胡萝卜愈伤组织悬浮培养体系的建立和再分化的诱导PPT课件
胡萝卜愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养研究
山西师范大学学报(自然科学版)第18卷第2期Journal of Shanxi Teacher c s University Vol.18No.2 2004年6月Natural Science Edition June2004文章编号:1009-4490(2004)02-0071-06胡萝卜愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养研究尹文兵,李丽娟,黄勤妮,李艳红(首都师范大学生物系,北京100037)摘要:分别以胡萝卜子叶、下胚轴和直根形成层为外植体诱导出愈伤组织,并建立细胞悬浮系.实验结果表明:胡萝卜下胚轴是诱导愈伤组织和进行细胞悬浮培养的理想外植体;诱导松散型愈伤组织的最佳激素浓度配比是1.0mg/L2,4-D+0.5mg/L KT;细胞悬浮培养细胞最佳起始密度为1.125@104个/mL~2.325@104个/50mL时,7d~9d为对数生长期;继代培养4代~5代时,可得到稳定的悬浮细胞系.关键词:胡萝卜;组织培养;细胞悬浮培养;松散型愈伤组织;生长曲线中图分类号:S631.2文献标识码:A胡萝卜(Daucus carota L.),属于十字花科植物,是一种十分重要的蔬菜作物,由于其营养价值高,及其适于生食、加工、烹调等多种用途,在世界范围内广泛栽培.中国是农业大国,胡萝卜作为蔬菜作物在人们生活中起着重要的作用.因此,加快我国胡萝卜育种研究以成为迫切需要[1].近些年来,随着生物技术与分子生物学技术的快速发展,作为生物技术研究的理想材料,许多国家对胡萝卜体细胞杂交技术、遗传转化与再生技术、分子标记与基因克隆技术进行了广泛深入的研究.我国科研工作者在胡萝卜的生物技术与分子生物学研究上也取得了一定进展,特别是在组织培养、原生质体融合[2]、遗传转化及再生等方面.但是在胡萝卜细胞培养方面并不是太多,因此继续深入研究还是很有必要的.本文对胡萝卜愈伤组织诱导的最佳培养基和细胞悬浮培养的条件进行探讨,为其次生代谢产物A-胡萝卜素、B-胡萝卜素的生产以及将来的工厂化和分子生物学研究打下基础.1材料和方法1.1材料来源胡萝卜种子由中国农科院蔬菜所提供.1.2方法收稿日期:2004-03-22作者简介:尹文兵(1979)),男,山西安泽人,首都师范大学在读硕士研究生,主要从事功能基因组学方面的研究.72山西师范大学学报(自然科学版)2004年1.2.1胡萝卜愈伤组织的诱导(1)以胡萝卜子叶和下胚轴为外植体诱导[2].将胡萝卜种子搓去种毛,然后在75%的酒精中消毒5min,无菌水冲洗一遍后,用0.1%的升汞消毒10min,接着用无菌水漂洗一遍,再用无菌水浸泡30min,最后用无菌水漂洗一遍,接种在无激素的MS培养基上.10d左右种子开始萌发,待两片子叶伸展,而心叶刚刚显露时,将幼苗的下胚轴和子叶切成0.3c m 左右的小段,接种在附加植物激素1.0mg/L2,4-D,1.0mg/L2,4-D+0.5mg/L KT,2.0mg/L 2,4-D,2.0mg/L2,4-D+0.5mg/L KT的MS培养基的三角瓶中,培养30天左右,即可诱导出愈伤组织.继代培养时,将老的和生长不良的愈伤组织去掉,将大的健康的愈伤组织切至0.5c m,再放于含0.1mg/L2,4-D的MS培养基(pH5.7)上继续培养.