p53亚型

p53亚型∆133p53β促进肿瘤干细胞潜能

摘要

肿瘤干细胞（CSC ）是负责形成化疗耐药性和癌细胞转移的细胞。在这里，我们介绍了∆133p53β，它是一种TP53基因的剪接变异体，在MCF-7乳腺癌细胞消耗减少的时候，∆133p53β能增强MCF-7乳腺癌细胞中的干性。∆133p53β刺激关键多能性因子SOX2、OCT3/ 4和NANOG 的表达。同时，在其他具有高转移性的乳腺癌细胞中，侵袭性与肿瘤干细胞潜能增强和TP53剪接体表达增加相关，并且在这些细胞中，SOX2，OCT3/4和NANOG 的表达也受到TP53剪接体的正向调控。利用抗肿瘤药物etoposide 处理MCF-7细胞能够促进肿瘤干细胞形成以及TP53剪接体依赖性的SOX2，OCT3/4和NANOG 表达增强，增加了癌症复发的潜在风险。这项研究表明TP53的一种剪接体能够促进肿瘤干细胞潜能，之前一直认为TP53主要作为肿瘤抑制因子发挥作用，而这项研究提示我们通过这种剪接体的作用，TP53也可以扮演癌基因的角色。 p53通过信号转导途径突变/摄动使得它在肿瘤细胞中的功能的改变以及p53活性的损失是癌症发展的前提。突变型p53被认为在促进入侵中发挥了举足轻重的作用，有利于癌细胞从肿瘤原发部位传播，并最终导致癌细胞转移。最近有报道指出p53在干细胞稳态和多能性的作用。野生型（WT ）p53阻止体细胞重编程。而突变型p53能刺激诱导多能干细胞（iPS ）的形成。P53的枯竭会显著提高细胞重编程的功效，并促进iPS 细胞的产生。因此，p53基因可能被视为基因组的守护者，对重编程也起到一样的作用。

所有这些功能都与全长p53基因（即，TAp53α亚型）相关。然而，TP53基因通过几个机制编码至少12个不同的生理亚型（TAp53[α，β和γ]，∆40p53[α，β和γ]，∆133p53[α，β和γ]和∆160p53[α，β和γ]），这几种机制是：替代启动子（TA 和∆133亚型）、替代

内含子剪接（内含子2：∆40同种型和内含子9：

γβα和,亚型）以及替代翻译起始位点（∆40和∆160亚型）。tap53α亚型是最好的描述并在经典文献中所提到p53一样。基本上，p53的同种型可被分为以下两组：（1）包含激活域的长同种型（TA 和∆40）；（2）没有激活域的短同种型（∆133和∆160）。此外，β和γ亚型不包含典型的C-末端寡聚化结构域，但具有未知功能的附加域。

p53同种型在许多过程中改变p53转录活性，如细胞周期进程，细胞程序性死亡，复制性衰老，细胞分化，病毒的复制，和血管生成。重要的是，P53亚型特别是在人类肿瘤中被解除管制。然而，在癌症干细胞（CSC ）中p53同种型功能的动态平衡从未被探索。在这里，我们指出∆133p53β亚型的确涉及促进癌细胞的干性。∆133p53β在人类乳腺癌细胞系中过表达刺激乳腺球形成和关键多能性和干性调节因子的表达（SOX2、OCT3/ 4、NANOG 和CD24/ CD44），但不包括C-MYC 。此外，使用以MDA-MB-231为基础的细胞系进行试验，我们发现∆133p53亚型表达的增加与癌细胞转移潜能的提高和非黏附性乳腺球群细胞（mammospheres ）的形成有关。最后，将MCF-7和MDA-MB-231细胞与抗癌药物etoposide 利用∆133p53依赖性的方法一起培养同样促进细胞干性。因此我们的结果表明，短p53同种型无论任何p53突变都正调节CSC 潜力。因此，野生型TP53，通常被认为是一种肿瘤抑制基因，也可以作为通过D133p53b 表达的癌基因。

