基因工程复习要点

一

1.载体的功能

1.运送外源基因高效转入受体细胞

2.为外源基因提供复制能力或整合能力

3.为外源基因的扩增或表达提供必要的条件

2.基因工程学科建立的理论和技术发明

1.三大理论：DNA是遗传物质、1953年提出DNA的双螺旋结构、提出中心法则和遗传密码

2.三大技术：工具酶的发现、载体的发现、逆转录酶的发现

3.质粒的特点

质粒是一类存在于细菌和真菌细胞中能独立于染色体DNA而自主复制的共价、闭合、环状DNA分子，也称cccDNA.通常在1~100范围内。

自主复制性、可扩增性、可转移性、不相容性

4.描述PBR322质粒筛选过程

PBR322质粒有两个标记基因，氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因。

若在康四环素抗性基因上插入外源DNA,则

1.先将转化液涂布在含有氨苄青霉素的平板上，未长的菌落是未导入质粒的菌落

2.再将上述平板上存活的菌落影印到含有四环素平板上，在四环素上不长但在氨苄青霉素

上长的转化子即为重组子。

5.简述PUC系列质粒筛选重组子的过程

PUC是在PBR322质粒上改造的

若在lacZ’标记基因上插入外源DNA，则

将转化液涂布在含有Amp的平板上，蓝色菌落为非重组子，白色菌落为重组子，没长的未导入质粒。

6.基因工程操作的基本流程

1.离：从供体细胞中分离出基因组DNA

2.切、连：用限制性核酸内切酶分别将外源DNA和载体分开,用DNA连接酶将含有外源基

因的DNA片段接到载体分子上，构成重组DNA分子

3.转、增：将重组DNA导入受体细胞，段时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分子或使其

整合到受体细胞的基因组中

4.筛：筛选经转化处理的细胞，获得外源基因高效稳定的基因工程菌或细胞

5.表达：筛选好的菌或细胞导入到受体中使其高效稳定表达

7.为什么说逆转录酶的发现对基因工程学科的建立至关重要

1.对分子生物学的中心法则进行修正和补充

2.使真核基因的制备成为可能可将mRNA反转录形成DNA用于获得目的基因

3.在致癌病毒的研究中发现癌基因，为肿瘤发病机理的研究提供有价值线索

8.蓝白斑筛选

是一种基因工程常用的重组菌筛选方法。野生型大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以将无色

化合物X-gal切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝，可使整个菌落产生蓝色变化。人工插入外源基因后突变型大肠杆菌的β-半乳糖苷酶被插入的外源基因切断，无法形成完整的β-半乳糖苷酶，故不能对无色化合物X-gal进行切割，菌落呈白色。

9.噬菌体载体与质粒相比的优点是什么

1.感染效率更高

2.扩增速度快，复制量大

3.插入容量大

4.筛选更简单

10.描述碱变性法提取质粒的原理和过程

原理：大肠杆菌裂解后有两种DNA为染色体DNA和质粒DNA，将细胞裂解后的溶液中加入强碱调pH至12.0，两种DNA均变性，再加入高盐溶液如KAc将pH调至中性，此时，染色体DNA生成白色絮状沉淀，而质粒DNA很快复性。

