基因工程复习要点

一1.载体的功能1.运送外源基因高效转入受体细胞2.为外源基因提供复制能力或整合能力3.为外源基因的扩增或表达提供必要的条件2.基因工程学科建立的理论和技术发明1.三大理论：DNA是遗传物质、1953年提出DNA的双螺旋结构、提出中心法则和遗传密码2.三大技术：工具酶的发现、载体的发现、逆转录酶的发现3.质粒的特点质粒是一类存在于细菌和真菌细胞中能独立于染色体DNA而自主复制的共价、闭合、环状DNA分子，也称cccDNA.通常在1~100范围内。

自主复制性、可扩增性、可转移性、不相容性4.描述PBR322质粒筛选过程PBR322质粒有两个标记基因，氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因。

若在康四环素抗性基因上插入外源DNA,则1.先将转化液涂布在含有氨苄青霉素的平板上，未长的菌落是未导入质粒的菌落2.再将上述平板上存活的菌落影印到含有四环素平板上，在四环素上不长但在氨苄青霉素上长的转化子即为重组子。

5.简述PUC系列质粒筛选重组子的过程PUC是在PBR322质粒上改造的若在lacZ’标记基因上插入外源DNA，则将转化液涂布在含有Amp的平板上，蓝色菌落为非重组子，白色菌落为重组子，没长的未导入质粒。

6.基因工程操作的基本流程1.离：从供体细胞中分离出基因组DNA2.切、连：用限制性核酸内切酶分别将外源DNA和载体分开,用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段接到载体分子上，构成重组DNA分子3.转、增：将重组DNA导入受体细胞，段时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分子或使其整合到受体细胞的基因组中4.筛：筛选经转化处理的细胞，获得外源基因高效稳定的基因工程菌或细胞5.表达：筛选好的菌或细胞导入到受体中使其高效稳定表达7.为什么说逆转录酶的发现对基因工程学科的建立至关重要1.对分子生物学的中心法则进行修正和补充2.使真核基因的制备成为可能可将mRNA反转录形成DNA用于获得目的基因3.在致癌病毒的研究中发现癌基因，为肿瘤发病机理的研究提供有价值线索8.蓝白斑筛选是一种基因工程常用的重组菌筛选方法。

野生型大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝，可使整个菌落产生蓝色变化。

人工插入外源基因后突变型大肠杆菌的β-半乳糖苷酶被插入的外源基因切断，无法形成完整的β-半乳糖苷酶，故不能对无色化合物X-gal进行切割，菌落呈白色。

9.噬菌体载体与质粒相比的优点是什么1.感染效率更高2.扩增速度快，复制量大3.插入容量大4.筛选更简单10.描述碱变性法提取质粒的原理和过程原理：大肠杆菌裂解后有两种DNA为染色体DNA和质粒DNA，将细胞裂解后的溶液中加入强碱调pH至12.0，两种DNA均变性，再加入高盐溶液如KAc将pH调至中性，此时，染色体DNA生成白色絮状沉淀，而质粒DNA很快复性。

过程：1.酶或机械法等破坏细胞，释放出胞内物质2.加碱使DNA与蛋白质变性，加中和液复性3.在上清液中通过酚-氯仿抽提，去垢剂或酶使剩余蛋白质变性或水解，除去蛋白质4.加入醇溶液使质粒DNA变性沉淀而与其他水溶性物质分离5.将沉淀溶解于有RNase的TE溶液中，温浴降解RNA后电泳检测，-20℃保存。

11.三种提取质粒方法的特点和应用1.碱变性法：提取量可大可小，纯度相对较高，大部分实验可用2.沸水浴法：提取快速，纯度不高，提取量小，可用于快速筛选3.离心法：纯度非常高，提取时间长，操作复杂，主要用于基因治疗12.基因工程学科的局限性1.生态上，基因不受控制的扩散，如植物花粉传播使杂草获得抗虫抗除草基因2.转基因食物随人体肠道菌群排泄到水体，从而进入生态链，造成基因污染3.可能造成人种的基因歧视二1.酶切反应如何终止？1)将反应液在65℃下加热5—10分钟；2)向反应液中加入EDTA（螯合激活剂Mg2+）。

