2015版《中国药典》微生物检验实施指导培训班
2015版中国药典微生物检验
• 注：方法选择原则：根据供试品理化特性和微生物限度 标准等因素选择。
培养基适用性检查
• 胰酪大豆胨琼脂：金黄色葡萄球菌、 枯草芽孢杆菌、铜 绿假单胞菌、白色 念珠菌、黑曲霉 • 胰酪大豆胨肉汤：金黄色葡萄球菌、 铜绿假单胞菌、枯草 芽孢杆菌 • 沙氏葡萄糖琼脂、玫瑰红钠琼脂 、白色念珠菌、黑曲霉。
中国药典2015年版相关培养基变化无菌检查法通则1101chp2010chp2015硫乙醇酸盐流体培养基硫乙醇酸盐流体培养基改良马丁培养基胰酪大豆胨液体培养基tsb营养肉汤培养基胰酪大豆胨琼脂培养基tsa营养琼脂培养基沙氏葡萄糖液体培养基sdb改良马丁琼脂培养基沙氏葡萄糖琼脂培养基sda培养基的适用性检查灵敏度检查无菌性检查中国药典2015年版相关培养基变化无菌检查法通则1101chp2010chp2015硫乙醇酸盐流体培养基硫乙醇酸盐流体培养基改良马丁培养基胰酪大豆胨液体培养基tsb营养肉汤培养基胰酪大豆胨琼脂培养基tsa营养琼脂培养基沙氏葡萄糖液体培养基sdb改良马丁琼脂培养基沙氏葡萄糖琼脂培养基sda培养基的适用性检查灵敏度检查无菌性检查非无菌产品微生物限度检查
菌数报告规则
• 2、薄膜过滤法：计数方法同平皿计数法，每 张滤膜上的菌落数应不超过100cfu。菌数报告 规则以相当于 1g、1ml或10cm供试品的菌落数 报告菌数；若滤膜上无菌落生长，以﹤1报告 菌数（每张滤膜过滤1g、1ml或10cm 供试品 ），或﹤1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。 • 3、MPN法：记录每一稀释级微生物生长的管 数，从表3查对每1g或1ml供试品中需氧菌总数 的最可能数。
培养条件
• 描述方式：按计数方法适用性试验确认计 数方法进行供试品中需氧菌总数、霉菌和 酵母菌总数测定。 • 培养条件：胰酪大豆胨琼脂平板在30～ 35℃培养3-5天，沙氏葡萄糖琼脂平板在20 ～25℃培养5~7天；MPN法和供试品接种， 所有试验管在30～35℃培养3～5天。
2015版中国药典微生物限度解析
（MPN法） 1.3 计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用
性试验：菌种及菌液制备、培养基适用性检查 、计数方法适用性试验。 1.4 供试品检查：检验量、供试品检查 1.5 结果判断 1.6 稀释液、冲洗液及培养基
1.1 总则：
• 微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温 细菌和真菌的计数。
• 当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否 符合规定的微生物限度标准时，应按规定进行检 验，包括样品的取样量和结果的判断等。除另有 规定外，本法不适用于活菌制剂的检查。
30～35 ℃ 不超过3天
20～25 ℃ 不超过5天
每一试验菌株平行制备2 管或2 个平皿；接种量50~100cfu ； 同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。 结果判定：
若被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落 平均数的70 %，且菌落形态大小与对照培养基上的菌 落一致，判该培养基的适用性检查符合规定。
1.3 计数培养基适用性检查和供试品计 数方法适用性试验
• 供试品微生物计数中所使用的培养基应进 行适用性检查。
• 供试品的微生物计数方法应进行方法适用 性试验【10版：方法验证】， 以确认所 采用的方法适合于该产品的微生物计数。
• 若检验程序或产品发生变化可能影响检验 结果时， 计数方法应重新进行适用性试 验。
1.3.3计数方法适用性试验
1. 供试液制备 2. 接种和稀释 3. 抗菌活性的去除与灭活 4. 供试品中微生物的回收
– 平皿法 – 薄膜过滤法 – 最可能数法（MPN 法）
5. 结果判断
1.4 供试品检查
• 1.4.1检验量
– 检验量即一次试验所用的供试品量（g、ml
《中国药典》2015年版三部凡例培训
LOGO
半成品配制后直接分装至终容器时，如采用不同分装机进行分装，应按
分装机划分不同批或亚批； 半成品配制后经同一台分装机分装至终容器，采用不同冻干机进行冻干， 应按冻干机划分不同亚批。 非同日或同次配制、混合、稀释、过滤、灌装的半成品不得作为一批。 同一制品的批号不得重复；同一制品不同规格不应采用同一批号。