过程：1.酶或机械法等破坏细胞，释放出胞内物质

2.加碱使DNA与蛋白质变性，加中和液复性

3.在上清液中通过酚-氯仿抽提，去垢剂或酶使剩余蛋白质变性或水解，除去蛋白质

4.加入醇溶液使质粒DNA变性沉淀而与其他水溶性物质分离

5.将沉淀溶解于有RNase的TE溶液中，温浴降解RNA后电泳检测，-20℃保存。

11.三种提取质粒方法的特点和应用

1.碱变性法：提取量可大可小，纯度相对较高，大部分实验可用

2.沸水浴法：提取快速，纯度不高，提取量小，可用于快速筛选

3.离心法：纯度非常高，提取时间长，操作复杂，主要用于基因治疗

12.基因工程学科的局限性

1.生态上，基因不受控制的扩散，如植物花粉传播使杂草获得抗虫抗除草基因

2.转基因食物随人体肠道菌群排泄到水体，从而进入生态链，造成基因污染

3.可能造成人种的基因歧视

二

1.酶切反应如何终止？

1)将反应液在65℃下加热5—10分钟；

2)向反应液中加入EDTA（螯合激活剂Mg2+）。

2.影响DNA连接反应的因素有哪些？最重要的是哪一点？

1)DNA连接酶的酶量：黏性末端一般为0.1U，平末端一般为1U；

2)连接时间：5分钟至过夜；

3)反应温度：4—16℃；

4)插入DNA与载体DNA的分子摩尔比，最佳比为3:1（最重要的一点）

3.对于平末端，如何进行更好的连接？

1)末端同聚物加尾法：利用末端转移酶在载体及外源双链DNA的3‘端各加上一段寡聚

核苷酸，制成人工黏性末端，外源DNA和载体DNA分子要分别加上不同的寡聚核苷酸，如dA(dG)和dT(dC)，然后在DNA连接酶作用下连接成为重组的DNA。

2)衔接物连接法：先在DNA片段末端加上化学合成的衔接物或接头，使之形成黏性末

端之后，再用DNA连接酶将它们连接起来。

4.简述碱性磷酸酶的作用。

碱性磷酸酶可将5‘磷酸转化为5‘-OH，从而防止DNA自连，提高DNA连接效率。

5.介绍两种制备探针的方法。

1）切口平移法制备DNA 探针的过程:

①使用DNA 酶Ⅰ在DNA 双链上随机切开若干切口,切口处分别形成3′和5′末端。

②利用DNA 聚合酶Ⅰ的5′→3′核酸外切活性,在切口处按5′→3′方向切除单核

苷酸;同时利用DNA 聚合酶Ⅰ的5′→3′的聚合酶活性,在切口处3′端加入底物中的单核苷酸,使脱氧核苷酸链得以延伸。

③随着反应的进行,切口不断按5′→3′的方向移动,底物中被标记的单核苷酸被掺

入到DNA 链中,直至被标记的DNA 片段两条链的3′端时完成标记。

2）末端标记法：（三种：3‘末端标记法、5‘末端标记法、T4聚合酶替代法，这里讲的是3‘末端标记法）

利用Klenow片段填补由限制酶消解DNA所产生的凹陷末端，通过末端脱氧核糖核苷酸转移酶催化标记的dNTP加到3‘末端上。

6.什么是末端转移酶？其作用是什么？

定义：一种能够将脱氧核苷酸三磷酸（dNTP）加到某DNA片段上3‘-OH上的不需要模板的DNA聚合酶。

作用：可在DNA3‘末端添加特定的核苷酸，在人工黏性末端的构建中极有用处。

特点：无需模板的DNA聚合酶、具有5’至3’端的DNA聚合活性

7.什么是限制与修饰作用，描述过程。

原核细胞为了保护自己，选择性的降解外源DNA，并保护个体免疫于外来DNA侵入系统。主要由限制性内切酶和甲基化酶组成的二元系统。

8.影响限制性核酸内切酶的影响因素。

酶的纯度、酶切反应的温度与时间、DNA样品的纯度、DNA分子的构型、DNA甲基化的程度、限制性核酸内切酶的反应缓冲液。

9.三种限制性核酸内切酶的特点。

Ⅰ型：能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。

Ⅱ型：能识别专一的核苷酸顺序，并在改顺序内的固定位置上切割双链，识别顺序是一个回文对称顺序。

Ⅲ型：有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。

10.Klenow酶的定义活性及作用

定义：Klenow酶是大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ端的大片段

活性：5’~3’的聚合活性，3’~5’的外切教正功能。

用途：修复由内切酶造成的3’凹断，使之成为平末端、催化cDNA第二条链的合成、用于双脱氧末端终止法测定DNA的序列。