牛津杯和打孔法抑菌试验
不同检测方法在抗菌肽抑菌效果评价的比较研究
不同检测方法在抗菌肽抑菌效果评价的比较研究作者：潘晓倩等来源：《肉类研究》2014年第12期摘要：目的：比较5种抗菌肽活性测定方法。
方法：以金黄色葡萄球菌、溶血性葡萄球菌和枯草芽孢杆菌为实验菌株，研究牛津杯法、打孔法、滤纸片法、酶标比浊法和活菌计数法对不同质量浓度的抗菌肽抑菌活性评价的比较。
结果：3 种琼脂扩散定性抑菌实验中，打孔法灵敏度高，抑菌圈清晰规则，效果最好；2 种定量抑菌实验中，活菌计数法结果判定更直观，灵敏度高，效果最好。
结论：抗菌肽抑菌活性研究过程中，选用打孔法定性与活菌计数法定量相结合的方法，能够更全面、准确地反应其抑菌活性。
关键词：抗菌肽；抑菌活性；测定方法Abstract： Objective： To comparatively evaluate the performance of several antimicrobial peptide activity assays. Methods： Using Staphylococcus aureus， Staphylococcus haemolyticus and Bacillus subtilis as experimental strains， the antimicrobial activity of the antimicrobial peptide nisin at different concentrations was determined by Oxford cup method， punching method， filter paper method， microtiter plate assay and viable count method， respectively. Results： Among three agar-diffusion methods， punching method was the most sensitive， which provided clear and regular inhibition rings. Our comparison of two quantitative activity assays indicated that viable count method， showing high sensitivity and intuitive results， was better than microtiter plate assay. Conclusion： Combined application of punching method and viable count method allows comprehensive and accurate measurement of antimicrobial peptide activity.Key words： antimicrobial peptide； antimicrobial activity； assay中图分类号：TS251 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2014）12-0017-04抗菌肽是生物体在抵御病原微生物的防御反应过程中产生的一类具有抗菌作用的小分子多肽，其特有的氨基酸组成与结构可以破坏细菌细胞膜结构，导致其死亡[1-2]。
305 牛津杯法抑菌试验
牛津杯法抑菌试验1. 原理将加有牛津杯的双层平板置于培养箱中培养，一方面试验菌（病原菌）开始生长繁殖，另一方面抑菌物质呈球面扩散，形成递减的梯度浓度。
牛津杯周围抑菌浓度范围内的细菌生长被抑制，形成透明的抑菌圈，抑菌圈的大小反映抑菌物质对指示菌的抑制程度。
2. 仪器、设备2.1 超净工作台2.2恒温培养箱：36±1℃。
2.3恒温水浴锅：50±1℃。
2.4高压灭菌锅。
2.5平皿：直径为9 cm。
2.6 移液器（20~200μL，100~1000μL，1~5mL）及配套无菌枪头。
2.7试管：15×150 mm。
2.8 酒精灯。
2.9试管架。
2.10涡旋混匀器。
2.11摇床：36±1℃。
2.12牛津杯。