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冻干要求
分装பைடு நூலகம்冻干 标识和记录
抽样、检定
生物制品包装规程
• 标签的要求
药品的标签是指药品包装上印有或者贴有 的内容，分为内标签和外标签。药品内标 签指直接接触药品的包装的标签，外标签 指内标签以外的其他包装的标签。
1、应符合国家法规要求； 2、文字表述应以药品监管理部门批准的为依据，不得超出说明书内容， 不得加入无关的文字和图案； 3、内包装标签和外包装标签的内容、格式应符合法规要求。
批：指在同一生产周期中，用同一批原料、同一方法生产所得的一定数量、均 一的一批制品。
凡例内容（一）
总则
正文（各论）
精确度
凡例
通则
基本要求
名称及编排
凡例内容（二）
生物制品术语与名称解释
检定方法与限度
常用英文名称 缩写与注释
凡例
计量
包装、标签、使用说明、 贮藏、运输
标准品、参考品、对照品
精确度
称重或量取的量，其精确度可根据数值的有效数 位来确定，如：
试验用水：
除另有规定外，系指纯化水；酸碱度检查用的水，均系指新煮沸并 放冷至室温的水。
试验时的温度：
未注明者，系指在室温下进行；如温度高低对试验结果有显著影响者， 除另有规定外，应以25±2℃为准。 酸碱性试验，如未指明用何种指示剂，均系指石蕊试纸。
微生物限度检查操作规程(中国药典2015版四部通则)
霉菌与酵母菌总数、控制菌得检查。
二、引用标准：《中国药典》２015年版（通则1１05-1106）三、目录1。
微生物限度标准2.设备、仪器及用具3。
消毒液、稀释剂、试液及培养基4。
检查总则(通则1105：非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法,通则1106非无菌产品微生物限度检查:控制菌检查法）5。
微生物计数法检查6.控制菌检查法7．实验技术8、附件１.微生物限度标准非无菌药用原料及辅料得微生物限度标准(2)．目测霉变者以不合格论。
（３）。
“无”为标准依据或无相应规定。
准依据或无相应规定.2.设施、仪器及用具2、１、设施：2、１、1．微生物限度检查室及相关设施：微生物计数试验环境应符合微生物限度检查得要求。
检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染得措施不得影响供试品中微生物得检出。
单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。
２、1、2．其她设备:高压蒸汽灭菌器;细菌培养箱(3０~3５℃);霉菌培养箱(２5～2８℃)；电炉(或其她适宜得加热装置）；恒温水浴；电热干燥箱(250~３00℃)；电冰箱。
生化试剂储存箱。
2、2仪器及器皿2、2、1。
菌落计数器；显微镜（15０0X）;电子天平或药物天平（感量0、1ｇ）;ｐH 系列比色计。
2、2、2．玻璃器皿：锥形瓶(2５０~３００ml,内装玻璃珠若干)、研钵（玻璃或陶瓷制,∮10～12ｃm)、培养皿（∮9 ｃm）、量筒(１00ml）、试管（1８×180ｍm）及塞、吸管（1ml分度0、01，10ml分度0、１)、载玻片、盖玻片、玻璃消毒缸（带盖）。
2、2、3新购得玻璃器皿得清洁:先用流水冲洗，浸泡于1％~２%盐酸（工业用）液中约2～6小时，除去游离碱质，再用流水冲洗.用于化学分析得玻璃仪器,需用重铬酸钾清洁液浸泡数分钟后，再用流水冲洗，最后以纯化水涮洗2～3次，晾干备用。
2、3用过得玻璃器皿：2、3、1未被病原微生物污染得器皿：可随时洗涤.用清水冲洗(或浸泡)，除容量仪器外，可用毛刷与肥皂粉，内外刷洗，再用清水涮洗干净,晾干备用.容量仪器宜用清洁液浸泡或涮洗，再用流水冲洗,最后以纯化水涮洗2～3次.试管及培养皿:先正放或直立于高压蒸汽灭菌器内,经1２1℃灭菌30 分钟.趁热倾出培养物，再以清水或用毛刷及肥皂粉刷洗,最后以流水涮净。
微生物限度检查操作规程(中国药典2015版四部通则)
菌总数、控制菌的检查。
二、引用标准：《中国药典》2015年版(通则1105-1106)非(2)．目测霉变者以不合格论。
单）、分度小时，除再用刷和肥皂粉，内外刷洗，再用清水涮洗干净，晾干备用。
容量仪器宜用清洁液浸泡或涮洗，再用流试管及培养皿：先正放或直立于高压蒸汽灭菌器内，经121℃灭菌30 分钟。
趁热倾出培养物，再以清水或用毛刷及肥皂粉刷洗，最后以流水涮净。
吸管：全部直立浸没于清洁液的长筒形容器中，筒底应衬有棉或橡皮垫，以防管尖损坏。
