标DNA序列的互补区域发生杂交。
引物通常由两个核苷酸序列组成，一个位于目标序列的5'端，另一个位于目标序列的3'端。
引物的选择对PCR扩增的效率和特异性至关重要。
3. 延伸：在杂交后，加入DNA聚合酶，该酶能以引物为起始点，在退火的条件下延伸核苷酸链。
这个步骤通常被称为延伸。
延伸产生的产物是在目标DNA序列中间的一个复制片段。
三、PCR扩增的应用领域PCR扩增技术广泛应用于生物学研究和遗传工程领域，下面列举了一些常见的应用领域。
1. 分子生物学研究：PCR可以用于从复杂的基因组中增加特定的DNA片段，以分析基因的表达模式、基因序列的变化等。
此外，PCR还可用于检测病毒、细菌和其他病原体的存在，并鉴定它们的种类和亚型。
2. 遗传工程：PCR技术对于基因克隆和转基因研究具有重要意义。
通过PCR扩增，可以得到大量的目标DNA片段，进一步进行基因克隆和宿主细胞中的表达。
3. 古生物学研究：PCR在古生物学研究中扮演着非常重要的角色。
通过从化石组织中的DNA提取并进行PCR扩增，可以获取古生物材料的遗传信息，从而了解古生物的进化和分布。
等位基因特异性PCR原理和应用 ppt课件
验证PCR有效性
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Hale Waihona Puke 19样品的外控和内控
• 待测样品的外控（8号管FAM信号曲线）应有FAM信号 以友芝友试剂盒为例：FAM通道23≤Ct值≤30；
Ct<23：DNA加 入过量
优点
缺点
灵敏度高（0.1-1%） 操作简便 周期短 不产生PCR产物污染 适用样本类型多（如FFPE） 精确突变类型
方法建立需时较长 仅能检测已知突变
适用于临床检验
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测序法与等位基因特异性PCR法比较
敏感度 FFPE标本成功率
商用试剂盒 流程与速度 数据分析要求
试剂成本 仪器成本
Sanger测序法 10-20% 低 无 1-2天 高 低 高
System-PCR，ARMS-PCR）
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PCR扩增过程中，引物从 3’末端开始延伸，要求3’端
碱基与模板完全配对
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等位基因特异性PCR基本原理
Two Allele-Specific (AS) primers, one for each allele of a SNP are designed. The AS primers contain one of two polymorphic nucleotides at the primer 3' end. Two sets of primers, either forward or reverse primers can be designed. If a common reverse or forward primer is used in a PCR reaction, the reaction is called allele-specific PCR (AS-PCR).
遗传学研究中的PCR技术
遗传学研究中的PCR技术PCR技术在遗传学研究中是非常重要的一项技术，因为它能够帮助科学家们更好地研究基因，从而更好地理解生命的本质。
本文将简要介绍PCR技术在遗传学研究中的应用和意义。
PCR技术是一种能够大量扩增DNA序列的方法。
具体来说，PCR是将一个双链DNA模板的两条链分离，并在两条链之间加入适当的引物，通过DNA聚合酶，在适当的温度下反复进行降温和升温的循环，产生大量的DNA复制品。
这种方法通常用于测定DNA序列中的单个基因或一小段DNA。
PCR技术有着广泛的应用范围，尤其是在遗传学研究领域中。
通过PCR扩增DNA序列，科学家们可以研究基因组的不同部分，了解基因表达和突变的机制，探索基因与疾病之间的关系。
下面将分别介绍PCR技术在遗传学研究中的一些典型应用。
1.基因诊断PCR技术可以用于诊断基因突变和基因缺失等遗传病。
例如，通过扩增突变基因本身或者与突变基因相邻的序列，研究者们可以确定突变位置和严重程度，并将其与不同种族和家族的正常人进行比较。
此外，PCR还可以用于分析细胞的染色体构成，检测遗传疾病相关的染色体异常。
2.人类起源和进化研究通过分析一些基因区域或基因组中的单核苷酸多态性（SNP）或简单重复序列（STR），科学家们可以研究人类之间的近亲关系，以及不同人种之间的遗传差异。
这种方法可以用于研究人类起源和进化，探讨人类间的亲缘关系，如父系和母系的起源、迁徙等。
3.基因表达和突变机制研究PCR技术还可以用于研究基因表达和突变的机制。
通过使用RT-PCR技术，科学家们可以扩增出转录后mRNA中的基因序列，从而研究基因表达和调控机制。
此外，PCR还可以用于检测基因组中复制数变异以及染色体的易位等突变。
总之，PCR技术在遗传学研究中有着重要的应用和意义。
通过这项技术，科学家们能够更好地了解基因组的结构和功能，深入研究基因与疾病之间的关系，以及人类的起源和进化。
随着PCR 技术的不断发展和改进，相信它在遗传学研究领域中的重要性将会越来越凸显。
简述pcr技术在基因定点突变中的应用。