3. 病原菌、培养基及其他3.1病原菌：大肠杆菌：ATCC25922、沙门氏菌: ATCC14028、金黄色葡萄糖球菌：ATCC6538。
3.2 抑菌物质：益生菌（乳酸菌、芽孢菌）、抗生素或其它抑菌物质。
3.3 培养基：（1）大肠埃希菌：营养肉汤、营养琼脂半固体（琼脂粉含量：1%）、营养琼脂（琼脂粉含量：2%）。
（2）金黄色葡萄球菌：营养肉汤、营养琼脂半固体（琼脂粉含量：1%）、营养琼脂（琼脂粉含量：2%）。
（3）沙门氏菌：营养肉汤、营养琼脂半固体（琼脂粉含量：1%）、营养琼脂（琼脂粉含量：2%）。
（4）乳酸菌：MRS肉汤。
（5）芽孢菌：营养肉汤。
3.4 其它：0.85%灭菌生理盐水，灭菌蒸馏水。
4 测定流程4.1病原菌扩培：在超净工作台内，挑取新鲜的斜面保藏病原菌1环，接种于100mL无菌的营养肉汤培养基中，接种完毕，将三角瓶置于摇床内固定，37℃，200rpm，培养16-20h。
将培养好的病原菌菌悬液用空白营养肉汤培养基稀释10倍，若OD600在0.30-0.36之间，则为有效病原菌菌悬液，此时病原菌菌悬液原液中病原菌含量约为109cfu /ml。
4.2 抑菌物质（抗生素或益生菌菌悬液）的制备：（1）抗生素：抗生素或其它药物用无菌水稀释至所需要的浓度。
抑菌试验——精选推荐
抑菌试验：用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长效力的试验称为抑菌试验。
通过抑菌实验,可以测定一个药物的最低抑菌浓度,用以评价该药物的抑菌性能,这是抗菌药物的最基本的药效学数据。
主要方法有进行定性测定的扩散法（如抑菌斑试验）和进行定量测定的稀释法（如最低抑菌浓度实验）。
1.常量肉汤稀释法抗菌药物贮存液制备1.1.1.抗菌药物贮存液制备抗菌药物贮存液浓度不应低于1000μg/ml(如1280μg/ml)或10倍于最高测定浓度。
溶解度低的抗菌药物可稍低于上述浓度。
抗菌药物直接购自厂商或相关机构。
所需抗菌药物溶液量或粉剂量可公式进行计算。
例如：需配制100 ml浓度为1280μg/ml的抗生素贮存液，所用抗生素为粉剂，其药物的有效力为750μg/mg。
用分析天平精确称取抗生素粉剂的量为182.6 mg。
根据公式计算所需稀释剂用量为：（182.6 mg×750μg/ml）/1280μg/ml=107.0ml，然后将182.6 mg 抗生素粉剂溶解于107.0ml稀释剂中。
制备抗菌药物贮存液所用的溶剂和稀释剂见表5。
配制好的抗菌药物贮存液应贮存于-60℃以下环境，保存期不超过6个月。
药敏试验用抗菌药物浓度范围1.1.2.药敏试验用抗菌药物浓度范围根据NCCLS抗菌药物敏感性试验操作标准，药物浓度范围应包含耐药、中介和敏感分界点值，特殊情况例外。
培养基1.1.3. 培养基NCCLS推荐使用Mueller-Hinton（MH）肉汤，pH7.2~7.4。
需氧菌及兼性厌氧菌在此培养基中生长良好。
在测试葡萄球菌对苯唑西林的敏感性时，应在肉汤中加入2%（W/V）氯化钠，按制造厂家的要求配制需要量的MH肉汤。
嗜血杆菌属菌使用HTM肉汤，肺炎链球菌和其它链球菌使用含2%~5%溶解马血的MH肉汤。
接种物的制备1.1.4.接种物的制备有2种方法配制接种物，一是细菌生长方法，用接种环挑取形态相似待检菌落3-5个，接种于4-5ml的水解酪蛋白（MH）肉汤中，35℃孵育2-6h。
牛津杯法抑菌试验步骤
牛津杯法抑菌试验步骤
一、准备试剂和器材
试剂：待测试的抑菌剂、无菌水、培养基（如LB、麦芽糖等）。
器材：移液管、无菌棉签、牛津杯、试管、培养箱、天平等。
二、制备菌液
从保存的菌种中取适量菌种，接种于无菌培养基中。
将培养基放入培养箱中，在适宜的温度和湿度条件下培养至菌种生长至对数期。
将培养好的菌液用无菌棉签轻轻涂布于无菌平板上，观察菌落的形态和大小。
用移液管取适量的菌液，制备成一定浓度的菌悬液。
三、准备牛津杯
取一块无菌滤纸片，将其放入牛津杯中，使其贴紧杯壁。
用移液管将适量的抑菌剂加入牛津杯中，使其高度达到滤纸片上端边缘。
记录抑菌剂的种类和浓度。
四、加样
取适量的测试样品放入无菌试管中。
用移液管将样品溶液加入牛津杯中，使其高度达到滤纸片上端边缘。
记录样品溶液的种类和浓度。