24小时后，逐支用流水反复冲洗洁净，晾干后包扎灭菌备用。
载、盖玻片：应分别浸泡于清洁液12~24小时后，取出用流水冲洗，再放入3%~5%肥皂水或5%碳酸钠液内煮沸10~15 分钟，待自然冷却后，再用流水冲洗。
沥干后置95%乙醇中浸泡，晾干备用。
2，3，3玻璃器皿用前应洗涤干净，无残留抗菌物质。
吸管口上端距0.5 cm处塞入约2cm的适宜疏松棉花，置吸管桶内或牛皮纸袋中。
锥形瓶、量筒、试管均应加棉塞或硅胶塞，若用振荡器制备混悬液时，尚需用玻璃纸包裹瓶塞（以免振荡时供试液污染瓶塞），再用牛皮纸包扎。
玻璃器皿，均于160℃干热灭菌2小时或高压蒸汽121℃灭菌30 分钟，烘干备用。
2.4用具2.4.1大、小橡皮乳头（放于干净带盖的容器中，并应定期用70%~75%乙醇溶液浸泡）。
2.4.2无菌衣、帽、口罩、手套（洗净后配套，用牛皮纸包严）灭菌，备用。
也可用一次性无菌衣、帽、口罩、手套。
2.4.3接种环（白铱金或镍铬合金，环径4~5mm、长度6~10cm）、乙醇灯、乙醇棉球或碘伏棉球、。
500ml。
100ml；。
变色3.1.11．亚甲蓝指示液：取亚甲蓝0.5g，加水使溶解成100ml。
3.1.12．溴麝香草酚蓝指示液：取溴麝香草酚蓝0.4g，加1mol/L氢氧化钠溶液0.64ml使溶解，再加水至100ml。
变色范围 pH6.0~7.6（黄→蓝）。
3.1.13．酸性品红指示液：以酸性品红0.5g，加水100ml使溶解，再逐渐加1mol/L氢氧化钠溶液16ml，每加1滴均应将溶液充分摇匀后再加第二滴，直至溶液呈草黄色；于沸水内保持15分钟，再静置2小时，滤过，即得。
2015版中国药典微生物限度培训-2014
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培养基
环境浮游菌、沉降菌及表面微生物监测用培养基一般采用胰酪大豆 胨琼脂培养基（TSA） 当监测结果有疑似真菌或考虑季节因素影响时，可增加沙氏葡萄糖 琼脂培养基(SDA)。
28
请根据报告内容更新
培养条件GBT 16293-2010 医工业洁净室（区）浮游菌的测试方法
USP1116 无菌工艺环境的微生物控制与监测
41
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四、培养基体系
最突出的变化：微生物质控分类及培养基体系 2010版 分类依据 项目1 项目2 按微生物类别分 细菌数 营养琼脂 霉菌及酵母菌数 玫瑰红钠琼脂 2015版 按营养条件分 需氧菌总数 胰酪大豆胨琼脂（TSA） 霉菌及酵母菌总数 沙氏葡萄糖琼脂（SDA）
12
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尘埃粒子监测
监测方法：参照GB/T 16292-2010 《医药工业洁净室（区）悬浮粒 子的测试方法》 监测设备：
空气尘埃粒子计数器，多为光散射粒子计数器
工作原理： 当取样气流中的尘埃颗粒通过计数器散射腔的光敏感区时，光 遇到粒子时发生散射，这些光脉冲信号经光电二极管转换成电脉冲 信号，电脉冲次数反映粒子数，脉冲幅值反映粒子的粒径。 一台仪器可同时测定多个粒径通道的粒子。
采样点
不得少于2个
14
请根据报告内容更新
采样量
15
请根据报告内容更新
尘埃粒子标准
16
请根据报告内容更新
容易被忽略的UCL值：
UCL的计算：平均值均值的95%置信上限，微粒每立方米 （粒/m3）
2015版中国药典微生物限度
1.4.2供试品检查
• 供试液制备
– ⑵ 水不溶性非油脂类供试品
• 取供试品， 用 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨 缓冲液，或 pH7.2 磷酸盐缓冲液，或胰酪 大豆胨液体培养基制备成 1:10 供试液。 分散力较差的供试品，可在稀释液中加入 表面活性剂如 0.1%的聚山梨酯 80，使供 试品分散均匀。若需要，调节供试液 pH 值至 6～8。必要时，用同一稀释液将供 试液进一步 10倍系列稀释。
1.3.3计数方法适用性试验
1. 供试液制备 2. 接种和稀释 3. 抗菌活性的去除与灭活 4. 供试品中微生物的回收
– 平皿法 – 薄膜过滤法 – 最可能数法（MPN 法）
5. 结果判断
1.4 供试品检查
• 1.4.1检验量
– 检验量即一次试验所用的供试品量（g、ml
或cm²）。
– 除另有规定外,一般供试品的检验量为10g 或
• 需氧菌总数是指胰酪大豆胨琼脂培养基上生长的 总菌落数（包括真菌菌落数）；