标题：PCR技术在基因定点突变中的应用一、PCR技术的概念和原理聚合酶链式反应（PCR）是一种通过复制DNA分子来合成特定DNA序列的技术。
它是由美国生物化学家卡里·穆利斯在1983年首次发明的。
PCR技术可以扩增DNA分子，使之成百上千倍地增加，从而在实验室中方便地进行各种分子生物学研究。
PCR技术的原理是利用DNA聚合酶酶制造复制DNA的过程。
在反应体系中，向DNA模板添加适当的引物，通过多次循环的热循环，使DNA聚合酶依次在模板DNA的两条链上合成新的DNA链，从而实现了DNA分子的扩增。
二、PCR技术在基因定点突变中的应用1.基因定点突变的概念基因定点突变是指DNA序列中的单个碱基（A、T、C、G）发生改变，从而产生了新的等位基因。
这种突变是基因在漫长的演化过程中逐渐积累的结果，对生物的遗传性状和适应环境具有重要影响。
2.PCR技术在基因定点突变中的原理通过PCR技术，可以利用特定的引物扩增出含有突变位点的DNA片段。
通过生物信息学方法设计出含有突变位点的引物，然后将这些引物与待扩增DNA片段进行PCR反应。
在PCR反应中，引物会与模板DNA特异性结合，并在DNA聚合酶的作用下，扩增出所需的DNA片段。
通过测序技术验证PCR产物是否成功扩增，并鉴定突变位点的具体情况。
3.PCR技术在基因定点突变研究中的应用（1）基因工程PCR技术在基因工程中被广泛应用，可以通过基因定点突变来改变特定基因的编码序列，从而获得具有特定功能的重组蛋白质。
利用PCR技术可以在基因的编码序列中引入特定的突变位点，使其产生特定的生物学效应。
（2）遗传疾病研究在遗传疾病研究中，PCR技术可以用来检测基因中的特定突变位点，从而帮助科研人员了解遗传疾病的发病机制。
通过PCR扩增获得含有突变位点的DNA片段，然后进行测序分析，可以帮助科研人员研究遗传病的发病机制，并为临床治疗提供理论依据。
（3）生物多样性研究在生物多样性研究中，PCR技术可以用来检测不同基因型之间的差异，从而帮助科研人员了解不同裙体之间的遗传差异。
等位基因特异性PCR技术在5-脂氧合酶基因多态性检测中的应用
剂 的药 物反 应 ， 临床治疗 哮 喘有非 常 重要 的意 义 。 对 本 研究 采 用 的 Ａ ．Ｃ ＳＰ Ｒ法可快 速 检 测 ５Ｌ 的 Ｓ Ｐ， ．Ｏ Ｎ
并可快速直接进行分型 ， 不需要测序和酶切 ， 具有经 济、 快速 、 简便 、 易行 等特 点 ， 特别适 用 于临床 大批 样
循环 ３ ５次 ， 次 循 环 后 ７ 末 ２℃ 延 伸 １ ｎ ， ０ｍｉ ４℃ 保
存。 １３ Ｐ Ｒ扩 增结 果 ． Ｃ 琼脂 糖凝 胶 电泳检 测 Ｐ Ｒ产 Ｃ
物 Ｐ Ｒ扩增 后取 Ｐ Ｒ产 物 １ Ｌ 采 用 ２ 的琼脂 Ｃ Ｃ ０ ， ％
糖凝 胶 电 泳 ， 定 Ｐ Ｒ 扩 增 结 果 （ ５ Ｉ Ｎ 鉴 Ｃ 取 ｘ Ｄ Ａ Ｌ ｍａ ｅＩ 为标 记 ） ｒ ｒ作 ｋ 。
参考 文献 ：
［ ］Ｃ ｕ ｙ ｇＢ， ｉｏＭ， ｄｎ ｒ ０，ｔａ．Ａ ｎ ｖｌｐ ｌ ｒｈｓ １ ｈ ｎ ｉ Ｅｋ Ｈｉｅｏｉ ｅ １ ｏｅ ｏｙ ｐ ｉ ｎ ｍｏ ｍ，
Ｅ ５ Ｋ ，ｉ ｈ －ｉ ｏ ｙ ｅ ａ ｅ ｇ ｎ ｓ ｏ ｉ ｔ ｄ ｗｉ ｒ ｎ ｈ ａ ｓｈ ２ ４ ｎ ｔ ｅ５ １ ｘ ｇ ｎ ｓ ｅ ｅａ ｓ ｃ ａｅ ｔ ｂ ｏ ｃ ｉ ｌ ｔ ｍａ ｐ ｈ ａ
表 １ 本研究设计的 引物
哮 喘 病 有 关 ¨ 。 花 生 四 烯 酸 的 代 谢 产 物 白 三 烯 ｊ （Ｔ ） Ｌ ｓ 生物 活性 强烈 、 用 时 间持 久 ， 引起 支气 管 作 可 痉 挛 、 道变 应性 炎症 和气 道 高反 应性 。５Ｌ 气 －Ｏ基 因
含有 ｌ 外 显 子 ， Ｎ ４个 ｍＲ Ａ全 长 为 ２ ５ ０ ｂ ， 因库 ６ ｐ 基 中记载 的 单 核 苷 酸 多 态 性 （ Ｎ ｓ 数 多 达 ３ ＳＰ） ６个 。
应用等位基因特异性PCR 检测NPPB 基因突变
应用等位基因特异性PCR 检测NPPB 基因突变发表时间：2015-10-12T15:32:20.100Z 来源：《中医学报》2015年6月第30卷供稿作者：李萌云美玲周代峰王明军刘正旺范美竹[导读] 等位基因特异性PCR技术操作简便，重复性和稳定性好,可作为鉴定NPPB基因RS3753581突变位点的可行方法。
1.贵阳中医学院贵州贵阳 550000；2.海南医学院生物化学教研室海南海口 571199；3.海南医学院附属医院海南海口 570102；4.海南省中医院海南海口 570000【摘要】目的：建立NPPB基因RS3753581突变位点的等位基因特异性PCR技术。
方法：应用针对NPPB基因RS3753581突变位点设计的等位基因特异性PCR技术,对海南黎族人群中NPPB基因RS3753581突变位点类型进行了基因分型检测,同时对经上述等位基因特异性PCR检测分型的样本进行序列测定。
结果：在海南黎族人群中,RS3753581突变位点可检测出NN、NM、MM3种基因型,用等位基因特异性PCR技术鉴定的NPPB基因RS3753581突变位点基因分型结果与序列测定结果完全符合。
结论：等位基因特异性PCR技术操作简便，重复性和稳定性好,可作为鉴定NPPB基因RS3753581突变位点的可行方法。
