凝胶过滤层析.ppt
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凝胶过滤层析
持柱床面平整；
洗脱时流速不可太快或太慢；
透析袋中的液体不可装满，否则会将透析袋
胀破。
生物化学与分子生物学教研室
六、实验结果
磷酸盐的鉴定
试剂量
透析前杯内 蒸馏水 透析后杯内 蒸馏水
钼酸铵试剂
氨基萘酚磺酸试剂
反应结果
15滴 10滴
2滴 2滴
3滴 3滴
无 蓝色
生物化学与分子生物学教研室
蛋白质的鉴定
生物化学与分子生物学教研室
实验八
凝胶过滤分离高铁血红蛋白与 高铁氰化钾及透析技术
生物化学与分子生物学教研室
一、实验目的
掌握凝胶层析的原理
通过血红蛋白脱盐实验，初步掌握凝 胶层析技术 了解凝胶层析的应用
生物化学与分子生物学教研室
二、实验原理
凝胶过滤层析：
是利用具有网状结构凝胶的分子筛作用， 根据被分离物质的分子大小不同来进行分 离，也称分子筛层析、排阻层析。
层析管洗净、排出管中气泡
关闭出口
固定在铁架上 加入缓冲液没过砂芯
关闭出口
将凝胶缓缓注入管内
打开出口
自然沉降至柱床高度达20cm左右 不可露出床面 盖滤纸
生物化学与分子生物学教研室
装柱要求:
连续
均匀 无气泡
无分层
床面平整
生物化学与分子生物学教研室
3. 平衡
层析柱稳定后接储液瓶，打开出 口，用两倍于床体积的缓冲液洗脱平 衡(5-10min )，不可露出床面，关闭 出口
生物化学与分子生物学教研室
蛋白质的鉴定
试液量 透析前杯内蒸 馏水 透析后杯内蒸 馏水 透析袋内溶液 15%三氯醋酸 反应结果
40滴 40滴 10滴
凝胶过滤层析脱盐
2.点击“方法”， 打开界面，点击界 面左下方选项，分 析输入参数。
39
点击“方法”，再 点击下方的“采样 控制”，将采样结 束时间改为180分 钟，点击“采用”。
40
记录图谱 保存路径
点击“电压范 围”及“时间 范围”调整电 压值范围1~10 和时间值范围 0~10。（放大 查看）
下端柱头结构
密封圈调节螺帽 的作用： 旋松时密封圈 直径缩小，便于 取出；旋紧时密 封圈被压扁，直 径变大，防止柱 体漏液。
滤膜 密封圈 垫圈
密封圈调 节螺帽
17
二 . 层析柱的安装
洗净层析柱，垂直固定在柱架上:
18
层析柱的安装
旋松密封圈调节螺丝 取下柱头。检查滤膜 是否存在，将柱头装 进玻璃柱体内。
37
操 作 步 骤
将数据采集器通道1 （或通道2）的导线 按颜色分别接在紫 外检测仪背面“记 录仪”的接口上， 要接牢固。
打开电脑，双 击桌面的“N 2000 在线生化 工作站”，选 择通道，进入 工作站界面。
38
3.点击“数据采 集”，进入层析 图谱界面
1.点击“实验信 息”，输入相关 的信息
四. 检测仪器的准备
打开紫外检测仪，预热。按照“N 2000 生化工作 站使用方法”及“核酸蛋白检测仪使用方法”连 接导线、设置参数，调整好仪器。点击“基线查 看”观察基线。
24
样品的准备：
用20ml 0.02mol/L, pH6.5磷酸缓冲液溶 解CHOM沉淀。若溶解后的溶液混浊，要 用滤纸滤去不溶物。收集滤液上 Sephadex G-25凝胶层析柱脱盐。
紧上 密紧 封柱 圈头 调螺 节帽 螺后 丝记 。住 旋
19
三. 装 柱
凝胶过滤层析简介
凝胶
层析柱
加样洗脱
再生保存
柱的选择 柱的装填
同样直径的层析柱 同样长度的层析柱 同样体积的层析柱 理想的层析柱
长层析柱比短的分辨率高； 直径大的比小的分辨率高； 层析柱长的比短的分辨率高。 直径与长度之比是1：25-1：100
常用的支持物有棉花、玻璃纤维、玻璃珠、垂熔玻璃等。 空柱中应留约1/5的水或溶剂。 不断搅拌下使胶粒均匀沉降，使不发生凝胶分层和胶面倾斜。
测定分子量
