实验一细胞形态细胞器的显微结构的观察

•4. 激光共聚 焦扫描显微镜 （具有高分辨 率可进行显微 断层扫描）
• LCSM照片 •蓝色为细胞核， 绿色为微管
•（能观察活细胞 ）
•5.暗视野显微镜
• 暗视野显微镜（dark field microscope）的聚光镜中央有当 光片，使照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光 线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。利用这 种显微镜能见到小至 4-200nm的微粒子，分辨率可比普通显微镜高 50倍。
•2. 显微镜的调节
瞳距调节
屈光度调节
•调节
粗调松紧调节旋钮
聚光镜中心调节
•②10X 物镜
•① 标本
•④ 聚光镜升降 旋钮
•③ 孔径 光栏
•⑤ 光轴中心调节 螺钉
•③ 视场 光栏
孔径光栏调节
•N.A聚=(0.6-0.8)N.A物
孔径光栏开度与图象
•100% •70% •30%
孔径光栏的运用
经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。
显微镜物象是否清楚不仅决定于放大倍数，还与显微镜的分辨力有关 。
制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65~1.78，所用介质的折射率越 接近玻璃的越好。对于干燥物镜来说，介质为空气，镜口率一般为 0.05~0.95；油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近1.5。
•①照明系统：包括光源和聚光器。
•②光学放大系统：由物镜和目镜组成，
• 是显微镜的主体。
•③机械装置：用于固定材料和观察方便，
• 包括镜台(载物台) 、调节器和、
• 物镜转换器(旋转器)等。
• 尼康E-600显微镜 •基础知
2.体视显微镜（可直接进行解剖及观察并具有正像立体感）
•3.荧光显微镜
•尼康E800荧光DIC显微 镜
•尼康NT-88NE显微操作/注射 仪
四、实验用品
各种组织切片
•五、 实验步骤
• (一)显微镜的使用 •1. 观察前的准备工作 • (1)观察者要养成显微镜镜检的工作习惯，观察时要双 • 眼同时睁开，一边观察一边进行记录或描绘。 • (2)观察时所用的材料、药品和各种器具要预先准备好。 • (3)显微镜在使用之前应检查一下它的各个部件是否完整 • 和正常，并对载物台、目镜、物镜以及聚光器上端透 • 镜进行必要的清洁工作。然后进行合轴调节。
普通光线的波长为400~700nm，因此显微镜分辨力数值不会小于 0.2μm，人眼的分辨力是0.2mm，所以一般显微镜设计的最大放大倍 数通常为1000X。
•显微镜的分辨率: 也称为分辨力，它是指能把两个物点辨清的最小距离 ，
•
分辨距离越大，则分辨率越低。所以，分辨率是以分辨
•
距离来表示的。
• 其计算公式为: D=0.61λ/N·A
•6.相差显微镜 •
•一种介壳虫的染色体
•7. 偏光显微镜（对于双折射物质进行结构研究） • 偏光显微镜（polarizing microscope）用于检测具有双折射性的
物质，如纤维丝、纺锤体、胶原、染色体等等。
•8.微分干涉差显微镜（图像具有浮雕感） • DIC显微镜其优点是能显示结构的三维立体投影影像。与相差显微
•
厚度，必须调节螺旋仔细地从上到下进行观察。
厚标本和薄标本
•4 - 5 um
•2um
•基础知
•三、显微镜概述
• 显微镜是观察细胞的主要工具。根据光源不同，可分 为光学显微镜和电子显微镜两大类。前者以可见光（紫外线 显微镜以紫外光）为光源，后者则以电子束为光源。
•1.光学显微镜
• 普通生物显微镜由3部分构成：
•
物镜
镜口率(N.A.)
