等位基因特异性-PCR联合限制性内切酶消化法检测JAK2V617F突变(一)

等位基因特异性-PCR联合限制性内切酶消化法检测JAK2V617F突变(一)

作者：申徐良陈方平魏武张梅香史文芝秦小琪徐洪亮

【摘要】目的：建立敏感特异的JAK2V617F点突变的临床检测方法。方法：基因组DNA从HEL细胞或正常志愿者外周血中提取。采用等位基因特异性-PCR（Allelespecific-PCR，AS-PCR）和限制性内切酶消化的方法检测基因组中JAK2V617F突变。结果：本AS-PCR法可对JAK2基因扩增出364bp的内参照条带，当存在JAK2V617F突变时，又可以扩增出203bp的突变条带。只有野生型内参照条带364bp可被BsaXⅠ消化切割。结论：AS－PCR法和限制性内切酶法是检测JAK2V617F突变的敏感特异的检测方法，可以成功应用于临床检测。

【关键词】等位基因特异性-PCR；JAK2V617F突变；限制性内切酶BsaXⅠAbstractObjective:ToestablishasensitiveandspecifictestforJAK2V617Fpointmutation.Methods:Gen omicDNAwasisolatedfromHELcellsorPeripheral-bloodcellsfromnormalvolunteer.Allele-specificpol ymerasechainreactions(AS-PCR)andrestrictionenzymedigestionwereperformedtodetectthemutati oningenomicDNA.Results:Acontrolband(364bp)canbeobtainedbyAS-PCR,andamutedband(203bp) canbeobtainedonlywhenJAK2V617Fwaspresented.Onlywildtypecontrolband(364bp)canbedigeste dbyrestrictionenzymeBsaXⅠ.Conclusion:AS-PCRandrestrictionenzymedigestionweresensitiveand specifictestsforJAK2V617Fpointmutation,andcanbesuccessfullyusedforclinicaltest. KeywordsAllelespecific-PCR;JAK2V617Fmutation;RestrictionenzymeBsaXⅠ

JAK2基因属JAKs(Januskinases/Justanotherkinases)家族成员，是胞浆非受体性酪氨酸激酶,在多种造血生长因子受体信号转导中发挥关键作用〔１〕。2005年，Baxter〔２〕和Kralovucs 〔３〕先后发现大部分骨髓增殖性疾病患者携带有一个获得性的JAK2基因突变-JAK2V617F，该基因突变位于JAK2基因第1849位，原来的鸟嘌呤（G）被胸腺嘧啶（T）所取代，导致原位于617位的缬氨酸错义编码为苯丙氨酸(G→T,JAK2V617F)。该突变的阳

性率在PV中高达65%～97%、ET为23%～57%和IMF为35%～57%，在AML/CML中有少量表达〔２～6〕。JAK2V617F基因突变的发现是近年来骨髓增殖性疾病发病机制的突破性进展，因此有学者将其称为骨髓增殖性疾病的“JAK2时代”。JAK2V617F的发现对于临床上骨髓增殖性疾病的诊断和鉴别诊断有非常重要的意义。为此，我们在临床上建立了两种敏感特异的JAK2V671F点突变的检测方法－等位基因特异性－PCR法（Allelespecific-PCR，AS-PCR）和限制性内切酶消化法。这两种方法的应用，有利于提高骨髓增殖性疾病的临床诊断水平。

1材料与方法

1.1细胞培养

HEL细胞株购自中国科学院上海科学研究院，培养于含10%胎牛血清(Hyclone)、100U/mL青霉素，100U/mL链霉素的RPMI1640(Gibco)培养基中，置于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养，每3d换液一次。待细胞生长至>80%汇合时以1∶3的比例传代，取对数生长期的细胞用作实验。

1.2基因组DNA制备

HEL细胞基因组和正常人血液基因组DNA用血液基因组提取试剂盒（上海生物工程公司产品）提取。

1.3AS-PCR及产物分析

PCR引物合成工作由北京奥科生物公司完成。各引物序列如下：公用反向引物(R1)5＇-CTGAATAGTCCTACAGTGTTTTCAGTTTCA-3＇、野生型正向引物(F1)5＇-ATCTATAGTCATGCTGAAAGTAGGAGAAAG-3＇（364bp）、突变特异性正向引物(F2)5＇-AGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATATT-3＇（203bp）。PCR反应体系为50μL,每管中加入80ngDNA 模板，公用反向引物(10μM)1μL，突变特异性正向引物(10μM)1μL或野生型正向引物(10μM)1μL，10XPCR缓冲液5μL，25mMMgCl23μL，10mMdNTPs1μL，5U/μL的Taq聚合酶1μL，

最后用去离子水补足50μL。置于MJResearchPTC-100基因扩增仪中按以下程序扩增:先94℃变性11min,然后进行扩增循环，包括变性40s（94℃）、退火1min（54℃）、和延伸1min（72℃），扩增35循环，最后72℃延伸10min。AS-PCR产物经2.0%琼脂糖凝胶（含EB）电泳鉴定，应用AlphaEaseFC凝胶成像处理系统观察并分析结果。

1.4.JAK2V617F的限制性内切酶酶切鉴定

BsaXⅠ限制性内切酶为NEB公司产品。酶切反应体系：PCR产物20μL，NEBBuffer44μL，BsaXⅠ1μL（2U），去离子水15μL，总体积40μL，37℃温育4h。酶切完毕后于2％琼脂糖凝胶中电泳观察结果。

2结果

2.1.AS-PCR法检测JAK2V617F突变

HEL细胞株是人红白血病细胞株，有学者〔6〕证实HEL细胞为JAK2V617F基因突变的纯合子。因此，在本实验中我们以HEL细胞作为一个已知的含有JAK2V617F突变的的阳性标本，用于建立JAK2V617F突变的检测方法。AS-PCR过程中野生型正向引物(F1)5＇-ATCTATAGTCATGCTGAAAGTAGGAGAAAG-3＇和公用反向引物(R1)5＇-CTGAATAGTCCTACAGTGTTTTCAGTTTCA-3＇分别位于基因组上该突变位点的上游和下游，扩增产物为364bp，该扩增作为AS-PCR的阳性对照，用于检验基因组DNA提取的质量和PCR体系的正确性。无论基因组中是否存在JAK2V617F突变，只要提取的基因组DNA完整，PCR 体系正确，这两条引物都可以扩增出364bp的产物。突变特异性正向引物(F2)5＇-AGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATATT-3＇是针对突变位点设计的突变引物，该引物3’端包含2个错配的核苷酸。当基因组中存在JAK2V617F突变时，该引物与公用反向引物(R1)可以扩增出203bp的产物，当基因组中不存在JAK2V617F突变时PCR不能扩增。图1为AS-PCR的结果，在该图中可以看到野生型正向引物(F1)和公用反向引物(R1)扩增出的条带位于300bp 和400bp之间（364bp），同时突变特异性正向引物(F2)与公用反向引物也扩增出一条清晰锐利的条带，大小为200bp左右（203bp）。