• 霉菌和酵母菌总数是指沙氏葡萄糖琼脂培养基上 生长的总菌落数（包括细菌菌落数）。
• 若因沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的细菌使霉菌 和酵母菌的计数结果不符合微生物限度要求，可 使用含抗生素（如氯霉素、庆大霉素）的沙氏葡 萄糖琼脂培养基或其他选择性培养基（如玫瑰红 钠琼脂培养基）进行霉菌和酵母菌总数测定。
1.4.2供试品检查
• 供试液制备
– ⑷需用特殊方法制备供试液的供试品
• 膜剂供试品 • 肠溶及结肠溶制剂供试品 • 气雾剂、喷雾剂供试品 • 贴膏剂供试品
1.4.2供试品检查
1. 平皿法
– 平皿法包括倾注法和涂布法。 – 除另有规定外，取规定量供试品，按方法适用性
试验确认的方法进行供试液制备和菌数测定，每 稀释级每种培养基至少制备2个平皿。 – 培养和计数 除另有规定外，胰酪大豆胨琼脂培养 基平板在30～35℃培养3~5天，沙氏葡萄糖琼脂 培养基平板在20～25℃培养5 ~7天， 观察菌落 生长情况,点计平板上生长的所有菌落数，必要时 可适当延长培养时间至7 天进行菌落计数并报告 。菌落蔓延生长成片的平皿不宜计数。点计菌落 数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌 数报告规则报告菌数。 – 若同稀释级两个平皿的菌落数平均值不小于15， 则两个平皿的菌落数不能相差1 倍或以上。
射干合剂2015年版《中华人民共和国药典》微生物检查方法适用性研究
射干合剂2015年版《中华人民共和国药典》微生物检查方法适用性研究目的建立符合2015年版《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）要求的射干合剂的微生物限度检查方法。
方法采用2015年版《中国药典》方法对射干合剂进行微生物限度检查方法学验证。
薄膜过滤法进行样品前处理，使用6种菌株分别进行微生物计数检查和限度菌检查的方法适用性研究。
结果微生物计数检查的5种菌株的回收比值均在0.5～2之间，控制菌检查的大肠埃希菌检出合格。
结论射干合剂的微生物限度检查方法经验证符合2015年版《中国药典》要求。
Abstract：Objective To standardize the method of microbiological examination on Shegan Mixture in Chinese Pharmacopoeia 2015. Methods Chinese Pharmacopoeia 2015 was used. Microbial enumeration test and specified microorganisms test were used to verify Shegan Mixture. The samples were treated by membrane filtration. Six kinds of strains for microbiological counting and limiting bacteria were used to study applicability. Results Microbial counts of the five strains of the recovery ratio were between 0.5 to 2，and Escherichia coli tested by control bacteria was qualified. Conclusion The microbiological examination methods for Shegan Mixture can meet the requirements of Chinese Pharmacopoeia 2015.Key words：Shegan Mixture；microbial enumeration test；specified microorganisms test；membrane filtration method；Chinese Pharmacopoeia 2015射干合劑为本院临床应用多年的医院制剂，是著名儿科名家时毓民的经验方，由麻黄（炙）、射干、黄芩、前胡、苦杏仁、僵蚕、蔊菜、蝉蜕、百部（炙）等组成，具有宣肺清热、止咳祛痰平喘的功效，常用于治疗感冒咳嗽、急性支气管炎及哮喘性支气管炎引起的咳嗽、多痰等症状。
2015年版微生物限度检验操作规程.
