bradford法测定蛋白的浓度
实验一Bradford法测定蛋白质浓度
实验一Bradford法测定蛋白质浓度1.目的：练习标准曲线的制作，比较不同pH值的蛋白质标准溶液对测定的影响。
2.试剂：①显色剂：取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85%（w/v）磷酸，将溶液用水稀释到1000ml。
②BSA标准溶液（1000µg/ml），分别用0.01N盐酸，去离子水，0.01N NaOH溶液配制，4℃冰箱放置可保存一周。
3.设备与仪器：微量注射器：一支用于专吸BSA；一支用于专吸dH2O岛津UV-265紫外可见光分光光度计4.操作程序：试管号 1 2 3 4 5 6BSA（µl）0 10 20 40 70 100去离子水（µl）100 90 80 60 30 0显色剂（ml） 5 5 5 5 5 5加显色剂混匀，静止2min后测定OD595，建立标准曲线注：①显色液中G-250，出现沉淀不能用。
②定容BSA标准液时，混合次数，以保证混匀。
实验二蛋白质的浓缩（PEG法）1.原理干PEG粉末吸收水分和盐类，大分子溶液即被浓缩。
PEG吸收水分的速度很快，为防止PEG进入蛋白质溶液，最好选用分子量大的PEG。
一般用分子量为20000的PEG。
2.试剂与设备牛血清白蛋白（BSA），聚乙二醇（PEG），玻璃纸，岛津UV-265紫外可见光分光光度计3.操作将一定浓度的BSA溶液20mL放入具有半透膜性质的方形玻璃纸中，用细线扎住口，放入盛有PEG干粉的培养皿中，让盛有BSA溶液的玻璃纸外周涂上PEG；当玻璃纸上的PEG干粉湿透后，抹去PEG，如此反复几次，就可达到浓缩的效果。
当样品浓缩至少于3mL时，进行OD280测值。
4.结果可直接比较浓缩前后OD值的变化；也可制作一个标准曲线，定量描述蛋白质浓度的变化。
表蛋白质浓度的标准曲线管号 1 2 3 4 5 标准BSA溶液（mL） 1 2 3 4 5 蒸馏水（mL） 4 3 2 1 0 蛋白质浓度（mg/mL）0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 ABS280标准BSA溶液的浓度为1mg/mL5.计算求回归方程，并利用该方程计算浓缩前后浓度的变化。
蛋白质浓度测量标准
蛋白质浓度测量标准
蛋白质浓度是衡量蛋白质含量的重要参数。
因此，确定正确的蛋白质浓度对于许多生物化学和分子生物学实验至关重要。
这里我们介绍几种常用的蛋白质浓度测量标准。
1. 比色法：比色法是测定蛋白质浓度最常用的方法之一。
该方法基于分子间色素的吸收差异，比较未知浓度的蛋白质样品与已知浓度的标准样品的吸光度。
2. BCA法：BCA法是一种常用的蛋白质浓度测量标准，其原理为利用还原性离子（如Cu2+）与蛋白质中的蛋白质酪氨酸残基发生反应，形成紫色化合物，通过比色法确定蛋白质浓度。
3. Lowry法：Lowry法是一种经典的蛋白质浓度测量方法，其原理是通过蛋白质与碱式铜离子复合，还原Folin-Ciocalteu试剂，生成蓝色化合物，最后通过比色法确定蛋白质浓度。
4. Bradford法：Bradford法是一种快速、敏感的蛋白质浓度测量方法，其原理为蛋白质样品与Bradford染料发生结合，形成复合物后，可通过比色法确定蛋白质浓度。
总之，选择正确的蛋白质浓度测量标准对于实验的准确性和可靠性具有至关重要的作用。
在选择测量方法时，应该根据实验需要和样品的特性选择适合的方法。
- 1 -。
蛋白质浓度测定-Bradford
蛋白质浓度测定—Bradford法一、实验目的学会用考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度。
二、实验原理考马斯亮蓝能也与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性。
考马斯亮蓝G250的磷酸盐呈棕红色，最大吸收峰在465nm。
当它与蛋白质结合形成复合物时呈兰色，其最大吸收峰改变为595nm。
考马斯亮蓝G250在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律，因此可以通过测定染料在595nm处光吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量。
（二）试剂与器材1. 试剂：（1）标准蛋白质溶液，用g―球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。
（2）考马斯亮兰G―250染料试剂：称100mg考马斯亮兰G―250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。