五、加菌液
用移液管将制备好的菌悬液加入牛津杯中，使其高度达到滤纸片上端边缘。
轻轻摇晃牛津杯，使菌悬液和样品溶液充分混合。
六、培养
将牛津杯放入培养箱中，在适宜的温度和湿度条件下培养一定时间（如24小时）。
观察培养结果，记录细菌的生长情况。
七、结果观察
取出生长至对数期的细菌，用无菌棉签涂布于无菌平板上。
将无菌平板放入培养箱中，在适宜的温度和湿度条件下培养一定时间（如24小时）。
观察细菌的生长情况，记录细菌的数目和形态。
打孔法抑菌试验操作流程
打孔法抑菌试验操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor. I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!打孔法抑菌试验是一种用于评估抗菌药物对细菌生长抑制效果的实验方法。
抑菌试验预习方案
抑菌试验1 定义抑菌试验，用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长效力的试验称为抑菌试验抑菌活性的研究实验方案。
实验方法1. 纸片法（抑菌圈法）将测定菌株接种到培养基中，置37度条件下培养6-24小时，取出备用。
再用无菌吸管吸取上述培养液0.1ml，再用三角刮刀将菌液涂匀。
待培养基表面稍干后，用无菌小镊子分别取出所需的药敏纸片均匀地贴在培养基的表面，轻轻压平，各纸片间应有一定距离，并分别做上标记。
将培养皿置37度恒温箱内培养18-24小时后，测量各种药敏纸片抑菌圈直径的大小。
2. 挖孔法（1）在平板上打孔，然后将药液滴入孔内，用经酒精灯灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。
具体方式：用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌，以每点开始划线涂菌至平皿的1/2，依次划线，自至细菌均匀密布于平皿（将测定菌株接种到培养皿中，置37度条件下培养18-24小时，用灭菌的棉拭子将带将细菌混悬液涂布于平皿培养基表面。
要求涂布均匀）。
（2）以无菌操作将灭菌的不锈钢小管，（外径4mm，孔径与孔距均为3mm，管的两端要光滑，也可用玻璃管和瓷管），放置在培养基上打孔，将孔中的培养基用针头挑出，并以火焰封底，使培养基能充分的与平皿融合（3）加样时，按不同药液加样，用无菌滴管将样品加至满而不溢为止。
3. 牛津杯法（1）双碟的制备方法：将灭菌培养基溶化后取15ml倒入灭菌平皿内。
吸取待测菌株的菌液1-5ml与100ml冷至45度的培养基混匀，然后分别每一平皿加入5ml。
并均匀摊布在具有底层培养基的平皿内。
（2）待培养基凝固后，在每碟中均匀立放小钢管（及牛津杯）4个，用陶瓦盖覆盖。
（3）将下列实验药液分别加入小钢管中，置37度培养18-24小时，量取抑菌圈大小，判定抗菌药物抑菌作用的强弱。
乳酸菌的抑菌实验1产抑菌活性物质乳酸菌的初筛采用纸片法。
将培养好的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌培养液 OD 600分别调整到 0.17、0.19、0.10，各取 100μL 接种于 LB 固体培养基，涂布均匀，固定1h。
抑菌试验方法总结
抑菌试验方法总结用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长效力的试验称为抑菌试验。
通过抑菌实验，可以测定一个药物的最低抑菌浓度，用以评价该药物的抑菌性能，这是抗菌药物的最基本的药效学数据。
主要方法有进行定性测定的扩散法（如抑菌斑试验）和进行定量测定的稀释法（如最低抑菌浓度实验）。
1、定性测定（1）纸片扩散法(disk diffusion test)，K-B法：WHO推荐的全球统一的标准方法。
原理：含有定量抗菌货物的纸睡帖在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断地向纸片周围区域扩散，形成递减的梯度浓度。
在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌的生长被抑制，形成透明的抑菌圈。
抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关。
质控：标准菌株的抑菌圈直径应落在预期范围内，如果超出该范围，应视为失控而予以纠正。
影响因素：培养基的质量、药敏纸片的质量、接种菌量、试验操作质量、孵育条件、抑菌圈测量工具的精度和质控菌株本身的药敏特性等均能影响试验结果的准确性。
操作方法：按每1000 ml蒸馏水称取Muller-hinton Agar 38 g配备M—H琼脂，按每个平皿(直径9 mm)25 ml进行分装。
将孵育16—24 h的菌种分别接种生理盐水试管中，校正浓度至0.5麦氏标准(相当于1.0×108 CFU／m1)。
用无菌棉签拭蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余菌液后在M—H琼脂表面，均匀涂布接种3次，每次旋转平板60度，最后沿平板内缘涂抹1周。
平板在室温下干燥3—5 min后用无菌镊子将药物纸片紧贴于琼脂表面．置35℃孵育16 18 h。
记录抑菌圈的直径，实验。
重复10次。
主要用于比较不同抗菌物质，或者通过不同方法提取的同一种物质的效果。
（2）打孔法药敏实验：待M—H平板干后，用无菌棉签蘸取菌液(相当于1.0×108CFU／m1)，在培养基平板上密集划线接种。
牛津杯法抑菌试验的测定流程
牛津杯法抑菌试验的测定流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor. I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!以下是牛津杯法抑菌试验的大致测定流程：准备工作：1. 准备待检测的样品溶液。
微生物实验五牛津杯琼脂孔洞法
实验五牛津杯（琼脂孔洞法）测定抗菌剂的抑菌效果一、目的：观察抗菌剂抗菌的作用效果，熟练掌握牛津杯法（琼脂孔洞法）体外测定抗菌物质的抗菌活性。
二、原理：抗菌物质从孔洞向琼脂培养基扩散渗透，通过对试验菌的抑杀作用而影响细菌生长繁殖，使菌落形成抑菌圈，依抑菌圈的大小确定抗菌物质抗菌能力的强弱。
三、材料1. 菌种：金黄色葡萄球菌，用营养肉汤培养16~18 h得到的菌液。
2. 药品：氨苄青霉素，肉汤培养基。
3. 器材：生化培养箱、高压蒸汽灭菌锅、水浴锅、灭菌肉汤琼脂培养基、酒精灯、平皿、吸管、0.5 cm 纸片、镊子、记号笔、尺子等。
四、实验步骤1.按照实验一（培养基的配制）的方法步骤配制好肉汤培养基，并在121℃，灭菌20 min后，放在60 ℃水浴锅中保温，注意温度恒定，不要让培养基凝固。
2. 将用于试验的防腐剂（抑菌物质）配制成2个所需的浓度（见表1）。
3.将已经培养好的菌制成一定浓度（106cfu/mL）的悬浮液，用移液管移取1 mL该菌悬液至灭过菌的（121℃，20分钟）培养皿中，倒入15 mL已灭菌的培养基（温度约45℃，用手摸瓶壁不感觉烫手即可），轻轻转动培养皿，使培养基与菌液混匀，静置凝成平板。
4.将凝固后的平板用灭菌后的打孔器在平板上打孔（4个孔洞），并挑出培养基。
（或将已灭菌的牛津杯依次轻轻放置在平板上）5.按照顺时针方向依次在每个孔洞（或牛津杯）中加入抑菌剂，以无菌水做空白对照，每种抑菌剂的浓度做三个平行样。
6.在37 ℃下培养24 h观察，用尺子测量抑菌圈的大小。
五、注意事项1.应在无菌条件下操作，试验完毕后及时灭菌处理。
2.添加抑菌剂的时候注意滴到其他地方，以免影响观察。
六、实验结果表测定抗菌剂的抑菌效果思考题：如何判定防腐剂或抑菌物质的抑菌效果，说明其食品应用的指导意义。
附：1. 药敏试验判定标准表 抗菌药物的抑菌效果判定标准抑菌圈直径（mm ）敏感性 <9 耐药 9~11 低度敏感 12~17 中度敏感 >18高度敏感菌株 药物浓度（µg/mL ） 抑菌圈直径（mm ）抑菌圈平均数判定结果金黄色葡萄球菌氨苄青霉素101010 3030 30。
牛津杯法定量检测大蒜抑菌作用实验
牛津杯法定量检测大蒜抑菌作用实验一、实验目的1.了解大蒜对微生物中大肠杆菌的抑菌作用2.学习不同抑菌效价检测方法的原理和差异3.掌握牛津杯法的抑菌试验二、实验原理抑菌试验是指在体外测定样品的抑菌或杀菌能力。