诱导和继代培养均在黑暗条件下进行,培养温度为25e,继代培养时间为3周~4周更换一次培养基.观察并记录继代过程中愈伤组织状态的变化.(2)以胡萝卜直根形成层为外植体诱导.用清水洗净胡萝卜直根,用小刀削去表皮和顶部,将其在75%的酒精中消毒5min,再用0.1%的升汞消毒10min,接着用无菌水漂洗一遍,再用无菌水浸泡30min,最后用无菌水漂洗一遍.消毒好的胡萝卜直根,切去下边的2/ 3部分,留下部分用消毒好的小刀,沿截面横切成厚度1mm左右的小圆片,然后将小圆片的韧皮部和木质部切去,留下形成层,再切成长3mm,宽1.5mm,高1mm的小长块,接种在(1)中的诱导培养基上,获得愈伤后进行继代培养,培养环境条件与(1)相同.1.2.2胡萝卜细胞悬浮系的建立[3]用镊子夹取在固体继代培养基上继代20d左右的胚性愈伤组织即分散性好、疏松的愈伤,接种在含0.3mg/L2,4-D的液体培养基(pH5.7)中,每100mL的三角瓶中加入液体培养基50mL,摇床转速为110r/min,温度为25e,黑暗培养.每隔7d继代一次,连续培养4代~5代后逐渐形成稳定的细胞系.细胞悬浮培养液体培养基成分与愈伤组织继代培养的培养基相同,但不加琼脂.每隔1d在倒置显微镜下观察细胞形态、分散程度并照相,进行细胞计数,以建立细胞数生长曲线.1.2.3细胞悬浮生长曲线的测定取0.5g悬浮培养物,接入新鲜液体培养基中,进行振荡培养,每隔1d取样1次,共培养13d,连续做3次平行实验.1.2.4悬浮细胞数目的测定用血球计数板法[1]对胡萝卜悬浮细胞计数,全部操作在无菌环境下进行,每个结果为4次平行实验的平均值.细胞数按下面公式计算:1mL悬浮液中的总细胞数=A/5@25@ 104@B,A为5个中方格总细胞数,B为稀释倍数.2结果与讨论2.1外植体对愈伤组织状态的影响有文献报道,不同外植体的脱分化能力不同,诱导出愈伤组织的频率和愈伤组织的状态也不同.在胡萝卜愈伤组织诱导时,本实验采用三种外植体:胡萝卜子叶、下胚轴和直根形成层.经过30d观察发现,三种外植体经过培养均诱导获得了愈伤组织.结果如下:以子叶为外植体的大约有2/3诱导获得了愈伤组织,多数愈伤组织呈浅黄色,生长旺盛,质地松散,含水量大,分散性好,但也有一些状态不好,色泽发暗,选取好的可作为细胞悬浮培养的材料;以下胚轴为外植体几乎所有都获得了愈伤组织,并且愈伤组织生长旺盛,呈黄色,比较疏松,分散性好,适宜于细胞悬浮培养;而以直根形成层为外植体获得的愈伤组织不多,色泽较暗,有些带褐色,愈伤组织生长缓慢,质地较硬,分散度差,不适宜于细胞悬浮培养.因此,可认为胡萝卜下胚轴是诱导愈伤组织和进行细胞悬浮培养的理想外植体.2.2 激素对愈伤组织状态的影响不同的激素及激素浓度直接影响着愈伤组织的状态、质地和分散性,而这些因素又是松散愈伤组织的关键,也是进行细胞悬浮培养的必要前提.因此,本实验诱导胡萝卜愈伤组织及继代培养设计了4种激素组合[见1.2.1(1)],通过多次继代培养发现,1.0mg/L 2,4-D+0.5mg/L KT 组合诱导出的胚性愈伤组织(见图1)生长旺盛、呈黄色米粒状分散性好、质地松软、含水量小,有利于细胞悬浮培养,而半胚性愈伤不适合进行细胞悬浮培养.其他3种组合中,2.0mg/L 2,4-D+0.5mg/L KT 诱导出的愈伤组织也比较疏松,而另两种诱导出的愈伤组织质地比较坚实,有褐化现象.可见,2,4-D 与KT 的结合有利于疏松愈伤组织的诱导.