当Kd=1时，洗脱体积Ve=V0+Vi，为全渗入。 当Kd=0时，洗脱体积Ve=V0，为全排阻。
0＜Kd＜1时，洗脱体积Ve=Vo+KdVi，为部分渗入。
|分类与性质
凝胶
分类性质
凝 胶 含大量液体的具三维网状开孔弹性结构的多聚体结构，
一般制成球状颗粒。
性
能 多孔、亲水、惰性、稳定、色谱性能好
凝胶过滤层析技术
凝胶过滤层析技术 content
凝胶过滤的基本原理
凝胶分类与性质 凝胶过滤的基本操作
凝胶过滤层析的应用
|基本原理
原理
分子
洗脱体积
分配系数
凝胶过滤法又称为分子筛层析、凝胶 层析或排阻层析,是利用凝胶 的网状结构根据分子大小进 行分离的一种方法。凝胶过
Services 滤所用的介质是由交联葡萄
| 基本操作
凝胶
层析柱
加样洗脱
再生保存
凝胶再生 凝胶保存
仅使用过一次的凝胶柱，通常进行更新平衡后 即可再次使用； 湿法：洗净的凝胶悬浮于蒸馏水和缓冲液中，应加入 适量的防腐剂如氯仿、0.05％NaN3或20％乙醇等，不 先用水反复进行逆向冲洗，再用缓冲液进行 然微生物将生长。 平衡，平衡毕，即可重复使用 干法：用浓度逐步升高的乙醇洗净凝胶，使其脱水收 把凝胶倒出，用低浓度的酸或碱按其预处理 缩，再抽干乙醇，用60-80℃的暖风吹干，在室温下 方法进行，处理后重新装柱即可再行使用 保存。 半缩法：是过度法，用60%-70%的乙醇使凝胶部分脱 水，然后封口，4 ℃保存。
实验一凝胶过滤层析分离蛋白质PPT课件
7
（1）层析系统的基本组成
固定相 + 流动相
固体物质 / 固定于固体物质的成分
可以流动的物质： 如水和各种溶媒
8
待分离混合物（A、B）随流动相通过固定相
由于理化性质差异，与两相发生相互作用（吸附、 溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含 量对比）不同
与固定相相互作用力越弱的组分，随流动相移动时 受到的阻滞作用小，移动速度快
CuSO4 碱性
肽键
紫 红色
29
四、实验结果
绘制洗脱结果示意图，并分析所得结果
五、讨论
下次实验：
《碱性磷酸酶的提取及其比活性的测定》 时间：4月18日上午9：00开始
30
2019/12/14
.
31
注意：
防止床面干涸，可适当补充蒸馏水
26
5. 加样
① 加样前打开出口，使床面的蒸馏水流出，正好露 出床面时，立即关闭出口（将干未干）
② 用滴管将混合样品(0.6ml，即血红蛋白和溶菌酶 各0.3ml)缓缓沿柱内壁小心加于床表面
③ 打开出口，使样品进入床内，直到床面重新露出, 立即加入1~2倍于样品体积的蒸馏水
分配层析法 各组分在流动相和固相中的分配系数不同
离子交换层 固定相是离子交换剂，各组分与离子交换
析法
剂亲和力不同而分离
亲和层析法 固定相只能与一种待分离组分专一结合， 以此和无亲和力的其它组分分离
凝胶层析法 固定相是多孔凝胶，各组分的分子大小不 同，因而在凝胶上受阻滞的程度不同
11
按操作形式不同分类
吸水能力，每g干胶吸水量的10倍
数字愈小,交联度越大,被筛分物质的分子量也愈小
17
例： Sephadex G-50：
（1）层析系统的基本组成
固定相 + 流动相
固体物质 / 固定于固体物质的成分
可以流动的物质： 如水和各种溶媒
8
待分离混合物（A、B）随流动相通过固定相
由于理化性质差异，与两相发生相互作用（吸附、 溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含 量对比）不同
与固定相相互作用力越弱的组分，随流动相移动时 受到的阻滞作用小，移动速度快
CuSO4 碱性
肽键
紫 红色
29
四、实验结果
绘制洗脱结果示意图，并分析所得结果
五、讨论
下次实验：
《碱性磷酸酶的提取及其比活性的测定》 时间：4月18日上午9：00开始
30
2019/12/14
.