在药品、功能食品、保健品和化妆品等行业中，所用中药材提取物、天然活性物质（如多糖类、黄酮类和精油类等）和抗生素类等物质的抑菌性能是一个重要指标。
抑菌试验常用的方法有抑菌圈法、菌落计数法、最小抑菌浓度法和比浊法等。
牛津杯法属于抑菌圈法的一种，其原理是利用待测药物在琼脂平板中扩散使其周围的细菌生长受到限制而形成透明圈——抑菌圈，根据抑菌圈大小判定待测药物抑菌效价。
它既可用于定性试验，也可用于定量分析，并且操作便捷、成本低廉、结果准确可靠，在多个领域被广泛使用。
大蒜是百合科葱属植物，具有医食同源性，既是调味品也是天然的药剂。
大蒜具有较高的营养价值，含有丰富的氨基酸、肽类、蛋白质、糖类、脂肪、无机盐、维生素以及蒜油。
同时它还具有抗菌抑菌、抗癌防癌、营养保健、降血压、抗击各种病毒侵袭、提高机体免疫力等功能。
大蒜被誉为“天然广谱抗生素”，对多种致病菌如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和致病性肠道细菌都有较强的抑制或杀灭作用，其抑菌的活性成分主要是含硫化合物等挥发性物质和大蒜素等。
本实验以大蒜作为待测样品、以大肠杆菌（Escherichia coli）作为指示菌，通过牛津杯法定量检测大蒜粗提物对大肠杆菌的抑制作用，让学生在掌握牛津杯法抑菌实验的同时，观察到大蒜粗提液的抗菌杀菌效果，从而增加对生活中食用大蒜对人体的抗感染和保健作用的了解。
三、实验方法1.试验菌种大肠杆菌（Escherichia coli）2.培养基与试剂1)LB液体培养基：胰蛋白胨10 g (1%)；酵母提取物5 g (0.5%)；氯化钠10g (1%)；蒸馏水1000 mL；pH值7.0~7.2。
2)LB半固体培养基（含1%琼脂）: 胰蛋白胨10 g (1%)；酵母提取物5 g(0.5%)；氯化钠10 g (1%)；琼脂10 g (1%)；蒸馏水1000 mL；pH值7.0~7.2。
牛津杯灭菌方法
牛津杯灭菌方法
牛津杯灭菌方法如下：
1. 在“超净台”中，用经（酒精灯）火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。
2. 以无菌操作将灭菌的不锈钢小管（内径6mm、外径8mm、高10mm的圆形小管，管的两端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），放置在培养基上，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙，并在小管处标记各种药物名称。
3. 待几分钟后，分别向各小管中滴加一定数量的各种药液，勿使其外溢。
置37℃培养8-18小时，观察结果。
在进行牛津杯灭菌时，需要严格遵守实验规范和操作流程，确保实验结果的准确性和可靠性。
药物的体外抑菌试验
实验五药物的体外抗菌试验药物的抗菌试验是为了检查药物的抗菌能力.该项试验方法已广泛应用于新药研究和指导临床用药。
如抗菌药物的筛选，提取过程的生物追踪、抗菌谱的测定、耐药谱的测定、药敏试验、药物血浓度测定等各个方面。
药物的体外抗菌试验在实验室进行，优点是方法简便、需时短、用药量少，不需要活的动物、实验条件容易控制.因此,药物的体外抗菌试验已广泛应用各种测定了。
药物的体外抑菌试验是常用抗菌试验方法,其中最常用的方法用系列稀释法和琼脂扩散法。
（一)稀释法(结果示教)稀释法有液体培养基连续稀释法和固体稀释法（斜面法）两种。
这两种方法都可以用来测定药物的最小抑菌浓度（MIC）：是指该药物能抑制细菌生长的最低浓度,通常用μg∕ml或U/ml表示。
（二)琼脂扩散法它是将抗菌药物加至接种试验菌的平板表面，抗菌药物在琼脂胶内向四周自由扩散，其浓度随扩散距离增大而降低，在药物一定的扩散距离内,由于药物的抗菌效应，试验菌不能生长,此无菌生长的范围称为抑菌圈，抑菌圈的大小与药物的抑菌效应成正比。
琼脂扩散法常有纸片法、管碟法、打洞法和挖沟法。
滤纸片法（K-B纸片法）－学生操作滤纸片法是最常用的方法，适用于新药的初筛试验（初步药物是否有抗菌作用）及临床的药敏试验（细菌药物第三性试验、以便选择用药）。