【关键词】NPPB基因；等位基因特异性PCR；基因分型【中图分类号】R746.4 【文献标识码】B 【文章编号】1674-8999（2015）6-0151-02笔者应用简便、快速的PCR技术检测NPPB基因RS3753581突变的等位基因特异性,讨论探索海南黎族人群中NPPB基因RS3753581位点的多态性,结果报告如下。
1 材料与方法1.1 DNA样品从海南省陵水黎族自治县医院随机采集海南籍黎族正常人群且血缘上无关个体的血液样本219份，用EDTA抗凝、SDS方法提取DNA。
1.2 等位基因特异性PCR扩增NPPB基因1.2.1 引物设计与合成从NCBI中获得人类NPPB基因的两个突变位点上下游500bp的基因序列，用PRIMER5.0软件辅助设计引物，委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
等位基因特异性PCR技术及其法医学应用
等位基因特异性PCR技术及其法医学应用聂燕钗;王斌;赵子琴;周怀谷【摘要】等位基因特异性PCR(allele-specific polymerase chain reaction,AS-PCR)是一种基于等位基因特异性引物引导的PCR技术,可以有效地分析单核苷酸多态性(SNP),包括碱基的转换、颠换以及插入/缺失多态性,在疾病研究、分子诊断以及法医物证学研究中具有很好的应用价值.本文系统地综述了AS-PCR技术的原理、检测手段、改进方法及在常染色体、Y染色体和线粒体SNP等领域的研究成果,探讨其法医学应用价值.【期刊名称】《法医学杂志》【年(卷),期】2014(030)004【总页数】6页(P282-287)【关键词】法医遗传学;聚合酶链反应;综述[文献类型];等位基因特异性【作者】聂燕钗;王斌;赵子琴;周怀谷【作者单位】复旦大学上海医学院法医学系,上海200032;上海市公安局物证鉴定中心法医物证学现场应用技术公安部重点实验室上海市现场物证重点实验室,上海200083;上海市公安局浦东分局刑事科学技术研究所,上海200135;复旦大学上海医学院法医学系,上海200032;上海市公安局物证鉴定中心法医物证学现场应用技术公安部重点实验室上海市现场物证重点实验室,上海200083【正文语种】中文【中图分类】DF795.2单核苷酸多态性（SNP），是指基因组内特定核苷酸位置上单个碱基突变引起的DNA序列多态性，由于其含量丰富、遗传稳定、扩增片段短等特点，被认为是第三代遗传标记，在法医学领域具有较好的应用前景[1]。
当前用于SNP分型的方法主要有限制性片段长度多态性聚合酶链反应、直接测序法、变性高效液相色谱法以及基质辅助激光解吸飞行时间质谱等，但各有限制，如酶切位点相对不多、操作繁琐、价格昂贵等。
与之相比，等位基因特异性PCR（allele-specific polymerase chain reaction，AS-PCR）通过对引物的巧妙设计来检测SNP位点，具有操作简单（与常规STR相似）、费用低、耗时短以及结果可靠等特点[2-3]。
PCR技术的原理操作及应用
1.一次性加好反应液，2～4 小时完成扩增 2.扩增产物一般用电泳分析
对标本的纯度要求低
血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA
PCR技术的局限性
为了构建特定引物，使特定DNA序列的选 择性扩增，必须有一个庞大的已知序列的 数据库。
聚合酶链反应效率差异很大，根据不同的 因素需要优化反应条件。
分子诊断学的发展阶段
分子诊Байду номын сангаас学大致经历了3个阶段：
（1）利用DNA分子杂交技术进行遗传病的基因诊断； （2）以PCR技术为基础的DNA诊断，特别是定量PCR和
实时PCR的应用，不仅可以检测存在于宿主的多种DNA 和RNA病原体载量，还可检测多基因遗传病细胞中 mRNA的表达量 （3）以生物芯片（biochip）技术为代表的高通量密集型 检测技术，生物芯片技术包括基因芯片，蛋白质芯片， 组织芯片等 。
PCR循环参数
（热力学参数）
94 ℃，3min； 94 ℃，45s； 58 ℃，1min； 72 ℃，1min；循环30次 72 ℃，10min； 16 ℃保温
94 ℃预变性，3min 使DNA双链完全打开
变性： 94 ℃变性，45s
94 ℃，3min；
使双链DNA解链为单链
94 ℃，45s；
退火： 58℃，1min
100伏电泳30min，紫外观察并拍照记录。
PCR扩增产物检测 2
PCR扩增产物检测及结果判定
PCR技术的注意事项
防止污染，建立良好的质量控制，避免污染。 引物设计合理 Taq酶扩增错误率较高，大约1/100对碱基/20个循环 镁离子浓度对反应效率的影响 仪器稳定性，升降温速率，管子的密合度等 设置对照： PCR反应针对模板有阳性/阴性对照
PCR原理与应用
PCR技术原理及应用摘要：PCR特异性依赖两端的引物，经高温变性低温复性中温延伸循环倍增，底物为四种脱氧核苷酸，需要耐高温DNA聚合酶。
主要应用在生物学和基因工程实验室、疾病检测、临床应用、商品检疫、法医鉴定、新的医药与工农业制品等领域。
PCR技术全称为聚合酶链式反应（Polymerase-Chain-Reaction）是上世纪80年代发展起来的新技术，发展至今已相当成熟，被广泛应用于分子生物学和基因工程实验室、疾病检测、临床应用、商品检疫、法医鉴定、新的医药与工农业制品等领域。