31
注意：
防止床面干涸，可适当补充蒸馏水
26
5. 加样
① 加样前打开出口，使床面的蒸馏水流出，正好露 出床面时，立即关闭出口（将干未干）
② 用滴管将混合样品(0.6ml，即血红蛋白和溶菌酶 各0.3ml)缓缓沿柱内壁小心加于床表面
③ 打开出口，使样品进入床内，直到床面重新露出, 立即加入1~2倍于样品体积的蒸馏水
分配层析法 各组分在流动相和固相中的分配系数不同
离子交换层 固定相是离子交换剂，各组分与离子交换
析法
剂亲和力不同而分离
亲和层析法 固定相只能与一种待分离组分专一结合， 以此和无亲和力的其它组分分离
凝胶层析法 固定相是多孔凝胶，各组分的分子大小不 同，因而在凝胶上受阻滞的程度不同
11
按操作形式不同分类
吸水能力，每g干胶吸水量的10倍
数字愈小,交联度越大,被筛分物质的分子量也愈小
17
例： Sephadex G-50：
凝胶过滤层析
因此分子的正常Ｋav值0~1之间,这种由小 到大的顺序决定了物质流出的顺序。
排阻极限： 是指不能进入凝胶颗粒孔穴内部 的最小分子的分子量。
排阻极限代表一种凝胶能有效分离的最大分 子量。
第二节 凝胶介质的分类和性质
1） 葡聚糖凝胶 ① G类葡聚糖（Sephadex） ② LH-亲脂型葡聚糖 ③ Sephacryl
凝胶过滤原理示意图
凝胶层析的几个概念
外水体积（Vo）：是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒间液体流 动相的体积。 内水体积（Vi）：是指凝胶颗粒中孔穴的体积，凝胶层析中固定相体积就是指内水体 积。 基质体积（Vg）：是指凝胶颗粒实际骨架体积。 柱床体积（Vt）：是指凝胶柱所能容纳的总体积。 洗脱体积 （Ve）：样品中某组分洗脱下来所需洗脱液的总体积。
（2） 琼脂糖凝胶
商品名 Sepharose（瑞典）
1）2B,4B等型号，数字代表颗粒中琼脂糖的百 分含量，数字越大，分离的范围越小 2）与1，3－二溴异丙醇反应生成交联琼脂糖， 稳定性提高；
Bio－gel A(美国）
一般有A0.5, A1.5等型号，数字×106代表分 离的分子量极限；
与葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶相比，琼脂糖凝 胶机械强度和筛孔稳定性好，洗脱速度可以快些
对于凝胶层析，分配系数实质上表示某个组分在内水 体积和在外水体积中的浓度分配关系。
Ｋav＝（Ｖｅ－Ｖｏ）／(Ｖt － Vo)
它只与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔 隙的大小分布有关，而与柱的长短粗细无 关，也就是说它对每一物质为常数与柱的 物理条件无关。
（1）Ｋav = 0时,Ve = Vo,意味着该分子完全被排 阻于凝胶颗粒之外,全部分布于流动相里,在固定相 分布为0,而最先流出。
层 析PPT演示课件
22
主要机理是分子筛效应,当被分离物质 流经凝胶柱时,因各组份的分子大小不同,在 凝胶受到的阻滞作用有差异,从而造成各组 分在凝胶柱中的迁移速度不同得到分离。
3
色谱历史 古罗马人分析混合染料（类似辐射纸色谱）
1903（1906）年，Michael Tswett提出色谱法 1931年，Kuhn采用柱色谱分离了类胡萝卜素 1941年，Martin和Synge提出分配色谱法 1944年，Martin等又提出纸色谱法 1952年，Martin和James发明了气液色谱法 1955年，第一台商品气相色谱问世，标志着现 代色谱分析的建立 1956年，Stahl系统研究了薄层色谱法(TLC)
层析
CHROMATOGRAPHY
1
掌握：层析的概念、一般原理 凝胶层析的基本原理 装层析柱的过程及装柱要求
熟悉：层析技术的分类 凝胶层析的特点 凝胶的结构与性质
了解：凝胶的选择 柱、样品、洗脱液的选择 凝胶的保存
2
一.概述
层析Chromatography(色谱),利用混合 物中各组分的物理化学性质间的差异(溶解 度、分子极性、分子大小、分子形状、吸 附能力、分子亲合力等) ，使各组分在支持 物上集中分布在不同区域，借此将各组分 分离。
10