青岛**有限公司文件目的建立微生物限度检查操作规程，规范操作，保证结果的准确性。
范围成品、辅料、内包装袋及纯化水的检验。
责任品管部微生物限度检验人员内容概述：本检验操作规程依据中国药典2015年版四部《通则1105 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法》和《通则1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法》进行检查。
微生物计数法一、计数方法1．微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。
2、计数方法本法包括平皿法、薄膜过滤法。
3、计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性检查供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查。
供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确定采用的方法适合于该产品的微生物计数。
4、菌种及菌液的制备4.1试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0袋），并采用适宜的菌种保藏技术进行保藏。
计数培养基适用性检查和计数方法适用性试验见表1。
4.2菌液制备按表1规定培养各试验菌株。
取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的新鲜培养物，用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液；取黑曲霉的新鲜培养物加入3-5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。
采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管中，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液。
菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2-8℃，可在24小时内使用。
黑曲霉孢子悬液可保存在2-8℃，在验证过的贮存期内使用。
表1 试验菌液的制备和使用4.3阴性对照为确认试验条件是否符合要求，应进行对照试验，阴性对照试验应无菌生长。
4.4培养基适用性检查按照表1规定，接种不大于100cfu的菌液至胰酪大豆胨液体培养基或胰酪大豆胨琼脂培养基平板或沙氏葡萄糖琼脂培养基平板，置规定的条件下培养。
《中国药典》2015年版微生物测定修订情况
常州药检
一、微生物计数法
分别接种不大于100cfu的铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球 菌、枯草芽孢杆菌菌液至胰酪大豆胨琼脂培养基平 板，每一试验菌株平行制备2个平皿，30～35℃培养 不超过3天。同时，用相应的对照培养基代替被检培 养基进行上述试验。 分别接种不大于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉菌液至 胰酪大豆胨琼脂培养基平板，每一试验菌株平行制备 2个平皿，30～35℃培养不超过5天。同时，用相应 的对照培养基代替被检培养基进行上述试验。
常州药检
一、微生物计数法 计数培养基适用性检查
菌种：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽 孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉，不得超过5代。
常州药检
一、微生物计数法
常州药检
一、微生物计数法
常州药检
一、微生物计数法
取其新鲜培养物用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或 0.9无菌氯化钠溶液制成适宜浓度菌悬液。黑曲霉制 备时在缓冲液或氯化钠溶液中加入0.05%（v/v）聚山 梨酯80。 菌液在室温下2小时内使用，2～8℃时可在24h内使用， 黑曲霉孢子悬液可2～8℃保存，在验证过的贮存期内 使用。
MPN法
常州药检
一、微生物计数法
平皿法：包括倾注法和涂布法。每株菌每种培养基 至少制备2个平皿，以算术平均值计算。使用涂布 法应采用适宜的方法使培养基表面干燥，且每个 平皿接种的供试液不少于0.1ml。
常州药检
一、微生物计数法
薄膜过滤法：一般取相当于1g（ml、10cm2）的供试 品，（若供试品中所含的菌数较多时，供试液可 酌情减量）加至适量稀释液中，混匀，过滤。用 适量冲洗液冲洗。 每株菌每种培养基至少制备一张滤膜。 同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。
常州药检
中国药典2015版-微生物限度检查解析
*
*
注*：限度未做统一规定。
控制菌
*
不得检出沙门菌 （10g） ； 耐胆盐革兰阴性菌应小 于104（1 g）
执行及制定标准的注意事项
执行范围： 生产、贮存、销售过程中的药品 药用原料、辅料 中药提取物、中药饮片 新药标准 进口药品标准复核 药品质量考察及仲裁
标准执行的注意事项： 药典标准出处：中国药典通则项下【微生
或菌株已无使用需要时应及时灭菌销毁”； • 管理：应有程序文件，包括申购、操作、转种传代、纯度特性确认记录，注明名称、标准号、
接种日期、代数、培养基和培养条件、保藏的位置和条件等。
环境
• 实验室的布局和运行 • 环境监测 • 清洁、消毒和卫生