基本原理PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性主要依赖于和靶序列两端互补的寡核苷酸引物，它由变性——复性——延伸三个基本反应步骤构成。
首先，根据靶序列DNA片段两端的核苷酸序列，合成两个不同的寡聚核苷酸引物，它们分别与DNA的两条链互补配对。
将适量的寡聚核苷酸引物与四种脱氧核糖核苷三磷酸（dDNA）、DNA聚合酶以及含有靶序列片段的DNA分子混合，经过高温变性使DNA双链解开、低温复性使底物与模板附着和中温延伸合成新的DNA片段这三个阶段的一次循环，DNA的量即可增加一倍，而循环n 次，则DNA的量增加2n倍，如（图1）图1 .聚合酶链式反应示意图【M】扩增反应（○1~○4）迅速地循环，产生了大量相同的片段，每一片段中均包含目的DNA片段（1）模板DNA的变性：模板DNA经过加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，完成下一轮扩增反应；（２）模板DNA与引物的复性：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至５５℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；（3）引物的延伸：DNA模板-引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP 为反应原料，靶序列DNA序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，从5’端到3’端延伸出一条新的与模板链互补的半保留复制连，重复循环变性——复性——延伸三个过程就可获得更多的“半保留复制连”，以这些新链为模板就可进行下一次的PCR循环。
PCRSSCP原理及应用
PCR-SSCP原理及应用随着分子生物学技术的发展，检测基因结构和突变的方法不断涌现.尤其是PCR技术问世以后，各种与PCR相结合的基因检测技术进一步推动了基因研究的发展.如不对称PCR产物的直接测序、核糖核酸酶酶切法(Ribonuclease cleavage，RNAase)、限制性片段长度多态性分析(Restriction Fragment Length PolymorPhism，RFLP)等等已成为基因分析的有力工具.但这些方法操作比较繁琐，局限性较大，或要求实验条件高，不适合一般临床实验室使用.1989年问世的PCR-SSCP(下文称SSCP)作为检测基因突变的方法，经不断地改进和完善，更为简便、快速、灵敏，不但用于检测基因点突变和短序列的缺失和插入，而且还被用于DNA定量分析，监测PCR诊断实验中的交*污染情况，以及传染源的调查等.由于SSCP的突出的优点，近几年被大量地应用.一、SSCP的原理及特点日本Orita等研究发现，单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会或多或少地影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同.因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开.作者称该方法为单链构象多态性(Single-Strand Conformation PolymorPhism，SSCP)分析.在随后的研究中，作者又将SSCP 用于检查PCR扩增产物的基因突变，从而建立了PCR-SSCP技术，进一步提高了检测突变方法的简便性和灵敏性.其基本过程是:①PCR扩增靶DNA;②将特异的PCR扩增产物变性，而后快速复性，使之成为具有一定空间结构的单链DNA分子;③将适量的单链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳;④最后通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显色分析结果.若发现单链DNA带迁移率与正常对照的相比发生改变，就可以判定该链构象发生改变，进而推断该DNA片段中有碱基突变.该方法简便、快速、灵敏，不需要特殊的仪器，适合临床实验的需要.但它也有不足之处.例如，只能作为一种突变检测方法，要最后确定突变的位置和类型，还需进一步测序;电泳条件要求较严格;另外，由于SSCP是依据点突变引起单链DNA分子立体构象的改变来实现电泳分离的，这样就可能会出现当某些位置的点突变对单链DNA分子立体构象的改变不起作用或作用很小时，再加上其他条件的影响，使聚丙烯酰胺凝胶电泳无法分辨造成漏检.尽管如此该方法和其他方法相比仍有较高的检测率.首先，它可以发现靶DNA片段中未知位置的碱基突变.Takao，经实验证明小于300bP的DNA片段中的单碱基突变，90%可被SSCP发现，他认为现在知道的所有单碱基改变绝大多数可用该方法检测出来.另外，SSCP方法可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将不同迁移率的突变单链DNA分离，并且还可以进一步提纯.用这种方法可以最终从DNA 序列水平上鉴别突变DNA片段.二、SSCP的不断改进SSCP技术自创立以来，经历了自身发展和完善的过程，刚建立时是将同位素掺入PCR 扩增物中，通过放射自显影来显示结果.这给该技术的推广造成一定的困难，随着DNA 银染方法与PCR-SSCP结合，尤其是直接溴乙锭染色方法的应用，使得该方法大大简化. 