.离子交换层析 （ion-exchange chromatography ） ----利用离子交换剂与各组分之间的离子亲和
力不同而进行层析分离的方法。
.凝胶层析（gel chromatography） ----利用不同组分之间分子大小不同，在通过
凝胶介质时所受到的阻滞作用的差异而进 行分离的方法。
其固定相也可有两种状态，一种是以 固体作为吸附剂的固定相，另一种是以涂 布在固体载体表面的液体作为固定相。
主要机理是分子筛效应,当被分离物质 流经凝胶柱时,因各组份的分子大小不同,在 凝胶受到的阻滞作用有差异,从而造成各组 分在凝胶柱中的迁移速度不同得到分离。
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色谱历史 古罗马人分析混合染料（类似辐射纸色谱）
1903（1906）年，Michael Tswett提出色谱法 1931年，Kuhn采用柱色谱分离了类胡萝卜素 1941年，Martin和Synge提出分配色谱法 1944年，Martin等又提出纸色谱法 1952年，Martin和James发明了气液色谱法 1955年，第一台商品气相色谱问世，标志着现 代色谱分析的建立 1956年，Stahl系统研究了薄层色谱法(TLC)
层析
CHROMATOGRAPHY
1
掌握：层析的概念、一般原理 凝胶层析的基本原理 装层析柱的过程及装柱要求
熟悉：层析技术的分类 凝胶层析的特点 凝胶的结构与性质
了解：凝胶的选择 柱、样品、洗脱液的选择 凝胶的保存
2
一.概述
层析Chromatography(色谱),利用混合 物中各组分的物理化学性质间的差异(溶解 度、分子极性、分子大小、分子形状、吸 附能力、分子亲合力等) ，使各组分在支持 物上集中分布在不同区域，借此将各组分 分离。
10
.离子交换层析 （ion-exchange chromatography ） ----利用离子交换剂与各组分之间的离子亲和
力不同而进行层析分离的方法。
.凝胶层析（gel chromatography） ----利用不同组分之间分子大小不同，在通过
凝胶介质时所受到的阻滞作用的差异而进 行分离的方法。
其固定相也可有两种状态，一种是以 固体作为吸附剂的固定相，另一种是以涂 布在固体载体表面的液体作为固定相。
第七章层析分离技术2——凝胶过滤层析
特点：
（1）介质不带电荷, 具有化学惰性，不与被分离物 质发生化学反应，条件温和，不会使物质变性；
（2）色谱介质不需再生,可反复便用； （3）分离效率高，回收率较高； （4）广泛应用于生物大分子的初级分离，脱盐等。 （5）分辨率较低，需采用细长柱。 （6）经过凝胶过滤色谱后样品被稀释，上样前需
显影响 其分离效果不受去污剂、促溶盐类、变性剂等影响 能在多种有机溶剂存在下使用
②Superdex
根据分级范围不同，可分为若干型号（见表5.6，P80）， 其中，数字越大，孔径越大。 prep grade 颗粒较大。
Superdex peptide Superdex 30 prep grade Superdex 75、200 （ prep grade ）
根据交联之前母胶中琼脂糖的含量不同，Sepharose CL系 列凝胶也有三种类型：Sepharose CL-2B、Sepharose CL4B和Sepharose CL-6B。
特点
Sepharose CL系列凝胶在颗粒直径、分级范围方面与Sepharose系 列完全相同
在pH稳定范围、机械强度（流速）及温度稳定性等方面得到了很 大的改进
二、凝胶过滤介质
2. 凝胶介质的种类
按基质组成主要可以分为 ：
葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、聚苯乙烯 -二乙烯苯凝胶、二氧化硅凝胶，以及由两种物质混合 形成的如琼脂糖-葡聚糖混合凝胶、聚丙烯酰胺-葡聚糖 混合凝胶等。
按凝胶过滤层析能达到的柱效和分辨率又可分为：
标准凝胶介质：颗粒尺寸较大（一般为100~250 μm），机
（1）葡聚糖凝胶（Sephadex ） G-数字 联度越大，分级范围越小。）
凝
胶 过
（2）琼脂糖凝胶
（1）介质不带电荷, 具有化学惰性，不与被分离物 质发生化学反应，条件温和，不会使物质变性；