设备
建立仪器设备管理制度 清洁保养制度 操作规程 使用、监控的记录
器、天平、量器等等） 3.供应商评估与现场审计 使用正确的、有严格质量保障的产品
《中国药典》2015年版-微生物限度标准修订解析
标准修订内容 修订思路1 《中国药典》2010年版一、二、三部限度标准的相关内容合并。 修订思路2 参考EP7.0，USP35，JP X V标准，修订中国药典的微生物限度标准。
胆盐革兰阴性菌应小102
不含豆豉、神曲等发酵 5×102 原粉
102
液体口服给药
制剂
含豆豉、神曲等
发酵原粉
103
102
不得检出大肠艾希菌 不得检出沙门菌
耐胆盐革兰阴性菌应小 于 101
固体局部给药 表皮或粘膜不完整
104
102
不得检出金黄色葡萄球
制剂
菌、
表皮或粘膜完整
103
102
铜绿假单胞菌 ；阴道、
药品微生物检验的现状与发展
微生物限度检测方法验证操作规程(2015年版)
微生物限度检测方法验证操作规程1 目的确认所采用的方法适合于该产品的微生物限度检测。
2 依据《中国药典》2015版。
3 范围所有需进行微生物限度检测的产品。
4 责任4.1验证小组负责检验方法验证/确认方案的起草、验证/确认方案的实施。
4.2验证委员会负责验证/确认方案的审批，验证/确认结论的审核。
5 程序5.1 由验证小组提出验证申请，验证方案编制完成后，填写《确认和验证方案审批表》，经验证小组会签，报验证委员会审核，由生产负责人和质量负责人批准后，验证方案编制人对验证小组其余人员进行培训后，方可按验证方案试验。
5.2 试验完成后及时编制验证报告，并填写《验证报告审批表》，经验证小组会签，报验证委员会审核，由生产负责人和质量负责人批准后，验证报告结论才可实施。
6 内容6.1 概述通过验证以确认所采用的方法适合于该产品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定及控制菌的检查。
根据样品特性制订检验方法和检验条件，按制定的方案进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。
若符合，按验证的方法和条件进行产品的微生物限度检查；若不符合，重新建立制订检验方法和检验条件，再进行验证，直至验证结果符合设立的验证标准。
6.2 需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法的验证6.2.1 验证用菌株铜绿假单胞菌[CMCC（B）10 104]金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63 501]黑曲霉[CMCC（F）98 003]白色念珠菌[CMCC（F）98 001]6.2.2 验证用菌液制备6.2.2.1接种铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌与枯草芽孢杆菌至胰酪大豆胨液体培养基中，于30～35℃培养18～24小时。
取上述培养物各1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的菌悬液，备用。
6.2.2.2 接种白色念珠菌至沙氏葡萄糖液体培养基中，于20～25℃培养2～3天。
2015版中国药典微生物限度
1.4.2供试品检查
• 供试液制备
– ⑶油脂类供试品
• 取供试品，加入无菌十四烷酸异丙酯使溶 解，或与最少量并能使供试品乳化的无菌 聚山梨酯 80或其他无抑菌性的无菌表面 活性剂充分混匀。表面活性剂的温度一般 不超过 40℃（特殊情况下，最多不超过 45℃），小心混合，若需要可在水浴中进 行，然后加入预热的稀释液使成 1∶10供 试液，保温，混合，并在最短时间内形成 乳状液。必要时，用稀释液或含上述表面 活性剂的稀释液进一步 10倍系列稀释。
– 培养和计数 培养条件和计数方法同平皿计数 法，每张滤膜上的菌落数应不超过100cfu。
• 菌数报告规则
– 以相当于 1g、1ml 或10cm2 供试品的菌落数 报告菌数；若滤膜上无菌落生长，以﹤1 报 告菌数（每张滤膜过滤1g、1ml 或10cm2 供 试品）,或﹤1 乘以最低稀释倍数的值报告菌 数。
1.4.2供试品检查
• 供试液制备
– ⑷需用特殊方法制备供试液的供试品
• 膜剂供试品 • 肠溶及结肠溶制剂供试品 • 气雾剂、喷雾剂供试品 • 贴膏剂供试品
1.4.2供试品检查
1. 平皿法
– 平皿法包括倾注法和涂布法。 – 除另有规定外，取规定量供试品，按方法适用性
试验确认的方法进行供试液制备和菌数测定，每 稀释级每种培养基至少制备2个平皿。 – 培养和计数 除另有规定外，胰酪大豆胨琼脂培养 基平板在30～35℃培养3~5天，沙氏葡萄糖琼脂 培养基平板在20～25℃培养5 ~7天， 观察菌落 生长情况,点计平板上生长的所有菌落数，必要时 可适当延长培养时间至7 天进行菌落计数并报告 。菌落蔓延生长成片的平皿不宜计数。点计菌落 数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌 数报告规则报告菌数。 – 若同稀释级两个平皿的菌落数平均值不小于15， 则两个平皿的菌落数不能相差1 倍或以上。
微生物限度检验操作规程
1目的规范微生物限度检验操作，确保检验结果准确、可靠。
2依据《中国药典》2015版。
3范围本标准适用于微生物限度检验。
4责任中心化验室负责人：对本规程的实施负责。
中心化验室检验人员：严格按照本规程执行检验操作。
5程序5.1执行标准：《中国药典》2015版。
5.2抽样：照《取样标准操作规程》进行。