2.影响DNA连接反应的因素有哪些？最重要的是哪一点？1)DNA连接酶的酶量：黏性末端一般为0.1U，平末端一般为1U；2)连接时间：5分钟至过夜；3)反应温度：4—16℃；4)插入DNA与载体DNA的分子摩尔比，最佳比为3:1（最重要的一点）3.对于平末端，如何进行更好的连接？1)末端同聚物加尾法：利用末端转移酶在载体及外源双链DNA的3‘端各加上一段寡聚核苷酸，制成人工黏性末端，外源DNA和载体DNA分子要分别加上不同的寡聚核苷酸，如dA(dG)和dT(dC)，然后在DNA连接酶作用下连接成为重组的DNA。

2)衔接物连接法：先在DNA片段末端加上化学合成的衔接物或接头，使之形成黏性末端之后，再用DNA连接酶将它们连接起来。

4.简述碱性磷酸酶的作用。

碱性磷酸酶可将5‘磷酸转化为5‘-OH，从而防止DNA自连，提高DNA连接效率。

5.介绍两种制备探针的方法。

1）切口平移法制备DNA 探针的过程:①使用DNA 酶Ⅰ在DNA 双链上随机切开若干切口,切口处分别形成3′和5′末端。

②利用DNA 聚合酶Ⅰ的5′→3′核酸外切活性,在切口处按5′→3′方向切除单核苷酸;同时利用DNA 聚合酶Ⅰ的5′→3′的聚合酶活性,在切口处3′端加入底物中的单核苷酸,使脱氧核苷酸链得以延伸。

③随着反应的进行,切口不断按5′→3′的方向移动,底物中被标记的单核苷酸被掺入到DNA 链中,直至被标记的DNA 片段两条链的3′端时完成标记。

2）末端标记法：（三种：3‘末端标记法、5‘末端标记法、T4聚合酶替代法，这里讲的是3‘末端标记法）利用Klenow片段填补由限制酶消解DNA所产生的凹陷末端，通过末端脱氧核糖核苷酸转移酶催化标记的dNTP加到3‘末端上。

6.什么是末端转移酶？其作用是什么？定义：一种能够将脱氧核苷酸三磷酸（dNTP）加到某DNA片段上3‘-OH上的不需要模板的DNA聚合酶。

作用：可在DNA3‘末端添加特定的核苷酸，在人工黏性末端的构建中极有用处。

特点：无需模板的DNA聚合酶、具有5’至3’端的DNA聚合活性7.什么是限制与修饰作用，描述过程。

原核细胞为了保护自己，选择性的降解外源DNA，并保护个体免疫于外来DNA侵入系统。

主要由限制性内切酶和甲基化酶组成的二元系统。

8.影响限制性核酸内切酶的影响因素。

酶的纯度、酶切反应的温度与时间、DNA样品的纯度、DNA分子的构型、DNA甲基化的程度、限制性核酸内切酶的反应缓冲液。

9.三种限制性核酸内切酶的特点。

Ⅰ型：能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。

Ⅱ型：能识别专一的核苷酸顺序，并在改顺序内的固定位置上切割双链，识别顺序是一个回文对称顺序。

Ⅲ型：有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。

10.Klenow酶的定义活性及作用定义：Klenow酶是大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ端的大片段活性：5’~3’的聚合活性，3’~5’的外切教正功能。

用途：修复由内切酶造成的3’凹断，使之成为平末端、催化cDNA第二条链的合成、用于双脱氧末端终止法测定DNA的序列。

11.逆转录酶有哪些酶活性RNA指导的DNA聚合酶活性、RNase H活性（水解DNA）、DNA指导的DNA聚合酶活性12.S1核酸酶是一种高度单链特异的核酸内切酶，酸性条件下，由Zn2+激活、降解单链DNA或RNA、降解反应方式为内切或外切，酶量过大时会伴有双核苷酸的降解作用：切平突出的单链末端三1.核酸提取的注意点（提取通则）1)冰上操作，可降低酶活性，防止核酸被降解；2)操作尽可能快速；3)操作时要温柔，如不能用振荡器来振荡核酸，否则核酸容易断裂；4)防止酶的降解，尤其是RNA,因为RNA酶多，且多数耐高温，耐酸碱不易失活。

2.为什么RNA提取比DNA更困难？1)RNA比DNA易被降解：RNase（核糖核酸酶）是非常稳定的酶，能够耐受高温高压，很难除去，DNase（脱氧核糖核酸酶）高温下易失活，因此RNA比DNA更容易因为污染了酶而被酶降解；2)RNA在弱碱性条件下更容易分解，酸碱性耐受性差；3)从结构来说，RNA更容易分解的机理是：在2‘位置上有游离的-OH，以致形成2‘,3’-环形磷酸盐的中间产物，分解需要更低的自由能，因此易分解。