（2）色谱介质不需再生,可反复便用； （3）分离效率高，回收率较高； （4）广泛应用于生物大分子的初级分离，脱盐等。 （5）分辨率较低，需采用细长柱。 （6）经过凝胶过滤色谱后样品被稀释，上样前需
显影响 其分离效果不受去污剂、促溶盐类、变性剂等影响 能在多种有机溶剂存在下使用
②Superdex
根据分级范围不同，可分为若干型号（见表5.6，P80）， 其中，数字越大，孔径越大。 prep grade 颗粒较大。
Superdex peptide Superdex 30 prep grade Superdex 75、200 （ prep grade ）
根据交联之前母胶中琼脂糖的含量不同，Sepharose CL系 列凝胶也有三种类型：Sepharose CL-2B、Sepharose CL4B和Sepharose CL-6B。
特点
Sepharose CL系列凝胶在颗粒直径、分级范围方面与Sepharose系 列完全相同
在pH稳定范围、机械强度（流速）及温度稳定性等方面得到了很 大的改进
二、凝胶过滤介质
2. 凝胶介质的种类
按基质组成主要可以分为 ：
葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、聚苯乙烯 -二乙烯苯凝胶、二氧化硅凝胶，以及由两种物质混合 形成的如琼脂糖-葡聚糖混合凝胶、聚丙烯酰胺-葡聚糖 混合凝胶等。
按凝胶过滤层析能达到的柱效和分辨率又可分为：
标准凝胶介质：颗粒尺寸较大（一般为100~250 μm），机
（1）葡聚糖凝胶（Sephadex ） G-数字 联度越大，分级范围越小。）
凝
胶 过
（2）琼脂糖凝胶
实验六凝胶过滤层析
实验 六 凝胶过滤层析
一 实验原理
凝胶层析是将样品混合物通过一定孔径的凝胶固定相， 由于在层析过程中样品不同的蛋白质具有不同的洗脱， 使不同的分子量的组分得以别离的层析方法。凝胶层 析的别离过程是在装有多孔物质如交联聚苯乙烯、多 孔玻璃、多孔硅胶、交联葡聚糖等填料的柱中进展的。
填料颗粒含有许多不同大小的孔隙。这些孔隙对于溶 剂分子而言是很大的，他们可以自由扩散出入。对于 溶质分子而言，如果分子大小适宜时，那么可以不同 程度地往孔隙中扩散，大分子量的溶质分子只能占有 较小的孔隙，而小分子量的溶质分子除能占住大孔隙 外，还可以占有另外一些起更小的孔隙。
其定量关系符合以下公式：
Ve=Vo+KV1 Ve：某一溶质的洗脱体积 Vo：层析柱的外水体积 Vi：层析柱的内水体积 K：某一溶质的分配系数
二试剂和器材
1．试剂
Sephadex G-75 0.005M PBS 兰色葡聚糖 样品溶液
二试剂和器材
2．器材 〔1〕带夹套层析柱：φ：h=1:24 〔2〕加样器 〔3〕分部收集器 〔4〕核酸蛋白检测仪 〔5〕小玻棒
三 操作步骤
2 层析柱的选择 对于大分子量化合物的分级别离，要求
柱床体积大于样品体积25倍以上，最高 可达100倍，层析柱的径高比也在25100之间。为了减少温度对别离蛋白质 活性的影响，层析柱外加夹套，通入低 温循环水，以保持低温。
三 操作步骤
3 凝胶柱的装填和凝胶床的检查 将层析柱垂直固定，层析柱预装1/5的平衡溶液，再将适当浓度
三 操作步骤
5 洗脱与收集 为了防止柱床体ห้องสมุดไป่ตู้的变化，造成流速降低及重复
性下降，整个洗脱过程应始终保持一定的操作压。 流速不能过快且要稳定。洗脱液的成分不应改变。 洗脱液采用分部收集器收集，以核酸蛋白检测器 检测洗脱峰。
一 实验原理
凝胶层析是将样品混合物通过一定孔径的凝胶固定相， 由于在层析过程中样品不同的蛋白质具有不同的洗脱， 使不同的分子量的组分得以别离的层析方法。凝胶层 析的别离过程是在装有多孔物质如交联聚苯乙烯、多 孔玻璃、多孔硅胶、交联葡聚糖等填料的柱中进展的。
填料颗粒含有许多不同大小的孔隙。这些孔隙对于溶 剂分子而言是很大的，他们可以自由扩散出入。对于 溶质分子而言，如果分子大小适宜时，那么可以不同 程度地往孔隙中扩散，大分子量的溶质分子只能占有 较小的孔隙，而小分子量的溶质分子除能占住大孔隙 外，还可以占有另外一些起更小的孔隙。
其定量关系符合以下公式：
Ve=Vo+KV1 Ve：某一溶质的洗脱体积 Vo：层析柱的外水体积 Vi：层析柱的内水体积 K：某一溶质的分配系数
