分子遗传学第七章

高度的多态性
这样的位点 在基因组中出现的频率很高，而且分布很广。 因为重复序列 两侧的特异性拷贝可作为其在基因组中定“点” 的标记。
作为遗传标记的高频率性 采用PCR技术自动化操作
○ 微卫星标记的应用
微卫星DNA分布广泛均匀，多态信息含量丰富，呈 共显性遗传，稳定性好，可比性强，分析技术易实现自 动化，是一种理想的分子标记。在人类和哺乳动物DNA分 子连锁分析中已取代RFLP，成为第二代分子标记而被广 泛应用。 微卫星标记的主要缺陷在于，必须事先了解微卫星 列分析等，标记开发成 本高。
图7-7 VNTR的多态性
图 7-8 DNA 指 纹
○ DNA指纹的特点
标记性 群体中VNTR存在多态性，可以作 为等位基因的一种标记。即A和a一对等位基因所 连锁的VNTR可能是不同的，因次可以通过鉴别不 同的VNTR作为标记来确定A和a。
多座位性 基因组中有很多小卫星座位， 一个小卫星探针可与多个小卫星座位上的等位基 因杂交，产生具有很多条带的杂交图谱，每个条 带代表一个等位基因。
DNA双链中的一条链上某核苷酸发生置换时，其互补 链的对应位点也发生核苷酸发生置换，只计为一个单核苷 酸多态。 基因组中单核苷酸的缺失、重复、插入不属于SNP。 核苷酸有4种置换方式，理论上SNPs有两种、三种、 四种多态形式，但实际上三等位型和四等位型几乎无法检 出，所以SNP一般为双等位型多态标记。如一个SNP把 AAGGCT改变为TAGGCT。
五 单核苷酸多态性标记
○ 单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism ,SNP）标记是1996年开发的第三代遗 传标记。 SNP与RFLP、STR等标记不同之处在于不以 “长度”差别为检测手段，而是直接以序列的变异 作为标记。 ○ 在一个群体中，基因组的某一座位上可以有 两个或以上的等位基因，这是等位基因多态性。
○ DNA芯片技术
原理:DNA芯片为面积为2cm2或更小的芯 片。芯片上铺有密集的具有特定碱基序列的探 针。将待测的DNA切成长短不一的片段，经荧 光物质标记后，注入嵌有芯片的载片上，由于 DNA和探针的杂交程度与荧光强度有关，通过 激光扫描即可根据荧光强弱测出被检测序列的 变异。
六 几种分子遗传标记简介 （一）随机扩增多态性标记（random
◙ 方法
引物：G+C含量不低于40%-50%；5’和3’端的碱基顺序非反方 向对称；长度以10bp为宜。 扩增：变性—复性—延伸；30—40循环；保温。 电泳： 凝胶电泳；EB染色；拍照。 分析：与RFLP相同。
◙ 优点
技术简单；标记数目多；样品用量小；无须预先知道DNA序 列。
◙ 缺点
重复性较差；大部分为显性分子标记，不能在F2区分纯合体 和杂合体，必须进行F3分析。
就整个基因组而言，两个不同个体之间，约 有几百万个碱基的差异，这相当于在蛋白组中有 10万个氨基酸的差异。 SNP是单碱基突变，任何用于单碱基突变的 技术都可用于SNP检测，如RFLP、DNA序列分析、 单链构象多态性（SSCP）等，但这些技术必须通 过淀粉凝胶电泳检测，费时而且效率不高。但随 着微阵列DNA芯片（DNA chip）技术的发展，SNP 检测效果得到大大提高。
高变异性 DNA指纹图所检测的座位是基因组中有很
高变异性的座位，所以由多个这种座位上的等位基因所 组成的图谱必然有很高的变异性。变异的原因可能是个 体的等位基因连锁着不同数目的重复单位，在减数分裂 时它们之间可以发生重组，产生新的组合。 用探针33.15进行DNA指纹分析时,两个无亲缘关系的 人具有相同DNA指纹的概率为3×10-11,而同时用33.15和 33.6探针分析,概率则为5×10-19 。
○ 以微卫星DNA标记两侧特异性序列设计专一引物， 通过PCR扩增微卫星片段，扩增产物经电泳分离，不 同个体间因核心序列的重复次数不同而产生DNA多态 性。
图7-9（1）VNTR的多态性
图7-9（2）微卫星DNA多态性
图7-10 微卫星在家系中的检测结果
○ 微卫星标记的优点
由于（CA）等重复序列不 受进化上选择，因而在同一位点中数目变异很大， 在群体中，可因重复次数不同可形成多达几十种 的等位片段（多态性）。
在基因组内某一特定的核苷酸位置上，也可以有不同的 核苷酸。基因组中单核苷酸的置换使得群体中基因组的某个 位点存在差异，如同等位基因那样可以有两个或以上的核苷 酸。
○ SNP就是指基因组内特定的核苷酸位置上存 在两种以上不同的核苷酸，其中最少一种在群体中 的出现频率不少于1%（低于1%则视为突变）。
（二）扩增片段长度多态性标（amplified
fragment length polymorphism，AFLP ） 是1993年建立的技术。
◙ 原理
对基因组DNA进行酶切片段的选择性扩增。使用 双链人工接头与基因组DNA酶切片段相连接，作为扩增 反应的模板，通过接头序列与基因组DNA引物3’端的识 别进行选择性扩增，特异性片段经变性、退火和延伸， 经36循环而得到扩增，最后通过变性聚丙烯酰胺凝胶 电泳分离而的以显示。