最近，SSCP值得注意的改进是将DNA-SSCP分析，改为RNA-SSCP分析，其基本原理是: RNA有着更多精细的二级和三级构象，这些构象对单个碱基的突变很敏感，从而提高了检出率，其突变检出率可达90%以上.另外，RNA不易结合成双链，因此可以较大量的进行电泳，有利于用溴化乙锭染色.但该方法增加了一个反转录过程;还需要一个较长的引物，内含有启动RNA聚合酶的启动序列，从而相对地增加了该方法的难度.为了进一步提高SSCP的检出率，可将SSCP分析与其它突变检测方法相结合.其中与杂交双链分析(HeterocluPlex analysis，Het)法结合可以大大提高检出率.Het法是用探针与要检测的单链DNA或RNA进行杂交，含有一对碱基对错配的杂交链可以和完全互补的杂交链在非变性PAG凝胶上通过电泳被分离开.对同一靶序列分别进行SSCP和Het 分析可以使点突变的检出率接近100%，而且实验简便.三、PCR-SSCP的实验操作在小于1Kb长度的情况下，DNA片段长度与丙烯酰胺的浓度选择如下:DNA片段长度(核苷酸数) (%)1Kb～700b700b～500b 5500b～200b 8200b 12在进行SSCP前首先要通过PCR扩增出特异性好的产物(琼脂糖电泳不能有过强的拖尾).1)制备聚丙烯酰胺凝胶(PAG)按上表制所需的胶液，将梳子插入模子，从梳子一端加入胶，当胶液快到梳齿时，使模子向加胶端倾斜，继续慢慢加胶，边加边放端模子以防止气泡形成，室温放置1h使之凝固.然后拔掉梳子，顶部加入1×TbE封闭，备用.2)电泳取10μlPCR产物，加入10μl变性剂(95%甲酰胺，10mmol/%溴酚蓝)、30μl 石蜡油，煮沸5min，取出立刻放入冰浴中2min以上，然后将水相全部上样，10-15℃下电泳.开始在300V电压下电泳5min，然后在120V电泳8h，取下凝胶，将其浸在含ml溴化锭的1×TbE缓冲液中染色30--45min，在紫外灯下观察，或进行银染.3)银染法将PAG板用去离子水洗二次，浸入10%乙醇和%冰醋酸溶液固定6min.用去离子水洗二次，再浸入%AgNO3溶液中10min.用去离子水洗3--5次，然后浸入%NaOH和%甲醛溶液中显色7min.最后，用%NaCO3终止显色.四、SSCP的应用自从Orita等用SSCP进行人类DNA多态性分析以来，该方法大量地用于检测和肿瘤发生有关的基因突变，例如检测星形细胞瘤、脑瘤、小细胞肺癌、胃癌、肠癌等肿瘤中的P53基因的突变、肺癌的ras基因突变等.最近Sugano等用银染色SSCP法，成功地检测了c-Ki-ras2基因第12位的突变，电泳和银染色过程在小时内完成.SSCP还用于检测引起人类遗传性疾病的研究上，如在囊性纤维化中起作用的CFTR基因、神经纤维瘤1型基因、家族性结肠息肉基因的研究中.最近，Sharkar等用RNA-SSCP法检测了28名b 型血友病患者的凝血因子IX的基因序列，并与DNA-SSCP和直接基因测序法进行了比较，发现在全长的凝血因子IX基因组中，有20处碱基点突变，RNA-SSCP可检测出其中的70%，而DNA-SSCP只能检测出35%，显示了RNA-SSCP比DNA-SSCP有更高的灵敏性.#P#分页标题#e#SSCP法除大量地用于基因突变的检测外，还用于病毒的分型、监测PCR 实验中的污染情况、以及病原体传播途径的研究中.YaP用巢式PCR对来自不同国家和地区的HbV标品进行了检测，并对扩增产物进行了SSCP分析，发现每个标本的SSCP图谱完全不同，不仅证明了HbVDNA具有地区性变异，而且排除了交*性污染的可能性，为保证PCR诊断结果的可靠性找到了好方法.另外，YaP等还将SSCP用于DNA定量分析上，他们将SSCP 与竞争性PCR法相结合进行乳腺癌细胞突变P53基因的定量分析，并取得了初步成功. 该方法的优点在于，内标和待测DNA只有一个碱基不同，这样使内标和待测DNA有相同的扩增条件，从而更准确地测出DNA的量.从以上可以看出，SSCP正在分子生物学领域发挥着巨大的作用.五、SSCP注意的事项SSCP是一种快速、简便、灵敏的检测基因突变的方法，为了使SSCP 达到最佳效果，应注意下列事项.①重复性.影响SSCP重复性的主要因素为电泳的电压和温度.这两个条件保持不变，SSCP图谱可保持良好的重复性.一般SSCP图谱是二条单链DNA带，但有时有的DNA片段可能只呈现一条SSDNA带，或者三条以上，这主要是由于两条单链DNA之间存在相似的立体构象.有时三条以上的SSCP图谱是由于野型DNA片段和突变型DNA片段共同存在的结果.②靶DNA序列长度的影响在实验中发现SSCP对短链DNA或RNA的点突变检出率要比长链的高，这可能是由于长链DNA和RNA分子中单个碱基的改变在维持立体构象中起的作用较小的缘故.而有人认为在DNA链较短的(400bP以下)情况下，DNA的长度不会影响SSCP 的效果.他们仔细选择了实验条件，发现354bP的DNA中点突变的检出率仍可达到90%以上.③电泳电压和温度的影响:为了使单链DNA保持一定的稳定立体构象，SSCP应在较低温度下进行(一般4℃-15℃之间).在电泳过程中除环境温度外，电压过高也是引起温度升高的主要原因，因此，在没有冷却装置的电泳槽上进行SSCP时，开始的5min应用较高的电压(250V)，以后用100V 左右电压进行电泳.这主要是由于开始的高电压可以使不同立体构象的单链DNA初步分离，而凝胶的温度不会升高.