二试剂和器材
1．试剂
Sephadex G-75 0.005M PBS 兰色葡聚糖 样品溶液
二试剂和器材
2．器材 〔1〕带夹套层析柱：φ：h=1:24 〔2〕加样器 〔3〕分部收集器 〔4〕核酸蛋白检测仪 〔5〕小玻棒
三 操作步骤
2 层析柱的选择 对于大分子量化合物的分级别离，要求
柱床体积大于样品体积25倍以上，最高 可达100倍，层析柱的径高比也在25100之间。为了减少温度对别离蛋白质 活性的影响，层析柱外加夹套，通入低 温循环水，以保持低温。
三 操作步骤
3 凝胶柱的装填和凝胶床的检查 将层析柱垂直固定，层析柱预装1/5的平衡溶液，再将适当浓度
三 操作步骤
5 洗脱与收集 为了防止柱床体ห้องสมุดไป่ตู้的变化，造成流速降低及重复
性下降，整个洗脱过程应始终保持一定的操作压。 流速不能过快且要稳定。洗脱液的成分不应改变。 洗脱液采用分部收集器收集，以核酸蛋白检测器 检测洗脱峰。
第五章-凝胶过滤层析
2
第五章 凝胶过滤层析 第一节 概 述
凝胶过滤具有的优势 : （1）凝胶介质不带电荷，具有良好的稳定性，分离条件温 和，回收率高，重现性好； （2）通常情况下，溶液中存在各种离子、小分子、去污剂、 表面活性剂、蛋白变性剂等不会对分离产生影响，层析还能 在不同pH、温度下进行； （3）应用范围广，能分离的物质相对分子质量的覆盖面 宽，从几百到数百万，因此既适用于分子量较低的寡糖、寡 肽、聚核苷酸等生物小分子的分离，也适用于蛋白质、多糖、 核酸等大分子物质的纯化； （4）设备相对简单、易于操作、分离周期短、连续分离时 层析介质不需再生即可反复使用。
3
第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
一、凝胶过滤的概念
不同的溶质因不同程度进入介质而在液相中停留的时间不同, 凝胶的孔径和溶质分子大小的关系决定了层析时该溶质在层 析柱中的保留时间，不同的物质因保留时间不同而分离.
4
第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
凝胶色谱分离原理
5
第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
7
第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
2.分子量低于分级范围下限的分子被称为全渗透分子，它们 完全进入凝胶颗粒网孔内部，洗脱时所受阻力最大，流程也 最长，最后从层析柱中被洗脱； 3.分子量在分级范围内的分子被称为部分渗透分子，它们依 据分子大小不同程度的进入凝胶颗粒内部的，是该凝胶介质 的有效分离对象。 如果两种物质分子量均大于凝胶介质分级范围的上限，或者 均小于分级范围下限，它们就无法通过层析而分离。
二、生物分子的相对分子质量、分子大小和形状
每一种特定的凝胶介质都有特定的分子量分级范围，分级范 围是凝胶介质的重要参数。 根据其分级范围，可以将溶质分子分为三类： 1.分子量大于分级范围上限的分子被称为全排阻分子，它们 完全被排阻在凝胶颗粒网孔外，从颗粒间隙中通过，所受阻 力最小，流程也最短，首先从层析柱中被洗脱下来；
第五章 凝胶过滤层析 第一节 概 述
凝胶过滤具有的优势 : （1）凝胶介质不带电荷，具有良好的稳定性，分离条件温 和，回收率高，重现性好； （2）通常情况下，溶液中存在各种离子、小分子、去污剂、 表面活性剂、蛋白变性剂等不会对分离产生影响，层析还能 在不同pH、温度下进行； （3）应用范围广，能分离的物质相对分子质量的覆盖面 宽，从几百到数百万，因此既适用于分子量较低的寡糖、寡 肽、聚核苷酸等生物小分子的分离，也适用于蛋白质、多糖、 核酸等大分子物质的纯化； （4）设备相对简单、易于操作、分离周期短、连续分离时 层析介质不需再生即可反复使用。
3
第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
一、凝胶过滤的概念
不同的溶质因不同程度进入介质而在液相中停留的时间不同, 凝胶的孔径和溶质分子大小的关系决定了层析时该溶质在层 析柱中的保留时间，不同的物质因保留时间不同而分离.