2. 器材：（1）可见光分光光度计（2）旋涡混合器（3）试管16支三、操作方法1.标准曲线制作（按下表0-11管操作，每管做3个平行）0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100标准蛋白含量( g)0 0．1 0．2 0．3 0．4 0．5 0．6 0．7 0．8 0．9 1．0标准蛋白溶液（0.1mg/mL）(mL)0．1 0．2 0．3 待测蛋白质溶液(mL)2 1.9 1.8 1.7 1.6 1.5 1.4 1.3 1.2 1.1 1.0 1.9 1.8 1.7 蒸馏水(mL)2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2考马斯亮蓝试剂摇匀，1 h内以0号试管为空白对照，在595nm处比色OD595nm以OD595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。
2. 未知样品蛋白质浓度的测定测定方法同上（上表11-13管），将未知待测样品做一定的稀释（鸡血清1：100稀释；羊血清1：200稀释；肝匀浆1：100稀释），使其测定值在标准曲线的直线范围内，每管做3 个平行。
测蛋白浓度的方法
测蛋白浓度的方法
测蛋白浓度的方法有多种，常见的方法包括：
1. Bradford法：用Bradford试剂与蛋白质反应，形成蓝色的蛋白质-染料复合物。
根据复合物与蛋白质浓度成反比的关系，可以通过比色法或荧光法测定蛋白质浓度。
2. Lowry法：将蛋白质与碱式铜试剂和Folin-Phenol试剂反应，生成紫色蛋白质-复合物。
通过比色法或荧光法测定复合物的吸光度，计算出蛋白质浓度。
3. BCA法：将蛋白质与BCA试剂反应形成紫色的蛋白质-染料复合物，根据复合物与蛋白质浓度成正比的关系，通过比色法或荧光法测定蛋白质浓度。
4. UV分光光度法：利用蛋白质在280nm处的吸收峰测定蛋白质浓度。
该方法的优点是快速、简单，但需要纯化后的蛋白质，并且无法区分不同种类的蛋白质。
5. 二维凝胶电泳：分析各种蛋白在二维中的迁移距离，可以定量测定蛋白质的相对含量。
该方法需要复杂的操作和设备，但能够同时定量多种蛋白质。
Bradford法测定蛋白质浓度
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（3）用标准蛋白质量（g）为横座标，用吸光度值A595为纵座标，作图，即得到一条标准曲线。由此标准曲 线，根据测出的未知样品的A595值，即可查出未知样品的蛋白质含量。 0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.50。 2. 微量法 当样品中蛋白质浓度较稀时（10－100g/ml）,可将取样量（包括补加的水）加大到0.5ml或1.0ml, 空白对照 则分别为0.5ml或1.0ml H2O, 考马斯亮蓝G－250试剂仍加5.0ml, 同时作相应的标准曲线，测定595nm的光吸收值。 0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.29。
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Bradford法测定蛋白质浓度
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（一）实验原理 双缩脲法（Biuret法）和Folin—酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋 白质溶液测定的方法。 1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白 质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定 法。 考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（max），由465nm变为595n m，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。 在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。 Bradford法的突出优点是： （1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1g。这是因为蛋白质与染料结合后产生 的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的 多。 （2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的 过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。 因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。 （3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不 干扰此测定法。 此法的缺点是： （1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的 偏差，在制作 标准曲线时通常选用 —球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。 （2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和 0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）。 （3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓 度。 （二）试剂与器材 1. 试剂： （1）标准蛋白质溶液，用 —球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。 （2）考马斯亮兰G—250染料试剂：称100mg考马斯亮兰G—250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷 酸，用水稀释至1升。 2. 器材： （1）可见光分光光度计 （2）旋涡混合器 （3）试管16支 （三）操作方法 1. 标准方法 （1）取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按表中顺序，分别加入样品、水和试剂， 即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水 补充到0.1ml。最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰G—250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意 不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管。 （2）加完试剂2~5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595，空白对 照为第1号试管，即0.1mlH2O加5.0mlG—250试剂。 注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡 洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。 考马斯亮兰法实验表格：
bradford法测蛋白浓度原理
bradford法测蛋白浓度原理Bradford是由美国著名生物化学家MarionM.Bradford在1970年提出的一种快速、简便、准确的测定蛋白浓度的技术，该技术被广泛应用于生物学研究、医学研究和食品检测等领域。
与其他常用测蛋白浓度技术相比，Bradford具有准确、快速、简便等优势，它可以测得0.1/ml以下的低浓度蛋白，因此被广泛应用。
Bradford的原理是利用蛋白与染料异胺基硫酸盐发生特定的离子结合反应而产生着色变化，利用变化后的色度来表示蛋白浓度。
Bradford操作步骤如下：1、首先，准备好被检蛋白和染料异胺基硫酸盐溶液。
2、将染料异胺基硫酸盐溶液加入待检蛋白样品中，反应10-15分钟，待反应完成，观察色度变化。
3、利用标准曲线，根据色度变化表示蛋白浓度。
Bradford可以测定大分子量范围广泛的蛋白，其结果尽管在不同的染料异胺基硫酸盐产生一定的差异，但是变化趋势一致，可以满足一般的测定需求。
此外，Bradford只需要较低的样品体积，蛋白浓度测定结果和Moore（膜采集法）、Lowry (抗体标记法）等其他常用技术的测定结果具有良好的一致性。
Bradford的使用比较简单，但是在使用时，测定结果受到一些因素的影响，例如样品温度、溶解度、抑菌剂种类、各种杂质含量等。
如果样品中抑菌剂或其他杂质含量过高，将会影响测定结果。
因此，在使用Bradford测定蛋白浓度时，应该考虑以上因素，并采取一定的措施。
上述是Bradford测定蛋白浓度的原理及其使用方法，它是一种准确、快速、简便的技术，广泛应用于生物学研究、医学研究和食品检测等领域，但在使用时仍应考虑一些影响测定结果的因素，妥贴采取措施，以保证测定结果的准确性。
bradford法测蛋白浓度原理
bradford法测蛋白浓度原理Bradford方法是一种用于测定蛋白质浓度的实验室和常规医学检测方法，也称为Bradford试剂盒试验，它是由美国科学家Marion M. Bradford在1976年提出的，主要应用于生物医学、药物学、食品学和其他分子生物学领域。
Bradford法是一种快速灵敏的比色分析方法，可以测定蛋白质的浓度，这也是它的高效性的一个很大原因。
Bradford试剂由Bradford发明，由一种特定的酶蛋白原料制成，它可以与任何一种类型的蛋白质反应，从而生成一种特殊的比色物质。
当把Bradford试剂添加到蛋白质溶液中时，会发生一种特殊的化学反应，其后积累的颜色称为Bradford比色，可用来测量蛋白质的浓度。
Bradford法比色的原理是利用蛋白质与Bradford试剂中的色原分子在反应过程中形成一种新的比色物质，经光度切换实现颜色变化，从而能够准确的测量蛋白质的浓度。
Bradford法的优点是结果可靠，结果准确、快速，因此它是许多日常实验室检测中最常用的分析方法之一。
Bradford法可用于多种蛋白质的测定，但最常用的是白蛋白、胆红素和伽马蛋白等血液分析中的参数测定，也可以用于检测其他蛋白质过表达和表达水平。
