丝状真菌

丝状真菌（霉菌）分离筛选方法 霉菌生长在偏酸性有机质丰富的环境中，种类多，形态各异，细胞结构多样。霉菌是一些丝状真菌统称，同酵母菌一样不是分类学的名词。

一.丝状真菌（霉菌）分离筛选

1.培养基：

1.1 PDA 培养基： 马铃薯一葡萄糖培养基（同酵母）并添加80%乳酸数滴（5mL/L ）或0.05 %去氧胆酸钠以抑制细菌生长，葡萄糖改为蔗糖。

注：土壤适于马丁或马玲薯一葡萄糖培养基 ，河泥 霉变材料 生物膜适用于查氏 马丁培养基或PDA 培养基

1.2 察氏培养基：蔗糖30g/L FeSO 4 0.01g/L NaNO 3

2.0g/L MgSO 4 0.5g/L KC1 0.5

g/L K 2HPO 4 1.0g/L PH6.7-7.0

1.3马丁培养基： 葡萄糖10g/L 蛋白胨5g/L KH 2PO 41g/L MgSO 40.5g/L 孟加拉红

（0.1%）3.3mL 灭菌后使用前加入。临用时每升培养基加入 1.0%链霉素 3.0mL PH 自然。

1.4特定培养基：橘皮培养青霉 甜酒曲培养根霉。

2.分离纯化：混菌和涂布法

将样品梯度稀释（10-4、10-5、10-6），混菌和涂布于平板，25-28℃倒置培养3-7d ， 挑取不同典型单菌落孢子或菌丝进行反复划线纯化。据菌落质地、颜色是否纯培养物，若有杂菌重复纯化一次。对于形成固定菌落的（青霉 曲霉等）可用稀释平板混菌法分离纯化，菌落不定型蔓延繁殖的（根霉 毛霉），两菌落及易接触混杂，分离时采取较高稀释度或以培养16-24h 内生长菌丝接种。

根霉菌分离筛选：

属于毛霉目，蔓延繁殖，没有一定的菌落形态，易与其他霉菌混生，故分离时采取大稀释度，早移植，可在培养基添加0.1℅去氧胆酸钠，防止蔓延。可利用形态特征鉴别。

样品：酒药 培养基：葡萄糖豆芽汁培养基（豆芽汁100mL ，酵母膏2g 葡萄糖3g PH 自然。豆芽汁制备：黄豆100g ，加水1000mL ，煮30-40min ，取汁备用）。 分离：颗粒菌体分散，梯度稀释至10-8 混菌法25℃ 16-20h ，观察有无菌丝生长，由于菌丝细短，颜色与培养基相似，不易发现，故在光线处斜视才能发现，用接种钩或菌种针挑挖菌丝一段（一小块），移植于斜面培养基25℃培养3d ， 鉴定：根据形态鉴别根霉，必要时通过生理生化予以验证。性能测定：用米粉或麸皮固体培养测糖化霉活力，以定优劣。

黑曲霉分离筛选：

有固定菌落形态，一般分离法分离，曲霉分生孢子多，团聚紧密较难分散，制备孢子悬液时，加入万分之一至十万分之一月桂基磺酸钠（分散剂），玻璃珠打散效果也可。黑曲霉糖化霉菌株，选用淀粉琼脂培养基或米曲汁 麦芽汁培养基（1-2℅淀粉），通过测量透明圈直径大小，代表糖化力高低。

种曲分散，梯度稀释至10-7 取不同稀释度涂布于平板，28-30℃培养1-2d ，待初生菌落，切忌长成分生孢子。在菌落周围滴加碘液，挑取透明圈大的菌落转接于淀粉察氏培养基斜面，28-30℃培养5d.

性能测定：经固体麸皮培养基培养，测各菌株糖化酶活力。

二.产纤维素酶黑曲霉菌种的复壮

1.培养基：

麸皮汁培养基：麸皮150g 加适当水煮沸30min，两层纱布过滤，再加水过滤一次，两次并在一块，加水定溶至1000mL，加2℅琼脂粉，高压灭菌30min。

三角瓶麸皮培养基：麸皮15g，料水比1：1，拌和均匀高压灭菌，摇散，冷却备用。

2.黑曲霉菌种的复壮：

菌种退化指群体中退化个体在群体中占一定数量，表现生产性能的下降。复壮是通过菌种活化孢子悬液制备初筛复筛等过程，从退化菌体找出未退化的个体。

2.1菌种活化：保存菌种分离前进行菌种活化，待长出孢子后再移植另一斜面，长出孢子后备用。若新接菌种或新制菌种可省去活化过程。培养基为麸皮汁斜面培养基，30℃培养至长满孢子后备用。

2.2孢子悬液的制备：生理盐水50mL/250mL三角瓶，高压灭菌，冷却后备用。挑取菌种孢子1-2环接入三角瓶中，振荡30min，制成孢子悬液。然后制成梯度孢子菌悬液至10-3 10-4 10-5 10-6 10-7

2.3初筛：取10-3 10-4 两个梯度涂布于麸皮汁平板，30℃培养3-5d至单菌落形成。选择生长快，菌落大小适中，孢子茂密，边缘整齐中间凸起的菌落涂片，显微镜观察，菌体大小均匀，菌丝粗壮菌落的中心孢子移接于斜面培养保存。

2.4复筛：退化菌种原始菌种初筛菌种三角瓶固体培养，接种从试管斜面接两环孢子，均匀后30℃培养箱培养，长出白色菌丝物料结饼时扣瓶一次，42h 停止培养，自然风干后测纤维素酶活力。

2.5结论：

初筛要保持足够的数量，避免漏掉优良菌株。黑曲霉多数为诱变菌株，易出现

退化现象。除对斜面定期复壮外，还可从高产发酵池中直接取样分离筛选优良

菌株。

三.米曲霉（酱油生产菌种）的纯化复壮

1.培养基：

1.1豆汁培养基：豆汁1000mL可溶性淀粉20g，MgSO

40.5g KH2PO

4

1.0g （NH

4

）

2SO

4

0.5g PH6.5-7.0

1.2酪素培养基：酪素 4.0g KH2PO

40.3g MgSO

4

0.5g FeSO

4

0.002g NaCl 1g

ZnCl2 .0015g CaCl2 0.002g PH6.5-7.0

1.3三角瓶培养基：100℅麸皮，加水比1：1.2,三角瓶装入20g/250mL，高压灭菌。

2.2孢子悬液的制备：生理盐水50mL/250mL三角瓶，高压灭菌，冷却后备用。挑取菌种孢子1-2环接入三角瓶中，振荡30min，制成孢子悬液。然后制成梯度孢子菌悬液至10-3 10-4 10-5 10-6 10-7

2.3初筛；酪素平板空培24-48h，无菌检查和蒸发表面水分。将孢子悬液梯度稀释，取10-5 10-6 10-7涂布，30℃培养，随单菌落形成，菌落周围逐渐形成透明圈，培养56h进行观察，以D/d大小为初始-筛的依据，转接于斜面并编号，30℃培养72h，冰箱保存。要求酪素用量相同，保持厚薄一致。

2.4复筛：

每支接三个三角瓶，28-30℃培养72h，期间摇瓶两次，扣瓶一次，取成熟种曲5g（三瓶的混合样），测定蛋白酶活力和孢子数。