CRISPR-Cas9体系实验流程 (2)

一、材料试剂准备

1）质粒：

pSpCas9(BB)-2A-GFP (Addgene plasmid ID: 48138)，用于转染cas9，该质粒含有Cas9与GFP，Cas9的nickase活性将用于特定目的基因的ko，GFP可做为转染标签。

pSpCas9(BB) (Addgene plasmid ID: 42230)，若实验用sgRNA为PCR扩增纯化产物，则需要该质粒做为U6的模版。

pUC19(Invitrogen, cat.no.15364-011)可用于构建sgRNA，若用PCR产物进行转染，则需要该质粒来进行共转染，做为DNA carrier。

上述三种质粒，根据实验选择sgRNA的表达方式（PCR产物/ 单载体系统/ 双载体系统）来确定具体使用哪种。

2）超纯水，DNase/RNase-free (Life Technologies, cat. no. 10977-023)

3）高保真聚合酶，Kapa HiFi (Kapa Biosystems), PfuUltra (Agilen)，Herculase II fusion polymerase 均可，只需保真效果好，扩增过程不产生突变。

4）Taq DNA polymerase with standard Taq buffer (NEB, cat. no. M0273S)用于一般检测。

5）QIAquick gel extraction kit (Qiagen, cat. no. 28704)

6）QIAprep spin miniprep kit (Qiagen, cat. no. 27106)

7）Fast Digest BbsI (BpiI) (Fermentas/Thermo Scientific, cat. no. FD1014)，如需要将sgRNA构建到pSpCas9(BB)-2A-GFP质粒上，则需要该酶。

8）T7 DNA ligase with 2× rapid ligation buffer (Enzymatics, cat. no. L602L). 或者T4 DNA ligase，二者无区别。

9）Stbl3 chemically competent E. coli (Life Technologies, cat. no. C7373-03)

10）dNTP solution mix, 25 mM each (Enzymatics, cat. no. N205L)

11）MgCl2, 25 mM (Thermo Scientific, cat. no. R0971)

12）T4 polynucleotide kinase (New England BioLabs, cat. no. M0201S)

13）Plasmid Safe ATP-dependent DNase (Epicentre, cat. no. E3101K)

14）Adenosine 5′-triphosphate, 10 mM (New England BioLabs, cat. no. P0756S) 15）SOC medium (New England BioLabs, cat. no. B9020S)

二、实验流程

1）确定target site。根据CRISPR在线设计工具/设计sgRNA，（还有其他设计工具，推荐该软件）。将目的基因250bp以内的核苷酸序列输入，避免内含子，约10min将会给出备选的target site。

或者人工手动选择，在目的区域5′-NGG（即PAM）上游20bp片段均可做为target site，一般target site可选在正义链或者反义链，二者均可。

2) 准备sgRNA表达体系。三种方案可选：a, 直接使用PCR扩增纯化产物，该产物片段含有U6+sgRNA，约370bp；b, 将sgRNA载体构建到

pSpCas9(BB)-2A-GFPpUC19质粒当中，即单载体系统；c, sgRNA载体构建到构

建到pUC19当中，成为双载体系统。

a．PCR扩增sgRNA表达结构。

PCR体系如下：

U6-Fwd: GAGGGCCTATTTCCCATGATTCC

U6-Rev:AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAA CGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAA c NNNNNNNNN NNNNNNNNNNCCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG(N即与target site反向互补配对的片段)

其中聚合酶也可以使用pfu或者Kapa Hifi代替，高保真聚合酶即可，U6模版推荐使用pSpCas9(BB)。

PCR反应条件如下：

该程序固定，不推荐更改。

PCR结束后，2%琼脂糖凝胶电泳验证，5ul PCR产物，15 V cm–1，30分。条带位置为370bp。

PCR产物用QIAquick PCR purification kit纯化，依照试剂盒说明，最终取35ul EB buffer，或者水进行回收。。

b. 构建sgRNA载体—单载体系统（pSpCas9(BB)-2A-GFP）。

首先，按照前述方法target site确定，根据target site设计需插入的sgRNA Oligo。

一般来说，sgRNA oligo的形式如下：

sgRNA top: CACCgNNNNNNNNNNNNNNNNNNN

sgRNA bottom: AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNc

两条设计好的oligo需经磷酸化，退火成双链，其体系如下：

程序如下：37 °C 30 min; 95 °C 5 min; 每分钟降5 °C 至25 °C。

结束后按照1：200加水稀释（1ul oligo+199 H2O）

其次，将合成好的sgRNA oligo插入到目的载体中，本实验将使用pSpCas9(BB)-2A-GFP。其连接反应体系如下：