Bradford试剂盒在使用时，必须先进行标准曲线和检测物质样本的光谱吸收率测定，以确定准确的光吸收峰值，以及浓度与吸光度的关系。
通过该关系可以计算检测物质的浓度。
Bradford方法的缺点是检测的灵敏度相对较低，由于其体系中的基础参数不同，因此在不同实验室中可能存在差异，这就需要实验者在进行检测时，仔细调整和校准实验参数，以确保实验结果的可靠性。
总之，Bradford方法是一种简便、准确、快速、经济的比色分析方法，它可用于生物医学、药物学、食品学和其他分子生物学领域，用于测定各种蛋白质的浓度。
如果正确使用，Bradford方法能够为实验室提供准确的结果，同时也能为医学和其他领域的研究和检测提供有效的解决方案。
考马斯亮蓝法测蛋白浓度
考马斯亮蓝法（Bradford)测蛋白浓度考马斯亮兰法：一种蛋白定量法具体操作步骤:（一）实验原理双缩脲法（Biuret法）和Folin—酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。
1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。
这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。
这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。
考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。
经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。
在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。
Bradford法的突出优点是：（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。
这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。
（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。
完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。
由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。
因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。
（3）干扰物质少。
如干扰Lowry法的K 、Na 、Mg2 离子、Tris 缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。
此法的缺点是：（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。
Bradford法测蛋白浓度
Bradford法测蛋白浓度一、考马斯亮蓝试剂考马斯亮蓝G─250 20mg溶于9.5mL乙醇中，加入17mL 磷酸和173.5ml蒸馏水。
二、标准和待测蛋白质溶液1．标准蛋白质溶液IFN-r紫外扫描定量，用0.15mol/L NaCl配制成1OD280/mL蛋白溶液。
2．待测蛋白质溶液。
DH5a 菌体蛋白和XL－Blue菌体蛋白，使用前用0.15mol/L NaCl稀释。
三、器材DU800四、操作方法1.制作标准曲线取7支离心管，按下表平行操作。
试管编号0123456标准蛋白溶液（mL）00.010.020.030.040.050.06 0.15mol/L NaCl（mL）0.10.090.080.070.060.050.04考马斯亮蓝试剂（mL）5mL摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色A595nm测定结果如下：蛋白量（ug）580nm 1 580nm 2 580nm平均595nm 1 595nm 2595nm平均10 0.0814 0.0755 0.07845 0.0709 0.0671 0.06920 0.2335 0.2288 0.23115 0.2144 0.2188 0.216630 0.32 0.285 0.3025 0.307 0.2661 0.2865540 0.372 0.389 0.3805 0.3537 0.372 0.3628550 0.443 0.4927 0.46785 0.4196 0.4751 0.4473560 0.6408 0.528 0.5844 0.6224 0.5079 0.56515 实验过程中发现，蛋白与G-250混合后，吸收值不稳定，随时间变化。
2.扫描测试实验1）加20ug IFN-r，混合后扫描595nm吸收变化值，参比：450nm，时间：0——50min，测1次/min ，结果：吸收值随时间逐渐下降，图谱名称:20110321 20 ug2）加60ug IFN-r，混合后扫描595nm吸收变化值，参比：450nm，时间：0——50min，测1次/min，结果：吸收值随时间逐渐下降，10——20min时变化幅度较小，图谱名称:20110321 60ug3）加40ug IFN-r扫描，混合后400——700nm波长扫描，分别在1、2、3、4、5、10、15、20、25、30min时扫描，595nm吸收值随时间逐渐下降，450nm吸收值变化很小，变化值约0.001。