随后的低电压电泳可以使之进一步分离.在实验中应根据具体实验条件确定电泳电压.④DNA片段中点突变的位置对SSCP的影响点突变在DNA和RNA中的位置对SSCP检测率的影响，取决于该位置对维持立体构象作用的大小，而不是仅仅取决于点突变在DNA链上的位置(有人认为点突变在DNA链中部要比在近端部容易被SSCP检测出来).White曾设计了一组样品DNA 片段，并将其中的点突变设在DNA链的中部，而且该点又正处在发夹结构顶端的环上，结果发现SSCP只能检测出9个样品中的2个(检出率为22%)，说明DNA链中任何部位的突变，只要对其单链立体构象没有影响，都有可能被漏检.⑤SSCP的结果断定:由于在SSCP分析中非变性PAG电泳不是根据单链DNA分子和带电量的大小来分离的，而是以单链DNA片段空间构象的立体位阻大小来实现分离的，因此，这种分离不能反映出分子量的大小.有时正常链与突变链的迁移率很接近，很难看出两者之间的差别.因此一般要求电泳长度在16--18cm以上，以检测限为指标来判定结果.检测限是指突变DNA片段与正常DNA片段可分辨的电泳距离差的最小值.大于检测限则判定链的迁移率有改变，说明该DNA序列有变化，小于检测限则说明链之间无变化.例如，一般检测限定为3mm，那么当两带间距离在3mm以上，则说明两链之间有改变.另外检测限不能定的太低，否则主观因素太大，易造成假阳性结果.另外，SSCP 分析中其它条件，如PCR产物的上样量，PAG的交联度、以及胶的浓度等，都应根据具体实验进行选择确定.总之，SSCP分析法是一种快速、简便、灵敏的突变检测方法，适合临床实验室的要求.它可以检测各种点突变，短核苷酸序列的缺失或插入.随着SSCP分析不断完善，它将成为基因诊断研究的一个有力工具PCR-SSCP技术－哈尔滨医科大学实验原理聚合酶链式反应-单链构象多态（Polymerase Chain Reaction-Single Strand Conformation Polymorphism，PCR-SSCP）技术是在PCR技术基础上发展起来的，它是一种简单、快速、经济的用来显示在PCR反应产物中单碱基突变（点突变）的手段。
等位基因特异性PCR原理和应用
等位基因特异性PCR原理和应用简介等位基因特异性PCR（allele-specific PCR，AS-PCR）是一种能够根据DNA序列的差异性通过PCR技术进行检测的方法。
使用AS-PCR，可以通过区分不同的等位基因，检测某一特定等位基因是否存在于样本中。
AS-PCR可用于很多领域，如医学、生物学等。
PCR 基础AS-PCR是PCR的一种变体，因此需要先了解PCR的基本原理。
PCR（聚合酶链式反应）是一种体外扩增DNA分子的方法。
PCR通过混合DNA模板、引物、聚合酶和核苷酸，定向扩增DNA模板的特定区域，生成高度纯净的、特定序列的DNA产物。
PCR过程包含三个步骤：1.前消旋：将DNA分子中的双链DNA在一定条件下变为单链DNA。
2.反向转录：在单链DNA的基础上，通过引物引导聚合酶，延伸DNA链，合成相应的单链模板。
3.持续扩增：以恒温条件下循环反应DNA链的延伸和分离，不断扩增产物。
PCR是一种极其灵敏、快速、精准的方法，可用于检测非常少量的基因组DNA 或人工合成DNA。
AS-PCR是PCR在基础上的一种改进，可以检测等位基因特异性。
等位基因特异性PCR原理AS-PCR 是一种特异性扩增方法，首先确定特定位点上的指定等位基因；然后通过合适的引物来进行扩增，从而区分不同等位基因的存在与否。
AS-PCR基于外显子上的SNP（单核苷酸多态性）位点，在此位点上，两条等位基因序列不同之处是SNP，因此选择适当的引物可以将其与不同的等位基因匹配。
AS-PCR需要设计引物池，其中每个引物都只能与目标序列的其中一种等位基因匹配。
同时，还需要存在两个共同的探针，其中一个探针与特定等位基因一致，另一个则与其不一致。
通过不同的颜色标记其标签，可用于检测样本是否包含特定等位基因。
等位基因特异性PCR的应用AS-PCR在基因诊断、医学遗传学和生物学研究中是很有用的。
1.基因诊断： AS-PCR技术可以识别某种疾病的致病基因或疾病相关的等位基因型。
等位基因特异扩增荧光pcr法的原理
等位基因特异扩增荧光PCR法原理科普同源一步荧光等位基因特异性PCR 的基本原理同等位基因特异性PCR 一样，同样需要三条引物，分别针对不同等位基因的两条上游引物、一条共同的下游引物，不同之处在于检测方法。
在图14-6 中，阳离子多聚物PFP［9，9-bis（6-N，N，N-trimethylammoni-um）hexyl fluorenylene-phenylene dibromide］在荧光共振能量转移检测系统（fluorescence res-onance energy transfer，FRET）实验中用作共跑聚电解质，荧光素标记的dGTP 和dUTP 作为受者，PFP 作为荧光素的供者，以满足对于FRET 的要求。
含有G 等位基因的靶DNA 序列作为模板，在图14-6 的情况A 中上游引物3' 含有与G 配对的C，引物与模板配对很好，PCR 反应正常进行。
在Taq DNA 聚合酶存在下，链延伸时dGTP-F1 和dUTP-Fl 掺入到DNA 链中。
经过指数扩增后，得到大量的荧光素标记的扩增产物。
一旦加上含有阳离子的PFP，DNA 与PFP 之间的强静电相互作用使得荧光素靠近PFP，PFP 与荧光素发生了有效的FRET。