6内容6.1需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数计数方法包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法（MPN法）。
检查时，按已验证的计数方法进行供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定。
6.1.1设备、仪器及用具6.1.1.1设备微生物限度检测室、净化工作台、生化培养箱（30〜35£）、生化培养箱（20〜25£）、电热恒温水浴锅、烘箱、脉动真空灭菌柜、紫外灯等。
6.1.1.2仪器及器皿显微镜、托盘天平、锥形瓶、研钵、培养皿、量筒、试管及塞、移液枪及吸头、薄膜过滤器等。
6.1.1.3用具大、小橡皮乳头，洁净工作服、口罩、医用手套、接种环、酒精灯、酒精棉球、灭菌剪刀、灭菌镊子、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、薄膜过滤膜等。
6.1.2试液6.1.2.1消毒液A.0.1%新洁尔灭溶液B.75%乙醇溶液6.1.2.2稀释液、试剂及配制A. pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液：取磷酸二氢钾3.56g、无水磷酸氢二钠5.77g、氯化钠4.3g、蛋白胨1.0g,加纯化水1000ml，微温溶解，滤清，分装，1210C灭菌15分钟。
B.聚山梨酯80C.无菌十四烷酸异丙酯D. pH6.8无菌磷酸盐缓冲液6.1.3培养基胰酪大豆胨琼脂培养基、胰酪大豆胨液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基6.1.4操作方法6.1.4.1试验前准备6.1.4.1.1将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、试管、移液枪吸头（1ml、10ml）、量筒、稀释液、培养基等移至传递窗内。
每次试验所用物品必须事先计划，准备足够用量，避免操作中出入操作间。
6.1.4.1.2开启微生物检测室紫外灯和空调净化系统，并使其工作不低于30min。
2015版中国药典关于微生物检验有关变化的解读
黑龙江省食品药品检验检测所
杨利红
目
录
1 2
3
概况及背景 标准修订内容
执行及制定标准的注意事项
4 5
标准与方法 国外药典的标准收载情况
一、概况及背景
参照欧、美药典中“微生物限度”相关内容的组织形 式，将原“微生物限度检查法”修订后拆分为3个附录， 并在药典会网站上公示： -1、非无菌产品微生物检查：微生物计数法（一、二、 三部相同） -2、非无菌产品微生物检查：控制菌检查法（一、二、 三部相同） -3、药品微生物限度标准（一部；二部同三部）
在2005版chp收载微生物限度标准的基 础上，眼用制剂修订为无菌要求；阴 道、尿道给药制剂增加白色念珠菌 的控制；增加了贴膏剂的控制菌检查。
二、标准修订内容
1、药典标准的修订思路 （1）三部药典的合并 现行2010版《中国药典》三部分在微生物限度标准有 重叠，一部多于二部、三部。
一部标准为 基础
二、标准修订内容
非无菌药用原料及辅料微生物限度标准中药提取物及中药饮片微生物限度标准
制剂类型
TAMC
TYMC
控制菌
药用原料及辅料
103
102
未统一要求
中药提取物
103
102
未统一要求
中药饮片
未统一要 未统一要 求 求
不得检出沙门菌(10g)，耐胆盐 的阴性菌应小于104(1g)
二、标准修订内容
（4）实验环境的重大修订 ①无菌检查环境洁净度规定 GMP2010年版对洁净度的规定及确认标准 无菌检查： 2010年版：应在洁净度10000级背景下的局部100级单向流 空气区域内或隔离系统中进行。 2015年版：应在洁净度B级背景下的局部A级单向流空气区 域内或隔离系统中进行。 ②微生物限度检查环境洁净度规定 微生物限度检查： 2010年版：应在洁净度10000级背景下的局部100级单向流 空气区域内进行。 2015年版：应在受控洁净环境下（不低于D级）的局部不 低于B级单向流空气区域内进行。
2015年版中国药典微生物限度检查法
1.1 总则：
• 环境： – 微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要 求。(在不低于GMP 现行版要求的D 级洁净环境 、局部洁净度不低于B 级的单向流空气区域内进 行)【10版：在环境洁净度10000级下的局部洁净 度100级的单向流空气区域内】。 – 检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染 ，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检 出。 – 单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监 测。
菌数报告规则
– 需氧菌总数测定宜选取平均菌落数小于 300cfu 的稀释级、霉菌和酵母菌总数测定宜 选取平均菌落数小于100cfu 的稀释级，作为 菌数报告（取两位有效数字）的依据。取最 高的平均菌落数，计算1g、1ml 或10 cm² 供 试品中所含的微生物数。 – 如各稀释级的平皿均无菌落生长，或仅最低 稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小 于1 时，以﹤1 乘以最低稀释倍数的值报告菌 数。
1.4.2供试品检查
• 供试液制备 – ⑴ 水溶性供试品