3.核酸提取之后，如何确定产量和浓度？1)测核酸的OD260的值，若OD260=1，则代表有50μg/μL的DNA，40μg/μL的RNA；2)测OD260/ OD280的值，DNA在1.6—1.8，RNA在1.8—2.0，若比值小，则表明蛋白质超标。

4.凝胶电泳分离核酸的原理。

将凝胶置电场中，在中性pH值下带电荷的核酸通过凝胶网孔向阳极迁移，迁移速率受到核酸的分子大小、构象、琼脂糖浓度、所加电压、电场、电泳缓冲液、嵌入染料的量等因素影响。

在不同条件下电泳适当时间后，大小、构象不同的核酸片段将处在凝胶不同位置上，从而达到分离的目的。

琼脂糖凝胶的分离范围较广，用各种浓度的琼脂糖凝胶可分离长度为200bp至50kb的DNA。

5.化学合成的三种策略。

1)小片段粘接法：将待合成的目的基因分成若干小片段，每段长12-15bp（碱基长度），两条互补链分别设计成交错覆盖的两套小片段，然后通过化学方法合成，并退火形成双链DNA大片段。

2)中片段法（补丁延长法）：将目的基因的一条链分成若干40-50bp大小的片段，另一条链设计成与上述大片段交错互补的小片段（约20bp的补丁）。

两组不同大小的DNA单链片段退火后，用klenow酶将空缺部分补齐，最后用T4-DNA连接酶修复缺口。

3)大片段酶促法：将目的基因两条链均分成40-50bp的单链DNA片段，分别进行化学合成，然后用klenow酶和T4-DNA连接酶补平。

6.化学合成法的特点和用途。

特点：优点—反应快，操作简单；缺点—价格昂贵，大部分情况下仅限于小片段的合成。

用途：合成PCR所需的引物；合成探针；合成接头；可合成新的人造基因。

7.什么是平台效应？在PCR扩增反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，引物、模板、聚合酶达到一定比值时，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，也叫平台效应。

原因：产物量增多、dNTP消耗殆尽、酶活趋于平稳。

8.PCR的五要素。

模板、引物、Taq酶、dNTP（4种）、Mg2+浓度。

9.PCR用途：（1）基因分离、克隆（2）扩增DNA靶序列并测序（3）DNA靶序列的突变分析（4）衡量DNA样品检测与分析。

四1.引物设计的原则（1）引物长度控制在15-30bp（2）引物要是一对有相同的或相近的GC含量（3）设计出的引物最好不要有其他的结合位点（4）上下两条引物最好不要有互补区域（5）引物应当超出限制性内切酶识别位点至少3个碱基，保证引物能够被切割2.PCR没有获得目的产物或得到杂产物的原因（1）没有获得目的产物原因：1.Taq酶少；2.退火温度过高；3.dNTP太少；Mgcl2太少；5.循环次数太少；6.模板太少或不纯；解决方案：1.多加Taq酶、dNTP、Mgcl2、模板；2.降低退火温度；3.纯化模板；4.增加循环次数（2）得到杂产物原因：1.循环次数过多；2.酶太多；3.退火温度过低；4.模板、Mgcl2、dNTP过多；5.引物设计不合理解决方案：1.增加循环次数；2.减少酶量、模板、Mgcl2、dNTP；3.升高退火温度；4.重新设计引物；5.增加延伸时间（3）若上述解决方案都无法在奏效，可采用热启动PCR技术，有三种方案：a.在PCR体系中先不加入酶，当温度达到94℃时，再添加酶进行PCR反应；b.将酶用石蜡珠包裹（或在反应液上部铺一层融化的石蜡，待其凝固后加酶），直到石蜡融化后再进入反应液中；c.使用热启动DNA聚合酶，在酶上作抗体封闭，或化学修饰，使其在94℃时才具有活性（原理：阻止温度升高到变性温度前的PCR反应的发生）3.做PCR实验时为什么要做对照实验（1）检查PCR试剂，PCR扩增产物是否污染（2）在医学检测方面，可检测PCR检查结果的正确性，以防出现错误的诊断4.介绍实时定量PCR实时定量PCR是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应循环后产物总量的方法，由于在PCR扩增的指数时期，模板的C t值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依技术原理：将标记有荧光素的Taq man探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵循聚合酶链式反应规律，与模板DNA互补配对的Taq man探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得C t值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测样本的目的基因的拷贝数5.热启动PCR定义：PCR中，先将模板同引物在高于两者变性温度下处理一段时间，然后再加入酶和其他组分进行扩增的方式。