在情况B 中，上游引物的3' 端是与等位基因 C 配对的，与等位基因G 并不互补，在热循环过程中，只有反向引物延伸引起的线性扩增，产生较弱的荧光素标记的PCR 产物，在加入PFP 之后，发生无效的FRET。
通过引发PFP 和荧光素的发射密度的变化，就可能分析SNP 的基因型。
引言分子生物学领域的PCR（聚合酶链式反应）技术是一种重要的基因检测方法，它能够在短时间内扩增目标DNA序列，为等位基因的检测提供了高效的手段。
在PCR技术的基础上，等位基因特异扩增荧光PCR法应运而生，通过引入荧光标记和特异性引物，使得我们能够更准确、快速地检测等位基因的存在。
PCR基础原理回顾PCR是一种通过DNA聚合酶在体外扩增特定DNA片段的技术。
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精确突变类型
适用于临床检验
测序法与等位基因特异性PCR法比较
Sanger测序法 敏感度 FFPE标本成功率 商用试剂盒 流程与速度 数据分析要求 试剂成本 10-20% 低 无 1-2天 高 低 焦磷酸测序 5-10% 较高 有 2-3天 高 低 ARMS 1% 高 有 <1天 低 略高
拟开发产品
• 特异性引物：7条 • 参照引物：1条 • 下游引物：1条 • Taqman探针：1条 （已验证特异性） （已验证特异性） （已验证特异性） （已设计，待订购）
• 锁核酸阻滞探针：1条（已设计，待订购） • 阳性对照：包含7种突变的质粒DNA模板 （已制备并测序） • Taq酶，最好为Taq Gold （hot start enzyme) • qPCR混合反应液
结直肠癌患者检测KRAS突变相关指南
• 欧洲药品评估局（EMEA，2008）指出：KRAS野生型的进展期结直肠癌患者可能从 帕尼单抗中受益，而突变型患者受益较少。 美国临床肿瘤学会（ASCO，2009）推荐：转移性结直肠癌患者应检测KRAS突变， 如有KRAS12、13位突变，则不应进行EGFR单克隆抗体治疗； 美国FDA指南推荐：在使用靶向药物西妥昔单抗和帕尼单抗治疗转移性结肠直肠癌前 必须检测KRAS基因的基因型；2012年7月6日批准第一个用于结直肠癌的基因检测 （Qiagen），以判断西妥昔单抗是否有效； •
等位基因特异性PCR 的原理与应用
2015.1.16
内容概要
基本原理
实验方法
临检项目—KRAS、EGFR突变检测
科研应用—BSG位点分型
等位基因特异性PCR的基本原理
单核苷酸多态性（SNP）检测方法
限制性酶切片段长度多态性 （RFLP）
单链构象多态性 （SSCP）
变性高效液相色谱 （DHPLC） 异源双链分析 （HA） 基质辅助激光解吸飞行时间质谱 （MALDI-TOF MS） 动态等位基因特异性杂交 （DASH） 基因芯片法 TaqMan探针技术 焦磷酸测序法 ……
You F. M. 2008, BMC Bioinformatics
四引物法ARMS-PCR
单管反应
缺陷：
凝胶电泳
耗时长
开管操作
易污染
使用荧光定量PCR检测
real time PCR
速度快
闭管操作
不易污染
等位基因特异性PCR技术特点
优点 缺点 方法建立需时较长 仅能检测已知突变
灵敏度高（0.1-1%）
项目进展-KRAS
模板 516 517 518 520 521 522 532 WT 阴参 引物 532P 532P 532P 532P 532P 532P 532P 532P 532P Cт 36.52584 36.80177 36.39018 37.23503 36.97367 37.01616 16.01479 31.0284 Undetermined Cт 19.89434 19.90041 19.23109 19.56911 18.96716 18.51238 18.76427 19.11962 Undetermined
3
4 5Leabharlann T790ML858R L861Q
PCR缓冲液、T790M引物探针、内标、参比染料ROX
PCR缓冲液、L858R引物探针、内标、参比染料ROX PCR缓冲液、L861Q引物探针、内标、参比染料ROX
23μl
23μl 23μl
6
7 8
INS
DEL
PCR缓冲液、Ins引物探针、内标、参比染料ROX
仪器成本
高
高
低
等位基因特异性PCR的 实验方法
操作流程及数据解读
实验操作
收到样本之后：
试剂盒（以友芝友EGFR试剂盒为例）
编号 1 2 位点 G719X S768I 内容 PCR缓冲液、G719X引物探针、内标、参比染料ROX PCR缓冲液、S768I引物探针、内标、参比染料ROX 规格 23μl 23μl
•
KRAS突变影响非小细胞肺癌药物疗效
• KRAS基因野生型的非小细胞肺癌患者能从小分子酪氨酸激酶抑制剂 （TKI，如吉非替尼、厄洛替尼）治疗中获益，而基因突变的患者易 发生抵抗。
KRAS突变型患者使用厄洛替尼联合化疗后，其无症状生存期和总生存期明显低于野生型 患者（图中红线所示）
Anderson SM, 2011, Expert Rev. Mol. Diagn Eberhard DA, 2005, J Clin Oncol
40循环
阴性对照和阳性对照
无DNA污染 • 阴性对照（空白对照） 应无FAM荧光信号产生，或Ct值≥38
• 阳性对照（弱阳性对照）