滤纸片分湿、干两种，可以在试验时用无菌纸片沾取药物溶液放在含菌的平板表面，也以预先做成一定浓度的干燥纸片.一般来说预先做成的干燥纸片实用一些而且准确一些。
至于干燥纸片的制备方法:选用吸水力强而且质地均匀的滤纸，用打洞机制成6mm直径的圆纸片，120℃干燥灭菌2小时.然后把配制好的各种适宜浓度的抗生素溶液,每100张纸片加入0。
5ml药液，使它均匀浸润，放在无菌平皿中，37℃，使它干燥，分装小瓶中，封口，4℃保存。
如果是β－内酰胺类抗生素还要放在—20℃保存。
这就制成了干燥的含药液的纸片.一般药敏试验常采用滤纸片法，我们可以根据抑菌圈的大小，来判断菌种对药物的敏感性，是敏感，中度敏感还是耐药.世界卫生组织规定了抗菌药物的敏感性评定标准，在标准实验条件下根据抑菌圈大小来判断.步骤：活化试验菌→涂布试验菌于平板→贴加含药纸片→37度培养24h→观察结果打洞法（结果示教）在含菌琼脂平板上打洞（一般打6个孔,4个小孔加不同浓度标准溶液，另外2个小孔加血清样品,放在37℃，12—18小时，测定其抑菌圈直径。
琼脂打孔法抑菌圈试验
琼脂打孔法（琼脂打孔抑菌圈实验）一、试验原理利用抑菌剂不断溶解经琼脂扩散形成不同浓度梯度，以显示其抑菌作用。
试验通过抑菌圈大小以判断其是否具有抑菌能力。
本试验适用于抑菌剂与溶出性抗（抑）菌产品的鉴定。
二、试验器材、化学试剂及菌种培养皿、试管、5uL～50uL 微量移液器，100uL～1000uL微量移液器以及配套的枪头、10mL离心管、游标卡尺、涂布棒、麦氏比浊管、电动混合器、水浴锅、超净工作台、高压灭菌锅、鼓风干燥箱、生化培养箱、电热炉营养琼脂培养基、PBS缓冲液、无菌水、95%乙醇。
菌种：溶血性链球菌、溶血性葡萄球菌、李斯特菌、结核分枝杆菌、白喉棒状杆菌、吸附性绿脓杆菌、大肠杆菌三、试验步骤1、实验工器具准备及灭菌在锥形瓶中配置营养琼脂培养基，用电热炉加热煮沸至澄清状态，盖好塞子，同PBS 缓冲液、无菌水、配套枪头、涂布棒、离心管一同放入高压灭菌锅中灭菌，121℃杀菌25min。
将培养皿用牛皮纸包好和试管一起放入鼓风干燥箱中灭菌，170℃杀菌2h。
实验前超净工作台及操作室使用前需用紫外灯杀菌30min以上。
2、倒培养皿将培养基及培养皿放置到60℃后开始倒培养皿，培养基使用前摇匀，每个培养皿倒15～20mL左右，倒好后水平静置至完全凝固。
3、菌悬液的制备从冰箱取出需要测试的菌种活化0.5h 后，加入5mL 的PBS缓冲液将斜面上，在手掌上轻轻振打80次，使菌株完全冲下，倒入试管中轻轻摇匀。
吸取1mL 的菌液加入到4mL 的PBS缓冲液中，再吸取1mL稀释的菌悬液依次进行5倍梯度稀释，选择108CFU/mL左右的菌悬液或106CFU/mL左右的孢子悬浮液（对比0.5麦氏比浊管），将选好的菌悬液十倍系列稀释后选第二支试管（即浓度约为106/CFU/mL左右的菌悬液或104CFU/mL左右的孢子悬浮液）进行试验。
4、试验菌的接种用移液枪吸取浓度为 106cfu/mL 试验菌悬液0.1mL ，将其接种到已经倒好的营养琼脂培养皿内，用涂布棒涂布均匀（注意涂布棒每次使用后在酒精灯下灭菌，涂布时动作轻不要刮破培养基），盖好培养皿。
打孔法抑菌试验操作流程
打孔法抑菌试验操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor. I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!打孔法抑菌试验是一种用于评估抗菌药物对细菌生长抑制效果的实验方法。
抑菌实验双层平板打孔法
抑菌实验双层平板打孔法抑菌实验是一种常用的实验方法，用于评估不同物质对细菌生长的影响。
其中，双层平板打孔法是一种常见的抑菌实验方法。
下面将详细介绍双层平板打孔法的步骤和原理。
一、实验材料和设备1. 细菌培养物：需要选择适当的细菌株，如大肠杆菌（Escherichia coli）或金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等。
2. 培养基：可选择适当的培养基，如营养琼脂（Nutrient Agar）或大肠杆菌选择性琼脂（MacConkey Agar）等。
3. 实验物质：需要测试不同物质对细菌生长的影响，如抗生素、消毒剂、植物提取物等。