图7-1
限制性片段长度多态性（RFLP）
图7-2
Southern杂交法
图7-3 RFLP检测
○ 聚合酶链式反应（polymerase
chain reaction , PCR）：1985年建立的一
种体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。
PCR 原理：在反应温度为90—95℃时，DNA变性成为单 链；反应温度降至45—65℃时，两种引物与两条单链DNA退 火而配对结合；反应温度升至72℃左右时，在TaqDNA聚合酶 作用下，引物以单链DNA为模板逐步延伸成新的单链。“ 变 性——退火——延伸”这一循环完成后，DNA复制了一次， 由一个DNA分子成为两个DNA分子。
红细胞抗原多态性——红细胞表面有很多血 型特异抗原，不同的血液型有不同的血型特异抗 原。例如ABO型、MN型等。 白细胞抗原多态性——主要组织相容性（MHC） 是最复杂、最具多态性的体系。猪的MHC用SLA表 示，牛的MHC用BLA表示。
（4）生化遗传标记
以蛋白质多态性为标记。蛋白质多态性是指 具有相同功能的蛋白质存在两种以上的变异体。 这些变异体在电泳时迁移率有差异，据此区分为 不同的“型”。
图7-6 苯丙酮尿症的基因诊断
○ RFLP的局限性
提供的信息量有限。基于核苷酸改变产生的 酶切位点变化只有“能切”和“不能切”两种状态， 产生的酶切片段一般只有2-3个。
有些核苷酸改变不能用限制性内切酶检出。 探针制备和使用同位素存在费用和环境问题。
三 小卫星标记
○ 基因组中有一种重复序列称为小卫星DNA （minisatellite DNA） 或称为同向重复序列可变数 （variable number tandem repeat ， VNTRs ）区。 不同个体和基因组的不同位点上，VNTRs数目都不同。 ○ 1985年，A.Jeeries 在人肌红蛋白基因第1内含子 中分离出132bp的重复序列，内含4个重复单位，每单位长 33bp，内有13bp为核心序列（GGAGGTGGGCAGG）。 ○ 用由核心序列重复排列而成小卫星DNA做探针时， 与基因组DNA杂交，可产生含多条区带的杂交图谱。这种图 谱表现出高度的个体特异性，称之为DNA指纹（DNA fingerprint）。
简单而稳定的遗传性 呈孟德尔遗传，亲代图谱
的条带独立地分配给子代，子代图谱中的每一条带都可 以在双亲中找到。还具有体细胞稳定性，用同一个体不 同组织做的指纹图是相同的。
四 微卫星标记 ○ 基因组中有一种重复序列称为微卫星DNA
（microsatellite DNA） 或称为短串联重复（short tandem repeat，STR）序列。重复单位为2—6bp。
amplified polymorphic DNA，RAPD）是 1990年建立的技术。
◙ 原理
人工随机合成DNA引物，以被测材料DNA为模板， 在PCR仪中随机扩增。 引物在真核基因组（模板DNA ）中可能有很多结 合位点，但只有在大约2000bp内存在反向平行的、与 该引物互补的双链DNA分子，才能将合成的新链作为 下一次合成的模板。
染色体核型（染色体的数目、大小、随体、 着丝粒位置、核仁组织区等）、带型和数量的变 异,呈现出的染色体在结构上和数量上的遗传多态 性称为遗传标记。
优点——不受环境影响，呈孟德尔方式遗传。
缺点——工作量大，多态性较局限，常伴有对 生物有害的表型，获取材料困难。
（3）免疫遗传标记
以动物的免疫特征为标记，包括红细胞抗原多态性 和白细胞抗原多态性。
○
○
二
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RFLP标记
限制性片段长度多态性（restiction fragment length polymorphism,RFLP）是
1980年建立的第一代遗传标记。RFLP是指用限制性 内切酶切割不同个体的DNA时，会产生长度不同的 DNA片段，电泳后用克隆探针方法可检测出这些片 段。
其基本过程是：取得DNA样本——酶切——电泳——转移 至硝酸纤维膜上——DNA探针杂交——放射自显影。
图 7-4 DNA 扩 增 原 理
○ PCR—RFLP
如果已知多态性位点周围的DNA序列，则可 用PCR快速而简单地进行RFLP分析。
首先根据多态位点两侧序列设计和合成引物； 以基因组DNA为模板进行PCR扩增；用相应的内切 酶进行消化；再进行电泳，分析PCR区带判断多 态性。
图7-5 PCR—RFLP
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2 经典的遗传标记
（1）形态遗传标记
能用肉眼识别和观察的、明显表现出遗传多 样性的体型外貌特征，称为形态遗传标记。例如， 动物的毛色、角形、耳型、体型、外貌等。 优点——简单、直观。
缺点——标记数目少、多态性低、受等位基 因的相对效应、非等位基因的相互作用以及环境 等因素的影响。