FAM通道Ct值≤32，VIC通道Ct值<38， 但可能会由于不同仪器的不同阈值设
置而发生波动。
验证PCR有效性
样品的外控和内控
• 待测样品的外控（8号管FAM信号曲线）应有FAM信号 以友芝友试剂盒为例：FAM通道23≤Ct值≤30； Ct<23：DNA加 入过量 30<Ct<34： DNA加入量较低 Ct≥34：需重新 制备样本
非小细胞肺癌患者检测KRAS突变相关指南
• 美国国立综合癌症网络（NCCN，2009）指出，KRAS突变与非小细胞 肺癌患者TKI抵抗有关，KRAS基因测序有助于确定哪些病人适合TKI 治疗。当KRAS基因发生了突变，则不建议病人使用厄洛替尼进行分子 靶向治疗。
KRAS主要突变位点
• 在结直肠癌中，KRAS突变主要发生于codon12 (80%)、codon13 (15-20%)、codon61和146 (<5%)；在肺癌中，约97%的KRAS突变 发生于codon12、13，其余位于codon61和146。
模板
引物
Cт
517位突变
516 517 518 520 521 522 532 WT
阴参
517P 517P 517P 517P 517P 517P 517P 517P 517P
Undetermined 23.0278 Undetermined Undetermined Undetermined Undetermined Undetermined Undetermined Undetermined
KRAS基因突变影响结直肠癌药物疗效
• KRAS基因野生型的转移性结直肠癌患者能从EGF抗体（西妥昔单抗、 帕尼单抗）治疗中获益，而基因突变的患者治疗效果很差；
KRAS突变型患者对西妥昔单抗无应答，其总体生存期明显低于KRAS野生型患者
Karapetis CS, 2008, N Eng J Med
532位突变
模板 516 517 518 520 521 522 532 WT 阴参
引物 CP CP CP CP CP CP CP CP CP
参照引物
临检项目—EGFR检测
EGFR突变背景
• EGFR (epidermal growth factor receptor) 基因位于染色体7p11.2， 大小192kb，是上皮生长因子（EGF）细胞增殖和信号传导的受体。 • 研究发现EGFR突变与吉非替尼、厄洛替尼的疗效密切有关。其中
临检项目—KRAS
KRAS背景
• KRAS是一种原癌基因，长约35kb，位于12号染色体，是RAS基因家 族成员之一，编码的蛋白主要参与PI3K、PTEN、AKT和RAF、MEK、 ERK信号通路的调控； • EGFR在通路中位于KRAS上游，配体与之结合后可以激发其酪氨酸激 酶活性，导致KRAS的活化和通路中信号传导； • KRAS是许多恶性肿瘤的常见突变基因：胰腺癌（65%-90%）、结直 肠癌（40%）、肺癌（20%）、卵巢癌（15%）。
等位基因特异性PCR基本原理
Two Allele-Specific (AS) primers, one for each allele of a SNP are designed. The AS primers contain one of two polymorphic nucleotides at the primer 3' end. Two sets of primers, either forward or reverse primers can be designed. If a common reverse or forward primer is used in a PCR reaction, the reaction is called allele-specific PCR (AS-PCR).
产物污染 耗时长 灵敏度低
操作繁琐
？
仪器昂贵
等位基因特异性PCR
• 等位基因特异性 PCR （Allele Specific-PCR，AS-PCR） • 又称扩增阻碍突变系统PCR （Amplification Refractory Mutation System-PCR，ARMS-PCR）
PCR扩增过程中，引物从 3’末端开始延伸，要求3’端 碱基与模板完全配对
项目进展-KRAS
516位突变
•
第二批引物能较好区分质粒DNA突变 （SYBR green染料，ABI7500）
模板 516 517 518 520 521 522 532 WT 阴参 引物 516P 516P 516P 516P 516P 516P 516P 516P 516P Cт 24.03719 Undetermined Undetermined Undetermined 36.00975 38.87938 39.47913 Undetermined Undetermined
Δ Ct = 突变检测Ct – 内控检测Ct 以友芝友EGFR试剂盒为例 阴性 Ct值 Ct>38或无Ct值 Ct>38或无Ct值 Ct>38或无Ct值 Ct>38或无Ct值 Ct>38或无Ct值 Ct>38或无Ct值 Ct>38或无Ct值 阴性 Ct值 Ct≤38 Ct≤38 Ct≤38 Ct≤38 Ct≤38 Ct≤38 Ct≤38 ΔCt值 ≥9 ≥8 ≥8 ≥7 ≥7 ≥7 ≥7 Ct值 Ct≤38 Ct≤38 Ct≤38 Ct≤38 Ct≤38 Ct≤38 Ct≤38 阳性 ΔCt值 <9 <8 <8 <7 <7 <7 <7