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第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
凝胶色谱分离原理
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第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
7
第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
2.分子量低于分级范围下限的分子被称为全渗透分子，它们 完全进入凝胶颗粒网孔内部，洗脱时所受阻力最大，流程也 最长，最后从层析柱中被洗脱； 3.分子量在分级范围内的分子被称为部分渗透分子，它们依 据分子大小不同程度的进入凝胶颗粒内部的，是该凝胶介质 的有效分离对象。 如果两种物质分子量均大于凝胶介质分级范围的上限，或者 均小于分级范围下限，它们就无法通过层析而分离。
二、生物分子的相对分子质量、分子大小和形状
每一种特定的凝胶介质都有特定的分子量分级范围，分级范 围是凝胶介质的重要参数。 根据其分级范围，可以将溶质分子分为三类： 1.分子量大于分级范围上限的分子被称为全排阻分子，它们 完全被排阻在凝胶颗粒网孔外，从颗粒间隙中通过，所受阻 力最小，流程也最短，首先从层析柱中被洗脱下来；
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工作范围 （肽与蛋 白）D
<700
<1500
<5000
150020000
300070000
4000150000
Sepharose：琼脂糖凝胶 Bio-Gel A
15.0
5000300000
20.0
5000500000
Bio-Gel P：聚丙烯酰胺凝胶分子筛
Sephacryl：用N，N-亚甲双丙烯酰胺交联的葡聚糖凝 胶
注2:数字显示光吸收A读数(可变量程读数模式)
当A量程开关选定在0-1.0A档时，此时数显板上显示 和读数即为光吸收A的实际读数，如显示为080即表示 为0.80A。
当A量程开关切换在其它量程位置时，则数显光吸收 A读数为:
A量程选定在0-2.0档时，数显读数×2=实际光吸收读数 A
A量程选定在0-1.0档肘，数显读数×1=实际光吸收读数 A
（三）凝胶柱的平衡
通过2-3倍柱床容积的洗脱液使柱床稳定，然后在凝胶 表面上放一片滤纸或尼龙滤布，以防将来在加样时凝 胶被冲起，并始终保护凝胶上端有一段液体。
（四）加样
1.准备好部分收集器、核酸蛋白检测仪及记录仪
2.打开柱上端的螺丝帽塞子，吸出层析柱中多余液体直 至与胶面相切。沿管壁将细胞色素C样品溶液5mL小 心加到凝胶床面上，应避免将床面凝胶冲起，打开下 口夹子，使样品溶液流入柱内，同时收集流出液，当 样品溶液流至与胶面相切时，夹紧下口夹子。按加样 操作，用1mL洗脱液冲洗管壁2次。最后加入3－4mL 洗脱液于凝胶上，旋紧上口螺丝帽，柱进水口连通恒 压瓶，柱出水口与核酸蛋白质检测仪比色池进液口相 连，比色池出液口再与自动部分收集器相连（如图）。 （五）洗脱
Kd=0 Kd=1 0<Kd<1 Kd>1
优点：
a. 条件温和 b.操作简便 c. 损失少回收率高 d. 层析 柱可反复使用
凝胶的类型：
Sephadex: 交联葡聚糖
G-10
G-15
G-25
G-50
G-75
G-100
G-150
G-200
吸水量
1.0
1.5
2.5
5.0
7.510.0来自（g/g干凝 胶）2．定位，
将“顺/逆”键置于“顺”或“逆”状态，按“手 动”键，使试管架转至终点，这时报警器工作，报 警指示灯亮，然后将“顺/逆”键置于“逆”或 “顺"状态，本仪器就会自动地对准第一个试管(在 “顺"状态，第一臂试臂为最内的那根。在"逆"状态， 第一臂试管为最外的那根)。如滴管口没对准第一 根试管只要松开换节臂调整螺钉，使滴臂口对准第 一根试管即可。
6、上述5个步骤结束后，就可以在层析柱上加样。当 样品经层析柱分离，通过检测后，就能通过记录仪 给出所需样品吸收的图谱。