• 取供试品，用 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨 缓冲液，或pH7.2 磷酸盐缓冲液，或胰酪 大豆胨液体培养基溶解或稀释制成 1:10 供试液。若需要，调节供试液 pH 值至 6 ～8。必要时，用同一稀释液将供试液进 一步 10倍系列稀释。水溶性液体制剂也 可用混合的供试品原液作为供试液。
1.3.1菌液制备及使用
试验菌株 试验菌液的制备
金黄色葡萄球菌 〔CMCC(B) 26 003)〕
铜绿假单胞菌 〔CMCC（B)10 104〕 枯草芽孢杆菌 〔CMCC(B) 63 501〕 白色念珠菌 〔CMCC(F) 98 001〕
胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培 养基 【10版：营养肉汤或营养琼脂培养基】 30～35℃，18～24小时
微生物限度检查操作规程(中国药典2015版四部通则)
一、范围：本标准规定了微生物限度的检查方法和操作要求；适用于检品需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、控制菌的检查。
二、引用标准：《中国药典》2015年版(通则1105-1106)三、目录1．微生物限度标准2．设备、仪器及用具3．消毒液、稀释剂、试液及培养基4．检查总则（通则1105：非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法，通则1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法）5．微生物计数法检查6．控制菌检查法7．实验技术8. 附件1．微生物限度标准非无菌药用原料及辅料的微生物限度标准*未做统一规定。
(1)．“—”为不得检出。
(2)．目测霉变者以不合格论。
说明：1．“—”为每100 cm中不得检出。
2．目测霉变者以不合格论。
3．“无”为标准依据或无相应规定。
2．设施、仪器及用具2.1、设施：2.1.1．微生物限度检查室及相关设施：微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求。
检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。
2.1.2．其他设备：高压蒸汽灭菌器；细菌培养箱（30~35℃）；霉菌培养箱（25~28℃）；电炉（或其他适宜的加热装置）；恒温水浴；电热干燥箱（250~300℃）；电冰箱。
生化试剂储存箱。
2.2仪器及器皿2.2.1．菌落计数器；显微镜（1500X）；电子天平或药物天平（感量0.1g）；pH系列比色计。
2.2.2．玻璃器皿：锥形瓶（250~300ml，内装玻璃珠若干）、研钵（玻璃或陶瓷制，∮10~12cm）、培养皿（∮9 cm）、量筒（100 ml）、试管（18×180mm）及塞、吸管（1ml分度0.01，10 ml分度0.1）、载玻片、盖玻片、玻璃消毒缸（带盖）。
2.2.3新购的玻璃器皿的清洁：先用流水冲洗，浸泡于1%~2%盐酸（工业用）液中约2~6小时，除去游离碱质，再用流水冲洗。
用于化学分析的玻璃仪器，需用重铬酸钾清洁液浸泡数分钟后，再用流水冲洗，最后以纯化水涮洗2~3次，晾干备用。
2015版中国药典微生物限度记录
培养基的储藏
琼脂培养基不得在 0 ℃ 或 0 ℃ 以下存放，防止冷冻破 坏凝胶特性。
琼脂培养基最好现用现配，如置冰箱保存，一般不 超过一周，且应密闭包装，若延长保存需经验证 确定。 培养基灭菌后应立即取出，不得储存在高压灭菌器 中。
培养基适用性试验
修订内容
控制菌检查用培养基数量减少 7个，在增菌过程中， 使用无选择性增菌培养基。
2.一次只可加0.1-0.2ml样品。
薄膜过滤法
1.孔径应不大于0.45微米。直径一般为50mm，若采用其他直 径的滤膜，冲洗量应进行相应的调整。 2.滤膜材质应保证供试品及其溶剂不影响微生物的充分被截 留。 滤器注意点 1.滤器及滤膜在使用前应采用适宜的方法灭菌。 2.使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。 3.水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以湿润滤膜。 4.油类供试品，其滤膜和滤器在使用前应充分干燥。 5.供试液经滤膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤 膜每次冲洗量为100ml，总冲洗量不得超过1000ml,以避免 滤膜上的微生物受损伤。
理由：
污染菌受到环境、加工过程及储存等影响，受到损 伤，使用无选择性增菌培养基培养，使受损伤的 细胞得到修复，提高检出 配制的培养基的适用性检查 促生长能力、抑制能力和指示特性 的检查。
实验菌株的管理使用及鉴定
菌种的保藏 低温、干燥、缺氧、缺乏营养等环境条件都可以抑制微生物 的代谢和生长繁殖，因此，低温、干燥和真空是菌种保藏 的重要手段。
（三）2015版药典微生物检查法修订内容——计数法
修订前
细菌数——营养琼脂 霉菌及酵母菌数——玫瑰红钠琼脂 修订后 需氧菌总数——胰酪大豆胨琼脂（TSA）
霉菌及酵母菌总数——沙式葡萄糖琼脂（TSB）
2015版中国药典四部微生物限度
2015版中国药典四部微生物限度
2015年版中国药典（四部）中，对微生物限度的规定如下：
1. 菌落总数限度：
药物制剂中，每克或每毫升不得含有超过10^3个菌落形成单位（CFU）的细菌。
2. 酵母和霉菌限度：
药物制剂中，每克或每毫升不得含有超过10^2个酵母和霉菌形成单位（CFU）。
3. 大肠菌群限度：
药物制剂中，每克或每毫升不得含有大肠菌群。
4. 产气荚膜梭菌限度：
药物制剂中，每克或每毫升不得含有产气荚膜梭菌。
以上限度是针对不同药物制剂的微生物污染的限量要求，以确保药物的质量和安全性。