结果

p53亚型表达的改变影响mammosphere 的形成

为了研究在具有CSC潜能细胞中不同p53同种型的作用，我们设计小hairpin RNA （shRNA）（SH），它选择性使特定组亚型基因沉默（图1A;表S1）。简单地说，Sh1敲除所有p53亚型基因，而Sh2靶向长TAp53（反式激活）和∆40p53亚型。Sh3和Sh4靶

向∆133亚型（α，β，和γ）的5’UTR的以及Sh5和Sh6分别针对β和α同种型的3’

端。

P53亚型选择性耗尽影响MCF-7细胞的球形成能力

(A)本研究中p53同种型靶向不同shRNA（SH）的示意图。表示出不同同种型的计算分子量。

(B)MCF-7细胞在Sh1，Sh2，SH3，SH4，SH5转导后（n = 3时独立的实验）对Mammosphere 的定量。

(C-E)用蛋白质印迹法分析在相应的细胞中p53同种型耗尽的情况。（F和G）对RT-PCR在C-MYC，SOX2，OCT3/ 4和NANOG（F）的表达水平以及D133p53和p53同种型B（G）在SH1和SH2的转导后（N =4的独立实验）的定量。

首先，我们测试了MCF-7细胞形成mammospheres的能力，这是一个广泛用于体外评估CSC潜力的方法。与对照细胞相比，所有p53同种型（同Sh1时）沉默导致形成mammospheres 的数量显著减少，而敲除TAp53和∆40p53亚型（SH2）对细胞形成mammospheres均无影响（图1B和1C）。同时，我们测量mRNA（图1F）和蛋白质（图S1A）表达细胞多能性关键调节剂c-myc，SOX2，OCT 3/4和NANOG的情况。TAp53和∆40p53（SH2）沉默导致OCT3/4，NANOG和SOX2的表达增加，但不包括C-MYC，而所有p53同种型（Sh1时）消耗对它们并没有影响。此外，TAp53和∆40p53（SH2）的耗竭会增加∆133亚型（图1G）的表达。

这些结果表明，MCF-7细胞的CSC潜力不仅仅由先前被确定为干性抑制调节剂的TAp53α调节。为了研究这个假设，我们使用两种不同的shRNA（SH3和4）耗尽所有D133亚型。两种shRNA，不管是单独使用还是组合使用，均使MCF-7细胞显著减少形成mammospheres，结果表明这些同种型是上述CSC潜能（图1B和1D）的关键调节剂。因此，OCT3/ 4，NANOG和SOX2分别显著在∆133亚型沉默的细胞中（图S1A）下调。C-MYC

的再次表达对它们也没有影响。然后我们评估β和α同种型沉默对细胞的影响：在β亚型敲除的细胞中形成的mammospheres显著减少。（sh5，图1B），沉默全部α同种型（SH6）不影响mammospheres的形成（sh6;图S1B和S1C）。总之，这些发现表明，∆133p53（α，β和γ）同种型参与了在MCF-7细胞中调节CSC的潜力。

∆133p53β亚型在MCF-7细胞中促进CSC潜力

实际上，在MCF-7细胞中伴随由于SH2和SH6的转导仅表达∆133p53β和∆133p53γ亚

型使形成mammospheres被显著提高（图2A和2B）。为了证实这一sphere增长是由CSC 表型控制的，我们分析了CD44+/CD24-细胞的比例，因为这种癌细胞的亚群被认为具有CSC 性质。和形成mammospheres的变化相似，CD44 +/CD24-细胞的比例并不受由于Sh2的沉默时TAp53和∆40p53亚型的影响，然而当sh2和sh6共同转导时它却增加了（图2C）。

要确定∆133p53亚型（β和γ）在促进形成mammospheres的具体作用，我们分别使他们过表达。与之前的结果一致，∆133p53β过表达显著促进mammospheres的形成，而γ亚