7、测试完毕，必须切断电源，并用蒸馏水清洗样品池 和尼龙管。
注l:记录仪光吸收A读数
当采用l0mV量程记录仪时，记录仪的满量程读数对应 于A量程开关所对应的A读数范围。如A量程开关选定 在0-0.5A时，则记录仪满量程光吸收A读数为0.5，当 记录笔指示在记录纸一半 (50%刻度)位置时即为0.25A。
（二）装柱
1.装柱前，必须用真空干燥器抽尽凝胶中空气，并将 凝胶上面过多的溶液倾出。
2.先关闭层析柱出水口，向柱管内加入约1/3柱容积的 洗脱液，然后边搅拌，边将薄浆状的凝胶液连续倾入 柱中，使其自然沉降，等凝胶沉降约2-3cm后，打开柱 的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉集，待沉集 的胶面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱，关闭 出水口。
实验十 凝胶过滤层析纯化 细胞色素C
一、目的要求
1.学习和掌握凝胶过滤层析分离蛋白质的 原理与方法。
2.通过凝胶过滤柱层析对细胞色素C进行纯 化
二、原理
凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用 具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物 质的分子大小不同来进行分离。
Vt=Vo+Vi+Vg Ve=Vo+KdVi Kd=(Ve-Vo)/Vi
四、操作方法
（一）凝胶的选择与处理
1.凝胶及柱的选择 根据细胞色素C的分子量选择Sephadex G100。选用 1.5cm×60cm的柱子。
2.凝胶的处理 凝胶型号选定后，将干胶颗粒悬浮于5-10倍量的蒸馏水 或洗脱液中充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻 出去。自然溶胀费时较长，加热可使溶胀加速，即在 沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸，1-2小时即可达 到凝胶的充分胀溶。加热法既可节省时间又可消毒。
洗脱收集
部分收集器、核酸蛋白检测仪
凝胶的保存方法
0.02%叠氮钠或0.002%洗必泰
应用
a. 分离蛋白质 b. 脱盐 c. 蛋白质分子量的测定
三、仪器的使用－核酸蛋白检测仪及 部分收集器的操作方法
记录仪
1、在仪器使用前，首先检查检测器，电源和记录仪 三部份电路连接是否正确，插上电源插头。
2、接通记录仪电源开关，使电源开关拔到“通”指 示灯亮。记录仪有两档走纸速度，每小时3厘米和 每小时12厘米，可根据记录仪说明书调换不同的 走纸速度。
3、将波长旋钮旋到所需波长刻度上，把量程旋钮拔 到100％T档。
4、按下ON电源箱面板上的电源开关，此时记录仪 指针从零点开始向右移动某一刻度，调节“光量” 旋钮使指针停留在记录仪大约中间位置5mV左右数 字显示为50左右。仪器开机稳定时间大约在1小时 左右，待基线平直后，可加样测试。
5、把检测器进样口塑料管接到部份收集器上，使层析 柱中的洗脱液通过。透光率为"0"厂家巳调好，光密 度A要调零，量程开关拔到100％T，调节光量旋钮， 使记录仪指针在100mV数字显示为100，即透光率为 100%。把量程开关拔到“A"挡，缓慢调节A调零旋 钮，使记录仪指示在"0"位，数字显示为“0"。
凝胶及柱的选择
•凝胶的处理及装柱
凝胶干粉的溶胀（热溶 胀）、浮选、抽气、装 柱、蓝色葡聚糖检查、 平衡
装柱时要注意操作压。
装柱的两种方法：
a.手工操作
1/3床体积水→加入少许凝胶积起1-2 厘米凝胶床→打开出水口→连续缓慢 加入凝胶
b.电动搅拌下的装柱法
（如图4-9）
样品上柱
分析用量：柱床体积的1—2% 制备用量：柱床体积的20—30%
部分收集器的操作方法
1．将“手/自”框内的键置于自动状态，按“定”和 “停”;使定时时间为零，放开“停”按“快”或 “慢”(“定”仍按着)至所需的定时时间，放开"慢" 和“定”，再按一下"停"设定定时时间工作就完毕。 若要查看设置时间，则只需按一下“定”键，就能 显示上一次所设时间，若要以秒显示走时时刻，则 需按下“秒”键。