bradford 法定量
bradford 法定量
文
Bradford法定量是一项计算蛋白质含量的实验方法，其原理是基于一种名为Bradford 染料的化合物与蛋白质有相互作用的现象。
在Bradford法定量中，一种蓝色染料被加入样品溶液中，并与蛋白质发生反应，产生蓝色与蛋白质浓度相关的复合物。
然后，通过测量
这种颜色的吸收度，可以确定样品中蛋白质的浓度。
Bradford法定量的优点之一是速度快，不需要时间消耗大的制备操作。
此外，它的线性范围广泛，可以用于测量低至1μg/mL的蛋白质浓度，直到高达1mg/mL的浓度。
由于Bradford法定量对大多数常见蛋白质种类的检测效果都很好，因此它被认为是一种高效而且经济的蛋白质定量方法。
但是，Bradford法定量也有一些潜在的缺点。
例如，在样品中存在的一些成分（例如，盐、酸、碱等）可能会干扰染料的反应。
此外，不同种类的蛋白质可能会对染料的反应产
生不同的影响，因此有时需要进行标准曲线来确定样品中不同种类蛋白质浓度的准确值。
蛋白定量分析实验报告
蛋白定量分析实验报告简介蛋白质是生物体中最重要的分子之一，它们扮演着许多生物功能的关键角色。
蛋白质定量分析是研究蛋白质含量和表达水平的重要手段。
本实验报告旨在介绍一种常用的蛋白定量分析方法。
实验目的本实验旨在使用Bradford法对给定的蛋白溶液进行定量分析，通过构建标准曲线计算未知蛋白样品中蛋白质的浓度。
实验步骤1. 制备标准曲线1.准备一系列已知浓度的蛋白溶液，浓度范围从0到1.0 mg/mL。
2.分别取0.2 mL标准蛋白溶液并加入1.8 mL Bradford试剂。
将混合液在室温下孵育5分钟。
3.使用分光光度计在595 nm波长下测量吸光度，并记录吸光度值。
2. 测定未知样品的蛋白质浓度1.取待测蛋白样品0.2 mL，并加入1.8 mL Bradford试剂。
将混合液在室温下孵育5分钟。
2.使用分光光度计在595 nm波长下测量吸光度，并记录吸光度值。
3.使用标准曲线计算未知样品的蛋白质浓度。
3. 数据处理1.绘制标准曲线，横轴表示已知蛋白质浓度，纵轴表示对应的吸光度值。
2.使用线性回归等方法拟合标准曲线，得到拟合方程。
3.根据未知样品的吸光度值和拟合方程，计算未知样品的蛋白质浓度。
结果与讨论我们使用Bradford法对一系列已知浓度的蛋白溶液进行了吸光度测量，并绘制了标准曲线。
通过拟合标准曲线，我们得到了一个线性方程：浓度（mg/mL）= 0.73 × 吸光度 - 0.02。
然后，我们对一个未知蛋白样品进行了吸光度测量，并使用拟合方程计算出样品中蛋白质的浓度为0.62 mg/mL。
通过本实验，我们成功地确定了未知样品中蛋白质的浓度。
这种蛋白定量分析方法简单、快速且可靠，可广泛应用于生物化学和生命科学领域。
结论本实验使用Bradford法对蛋白样品进行定量分析。
通过制备标准曲线和测定未知样品的吸光度值，我们成功地确定了未知样品中蛋白质的浓度为0.62 mg/mL。
这种方法简单易行且结果可靠，是一种常用的蛋白定量分析方法。
考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度含(_Bradford_法)
管号 8 9
待测蛋 缓冲液 总体积 稀释倍 白质 数 （μ L ） （μ L） （μ L ） 20 40 80 60 100 100 5 2.5
10
60
40
100
1.67
3、加入G250试剂
各试管充分混匀后，用取
样器分别加入5.0mL考马 斯亮蓝G250试剂，每加完 一管，立即混合。
思考题
1.考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的原理 是什么？ 2.为什么不能用试管刷来清洗比色皿？ 3.能否将卫生纸塞入比色皿中吸干余液？ 4.为什么最后要用95%的乙醇来润洗比 色皿？
3.标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定 律进行计算，而只能用标准曲线来测定蛋白质的浓度。
三、试剂和器材
1、试剂 （1） 考马斯亮蓝G250燃料试剂 考马斯亮蓝G-250 100 mg溶于50 ml 95%乙醇中，加入120 ml 85%磷酸，用蒸馏 水稀释至1000 ml。 （2） 标准蛋白质溶液 称取BSA50mg，以0.015mol/L的PBS溶液 50mL溶解，配制成1.0mg/mL的标准蛋白质溶 液，4℃存放。
但由于每种蛋白质与该染料的结合能力不同，故
标准品的选择非常重要，选择尽可能与待测蛋白
一致的样品做标准，能最大限度的提高该方法的
准确性。
考马斯亮蓝G250有红蓝两种不同颜色的形式。在
一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色的
溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反
应迅速而稳定。经研究证明，染料主要是蛋白质 中碱性氨基酸和芳香族氨基酸残基相结合。
EDTA等均不干扰此法。
考马斯亮蓝染色法的缺点：
1. 由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的
蛋白质定量测定的方法有哪些
蛋白质定量测定的方法有哪些
蛋白质定量测定的常见方法有以下几种：
1. Bradford方法：基于蛋白质和Bradford试剂反应产生吸光度的变化，利用标准曲线来测定样品中蛋白质的浓度。
2. BCA方法：基于蛋白质和BCA试剂的反应产生的复合物的紫外吸收光谱变化来测定蛋白质浓度。
3. Lowry方法：基于蛋白质与染料（如Folin-Ciocalteu试剂）反应生成的蓝色化合物的峰值吸收度变化来测定蛋白质浓度。
4. UV吸光度法：利用蛋白质在特定波长下的紫外吸收光谱来测定浓度，如在280nm测量腺苷酸蛋白质的含量。
5. 比色法：利用蛋白质与染料或金属离子反应生成的复合物的颜色变化来测定蛋白质浓度，如利用Coomassie蓝染色法或浊度法。
6. 尿素-酸性PAGE测定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和二次洗脱凝胶电泳（acid-urea-Triton X-100-PAGE）相结合的方法，通过与已知浓度的标准蛋白进行定量。
7. 精氨酸测定法：利用精氨酸与二恶安脱水酶反应生成吲哚染料，测定蛋白质的含量。
需要根据具体实验目的和条件选择合适的测定方法。
Bradford法测蛋白浓度
Bradford法测蛋白浓度原理：这一方法基于考马斯亮蓝G-250有红蓝两种不同的形式。
在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色的溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳定。
反应化合物在465－595nm处有最大的光吸收值，化合物颜色的深浅与蛋白浓度的高低成正比关系，因此可检测595nm的光吸收值的大小计算蛋白的含量。
溶液：①Bradford储存液100ml95％乙醇200ml88％磷酸350mgServaG蓝室温下长期保持稳定。
②Bradford工作液425ml双蒸水15ml95％乙醇30ml88％磷酸30ml Bradford储存液用滤纸过滤，保存于室温棕色瓶中，可保存数周，但在使用前需要过滤。
③配制1mg/ml牛血清蛋白（BSA）做标准曲线：表4.2 蛋白质浓度测定标准曲线制作表样品号蛋白量（ug）标准溶液1mg/mlBSA（ul）实验缓冲液（ul） Bradford试剂（ml） A5951 0 0 100 3 02 2.5 2.5 97.53 0.1203 2.5 2.5 97.5 3 0.1304 5 5 95 3 0.2505 5 5 95 3 0.2156 7.5 7.5 92.5 3 0.3317 7.5 7.5 92.5 3 0.3648 10 10 90 3 0.4609 10 10 90 3 0.44210 12.5 12.5 87.5 3 0.53111 12.5 12.5 87.5 3 0.56212 15 15 85 3 0.63313 15 15 85 3 0.61714 17.5 17.5 82.5 3 0.68415 17.5 17.5 82.5 3 0.65016 20 20 80 3 0.72117 20 20 80 3 0.727。
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该法是根据最常用的两种蛋白浓度检测方法之一Bradford法研制而成，
实现了蛋白浓度测定的快速，稳定和高灵敏度。
利用此方法检测速度极快，10〜20个样品只需不足10分钟即可完成。
0.01%,Triton X-100低于
0.05%,Tween20, 60, 80低于
0.015%。
试剂和仪器
一、试齐I」
试剂盒自备：
G250染色液、BSA标准蛋白。
BSA标准蛋白浓度已稀释至500卩g/ml -20C保存。二、测试样品
待测样品蛋白浓度稀释在50-500 g/ml范围内为宜。
三、仪器
96孔酶标、酶标仪。
操作方法
标准品编号
500ug/mlBSA/口1
蒸馏水/卩110302
1.5
28.45
12
186
6830
0分别于小离心管中混匀后，取20卩加入到对应酶标孔中待测样品编号31415•…待测样品稀释后，各取20卩加入到相应酶标孔中G250/卩1200孔1/
反应3-5min
1.用酶标仪测定A595nm处的吸光值。
灵敏度高，检测浓度下限达到25ug/ml,最小检测蛋白量达到
0.5ug待测样品体积为1〜20ul。
且在50〜1000ug/ml浓度范围内有较好的线性关系。
Bradford法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响。样品 中-巯基乙醇的浓度可咼达1M，二硫苏糖醇的浓度可咼达5mM。但受略咼浓度 的去垢剂影响。需确保SDS氐于
2.根据标准曲线计算待测样品的蛋白浓度。