4. 双层琼脂平板：由两层琼脂制成，上层为较低浓度的琼脂，下层为较高浓度的琼脂。
5. 打孔器具：用于在平板上制作孔洞，可使用钢筒或无菌针头等。
二、实验步骤1. 准备双层琼脂平板：将上层琼脂和下层琼脂分别制备好，并在无菌条件下将两层平板叠加在一起。
2. 制作孔洞：使用打孔器具在平板上制作孔洞，通常可以按照一定的排列方式进行，如网格状、对角线状等。
3. 接种细菌：将需要测试的细菌培养物均匀涂布在整个平板表面上，确保每个孔洞都有细菌接种。
4. 施加实验物质：将待测试的实验物质滴入不同的孔洞中，控制组仅滴加无处理物质。
5. 孵育培养：将接种好实验物质的平板倒置放置在恒温培养箱中，通常在37℃下孵育24-48小时。
6. 观察结果：观察各个孔洞周围是否出现抑菌圈，抑菌圈直径大小可用来评估抗菌活性。
三、实验原理双层平板打孔法利用了两层琼脂的特性。
上层琼脂浓度较低，细菌能够较好地生长；下层琼脂浓度较高，细菌生长受到限制。
当实验物质滴入孔洞中时，会逐渐扩散到上下两层琼脂中。
如果实验物质具有抑菌活性，它会扩散到周围的琼脂中，抑制细菌生长。
在孵育过程中，抑菌圈会逐渐形成，并且其直径大小与实验物质的抗菌活性有关。
如果实验物质没有抑菌活性，则细菌在整个平板上均能生长，孔洞周围不会出现抑菌圈。
用牛津杯法测定益生菌的抑菌活力
用牛津杯法测定益生菌的抑菌活力一、本文概述本文旨在探讨使用牛津杯法测定益生菌抑菌活力的方法及其在实际应用中的意义。
牛津杯法作为一种经典的生物学实验方法，被广泛应用于评估益生菌等微生物的抑菌能力。
本文将详细介绍牛津杯法的实验原理、操作步骤、注意事项，以及实验结果的分析与解读。
本文还将讨论益生菌抑菌活力测定的重要性，以及益生菌在食品、医药等领域的应用前景。
通过本文的阅读，读者可以对牛津杯法有更为深入的了解，并掌握益生菌抑菌活力测定的基本方法，为相关研究和应用提供有力支持。
二、材料与方法1 益生菌菌株：选用具有抑菌活性的益生菌菌株，如乳酸菌、双歧杆菌等。
2 指示菌：选用常见的食品腐败菌或病原菌，如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等，用于评估益生菌的抑菌效果。
3 培养基：制备适合益生菌和指示菌生长的培养基，如MRS培养基、营养肉汤等。
1 益生菌菌株的培养：将益生菌菌株接种于适当的培养基中，在适宜的温度和湿度条件下培养至对数生长期。
2 指示菌的培养：将指示菌接种于营养肉汤或其他适宜的培养基中，培养至对数生长期。
（1）制备含指示菌的琼脂平板：将指示菌悬液均匀涂布于琼脂平板上，使其形成一层均匀的菌膜。
（2）放置牛津杯：在琼脂平板上放置无菌的牛津杯，确保杯底与琼脂表面紧密接触。
（3）加入益生菌菌株：向每个牛津杯中分别加入等量的益生菌菌株悬液。
（4）培养与观察：将平板置于适宜的温度和湿度条件下培养一定时间，观察并记录抑菌圈的形成情况。
（1）测量抑菌圈直径：使用卡尺或直尺测量抑菌圈的直径，以毫米（mm）为单位。
（2）计算抑菌活力：根据抑菌圈直径的大小，计算益生菌菌株对指示菌的抑菌活力。
可以采用相对抑菌活力或绝对抑菌活力等指标进行评估。
（3）数据分析：对多组实验数据进行统计分析，比较不同益生菌菌株之间的抑菌活力差异，以及不同实验条件下的抑菌效果。
通过以上材料与方法，可以准确评估益生菌的抑菌活力，为益生菌的筛选、应用和开发提供科学依据。
305-牛津杯法抑菌试验
牛津杯法抑菌试验1. 原理将加有牛津杯的双层平板置于培养箱中培养,一方面试验菌（病原菌）开始生长繁殖，另一方面抑菌物质呈球面扩散,形成递减的梯度浓度。
牛津杯周围抑菌浓度范围内的细菌生长被抑制，形成透明的抑菌圈，抑菌圈的大小反映抑菌物质对指示菌的抑制程度。
2. 仪器、设备2.1 超净工作台2。
2恒温培养箱：36±1℃。
2.3恒温水浴锅：50±1℃。
2.4高压灭菌锅.2.5平皿：直径为9 cm。
2.6 移液器(20~200μL,100~1000μL，1~5mL）及配套无菌枪头。
2。
7试管：15×150 mm。
2。
8 酒精灯.2。
9试管架。
2.10涡旋混匀器。
2.11摇床：36±1℃。
2.12牛津杯.3。
病原菌、培养基及其他3。