工作距离(mm)
•
10×
0.25
5.40
•
40×
0.65
0.39
•
100×
1.30
0.11
•显微镜的总放大倍数等于目镜和物镜放大倍数的乘积，
•
公式为: M = K1xK2
•焦点深度: 显微镜调焦到看清标本某一点时，不仅是这一物点，而且它的
•
上下两侧也能看清楚两侧的厚度叫做焦点深度。看到标本的全
•
•(2) 兔肝细胞苏木精-伊红(H·E·)染色玻片标本的观察
• 先在干燥系物镜下观察肝小叶的概况，辨认肝细胞，然后用油镜仔细 观察肝细胞的显微结构。注意肝细胞的形状，细胞核和核仁的形状和数 量，细胞核和细胞质的染色区别等。
（二）观察标本
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•荧光显微镜照片（微管呈 绿色、微丝红色、核蓝色）
荧光显微镜和普通显微镜有以下的区别：
1.照明方式通常为落射式，即光源通过物镜 投射于样品上。
2.光源为紫外光，波长较短，分辨力高于普 通显微镜。
3.有两个特殊的滤光片，光源前的用以滤除 可见光，目镜和物镜之间的用于滤除紫外线 ，用以保护人目。
• (3)转到高倍镜，并调焦到看清标本，然后去掉标本，拔出目 镜，眼睛直接向镜筒观察，并把可变 光栏关小，看其亮点是否在 视野中心，如果不是，就要转动聚光器的调节螺旋，把亮点调到 视野中 央，再慢慢开启可变光栏，使视野看到光栏边缘和聚光镜 的边缘相接为止。
•3. 观察操作：
•(1) 低、高倍镜的使用: 先把低倍的物镜用粗调焦螺旋下降至离盖玻片 0.5cm处，然后一边观察视野一边上升物镜，直至看到图像，再将标本移 到视野中心，用细调焦螺旋把物镜调至最清晰处，若要用高倍镜观察时， 把所要进一步放大观察的部位移至视野中央，直接顺时针转换成高倍物镜 ，然后用细调焦螺旋调焦，至看清物像。
N·A·=n·sina/2
• 式中D为分辨率，A为光波波长， n=介质折射率；α=镜口角（标本对 物镜镜口的张角）， N·A·为物镜的数值孔径(镜口率)。镜口角总是要小 于180˚，所以sina/2的最大值必然小于1。
• 在物镜上，有镜口率(N.A.)的标志，它反应该镜头分辨力的大小，其数 字越大，表示分辨率越高，各物镜的镜口率如下表：
实验一细胞形态细胞器的显 微结构的观察
一、实验目的
1.了解普通光学显微镜的工作 原理，掌握光学显微镜的使 用方法。
2.熟悉光学显微镜下细胞的基 本形态与结构。
二、实验原理
细胞是生物体的基本结构单位。构成生 物机体的细胞是多种多样的。要对细胞进行 研究，首先要从其形态结构人手。所以，要 借助显微镜的成像及放大原理，在显微镜下 ，才能观察到细胞的基本形态结构。
镜相比，其标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。
•DIC显微镜下 的硅藻（伪彩色 ）
9. 倒置显微镜（组织培养中长工作距离的）
组成和普通显微镜一样， 只不过物镜与照明系统颠 倒，前者在载物台之下， 后者在载物台之上（右图 ），用于观察培养的活细 胞，具有相差物镜。
•10. 显微操作技 术
•操作步骤如下:
• (1）可变光栏的中心对准聚光镜的中心。如果可变光栏的水 平是固定的，则装配时已保证它与聚光镜合轴，不必调整;如果可 变光栏的水平位置可以移动，则应把可变光栏关到最小，使它的 中心孔对准聚光镜下方的透镜中心。
• (2)载物台上放置观察标本，把聚光器上升到它上端透镜平面 稍低于载物台平面的高度，并将它的可变光栏开到最大，用低倍 物镜，进行调焦到能看见标本，可调反射镜使视野得到最亮和最 均匀 的照明，或把光栏关小，最亮的照明区正处在视野的中央。