1病原菌：大肠杆菌：ATCC25922、沙门氏菌: ATCC14028、金黄色葡萄糖球菌：ATCC6538。
3.2 抑菌物质：益生菌(乳酸菌、芽孢菌）、抗生素或其它抑菌物质。
3。
3 培养基:（1)大肠埃希菌：营养肉汤、营养琼脂半固体（琼脂粉含量:1％）、营养琼脂（琼脂粉含量：2％）。
（2)金黄色葡萄球菌：营养肉汤、营养琼脂半固体（琼脂粉含量：1％）、营养琼脂（琼脂粉含量：2％）。
(3）沙门氏菌:营养肉汤、营养琼脂半固体（琼脂粉含量:1%）、营养琼脂（琼脂粉含量：2%）。
（4)乳酸菌：MRS肉汤。
（5)芽孢菌：营养肉汤.3。
4 其它：0.85％灭菌生理盐水，灭菌蒸馏水。
4 测定流程4.1病原菌扩培：在超净工作台内，挑取新鲜的斜面保藏病原菌1环，接种于100mL无菌的营养肉汤培养基中，接种完毕，将三角瓶置于摇床内固定，37℃，200rpm，培养16-20h。
将培养好的病原菌菌悬液用空白营养肉汤培养基稀释10倍，若OD600在0。
30—0。
36之间, 则为有效病原菌菌悬液，此时病原菌菌悬液原液中病原菌含量约为109cfu /ml。
4.2 抑菌物质（抗生素或益生菌菌悬液）的制备:（1)抗生素：抗生素或其它药物用无菌水稀释至所需要的浓度。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
抑菌圈直径与药物对测试菌的最低抑菌浓度 呈负相关，即
抑菌圈愈大，MIC愈小。
二、实验材料
• 培养基： 牛肉膏蛋白胨固体培养基 • 菌种：
大肠杆us aureus) 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)
• 药品：阿莫西林、黄芪多糖、 • 其他：牛津杯、培养皿、酒精棉、酒精灯、涂布器、移
液枪、 1mL、200uL 枪头、 恒温培养箱、 超净工作台、 接种环
牛津杯
• “牛津杯”是放被测抗生素的不锈钢小管，小管内径为
6mm，外径为8mm，高10mm的圆筒形管子，管子的重量 尽可能相等。
三、实验操作 1. 倒平板：将已灭菌的琼脂培养基加热到完全融化，倒在培
注意事项
• 在超净工作台中或酒精灯旁操作 • 平板倒好，一定要平 • 牛津杯立直，才能保证杯内抑菌物质均匀的向四周扩散 • 牛津杯均匀摆放于培养基上，位置安排适中，防止出现抑
制圈重叠，可在平皿中央摆一个，外周等距离摆5－6个。
思考题
• 青霉素、头孢菌素类药物的抗菌机制如何？
药敏试验
• 抗菌药物敏感性试验，简称药敏试验，是指对敏感性不能
预测的分离菌株进行试验，测试抗菌药在体外对病原微生 物有无抑制作用，以指导选择治疗药物和了解区域内常见 病原菌耐药性变迁，有助于经验性治疗选药
牛津杯法和打孔法抑菌试验
扩散法又包括纸片法、牛津杯法和打孔法。 由于扩散法操作简单，成本低，已经被大多数 实验室和基层单位所采用
• 稀释法包括试管稀释法和微量稀释法，通过测试细菌在含
不同浓度药物培养基内的生长情况，判断其最低抑菌浓度 （MIC）。
• 扩散法
一、实验原理
将培养基平板置培养箱中培养，一方面试验菌（指
养皿内，每皿约20ml，凝固。 2. 标记：菌种、牛津杯摆放位置、药物及其 浓度 3. 制备菌悬液：用生理盐水洗下试管内的菌苔并稀释。 4. 菌液涂布：吸取1mL 菌液入平板表面，用涂布器涂布将菌 液涂布均匀
5. 摆放牛津杯：在培养基表面垂直摆放牛津杯，轻轻加压， 使其与培养基接触无空隙。 6.加入待检药液：在杯中加入不同稀释度的药液或待检样品。 7. 孵育：加满后在37 ℃培养16~18 h。 8. 结果报告：用毫米尺量取抑菌圈直径，参考表的标准判读 结果，按敏感（S）、中介（I）、耐药（R）报
示菌）开始生长繁殖；另一方面抗生素呈球面扩散， 形成递减的梯度浓度，离杯越近，抗生素浓度越大， 离杯越远抗生素浓度越小。
在牛津杯周围抑菌浓度范围内的细菌的生长被抑制，
形成透明的抑菌圈。
抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度
（药敏实验）或药物对指示细菌的抑菌程度（抑菌 试验）。
一、实验原理
抗生素浓度越高，抑菌圈越大。 在抑菌圈的边缘处，琼脂培养基中所含抑菌物质的浓度即为