图1 胡萝卜松散型愈伤组织 左图:胚性愈伤 右图:半胚性愈伤Fig.1 The imcompact calli.of Daucus carota L Left:embrogenic callus Ri ght:semiembrogenic callus2.3 继代次数与细胞状态之间的关系在细胞悬浮培养的过程中,需要不断地进行继代,来筛选出良好的、较稳定的细胞系.继代过程中,细胞悬浮液的颜色、细胞的形态、大小、数量不断在发生着变化.第1、2次继代时,细胞悬浮液为白色或浅黄色,混浊,有许多大颗粒,倒置显微镜下观察,细胞多数成团,保持较旺盛的分裂能力,单细胞大多呈长形、梭形、不规则形(见图2),细胞个体较大;3、4次继代时,细胞悬浮液变为黄色,比较粘稠,颗粒大小分布均匀,倒置显微镜下观察,分裂的细胞团增多,有的细胞团明显可见有20个~30个球形细胞组成,单细胞数目增多,而且大多呈球形;5次继代时,细胞悬浮液(见图3)呈透明的黄色,澄清,呈油状流动,颗粒分布很均匀,直径大多在0.5m m~1mm,倒置显微镜下观察,细胞团和单细胞很多,大多呈球形(见图4),大小均匀;6、7次继代以上时,悬浮液变得比较澄清,呈浅黄色,悬浮颗粒大小均匀,倒置显微镜下观察,细胞大多成团,可以清楚的看出细胞呈球形,比较均匀,73 第2期 尹文兵,等:胡萝卜愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养研究也有单细胞,但是不多,这可能与细胞聚集成团的特性有关.图2 不规则细胞(10@) 图3 黄色的细胞悬浮液Fig.2 Irregular cell (10@)Fig.3 Yellow cell suspension因此,继代培养过程中,随着继代次数的增多,细胞悬浮液由无色或浅黄色变为黄色,由混浊变为澄清、透明,颗粒大小由不均匀到均匀,最终直径在0.5mm~1mm,倒置显微镜下观察,单细胞由长形、梭形、不规则形变为规则的球形,细胞系逐渐趋于稳定.随后,我们又从筛选出来的细胞系将细胞接种到不含激素的MS 培养基上,7d 后长出新的愈伤组织,30d 后长出胡萝卜全苗并转入蛭石成活(图5),说明以细胞系转化为新的愈伤组织生成再生植株是成功的.图4 球形细胞(40@) 图5 再生植株Fi g.4Global cell (40@) Fig.5Plant regeneration2.4 细胞起始密度对细胞悬浮培养的影响在细胞悬浮培养时,细胞生长需要一个最低生长密度,低于此密度,细胞生长速率降低或根本不生长[4].适宜的起始密度可以缩短细胞系筛选的时间,起始密度过大过小不仅会影响细胞系筛选的时间而且不利于稳定细胞系的建立.同时,细胞的起始密度对细胞培74山西师范大学学报(自然科学版) 2004年养周期也有影响.为此,本实验设计了4个密度梯度:0.4@104个/50mL,1.125@104个/50mL,2.325@104个/50mL,8.875@104个/50mL.培养13d,细胞状态随天数的变化见表1。
胡萝卜愈伤组织培养
验名称 胡萝卜的愈伤组织诱导培养 实验时间 4月至6月小组合作： 是○√ 否○一、实验预习 1、实验目的：1.1通过本次实验，能够熟练准确配制培养基，并能根据实验目的设计适合的培养基配方。
1.2熟练掌握外植体的表面消毒技术和无菌操作技术，同时能设计和配制胡萝卜伤组织增殖培养基。
1.3熟练掌握愈伤组织继代培养的基本操作技术，进一步熟悉、规范无菌操作技术；设计和配制胡萝卜细胞悬浮培养的培养基。
2、实验准备：2.1 MS 母液培养基的配置 主要实验用具和仪器：电子天平、烧杯、容量瓶、细口瓶、药勺、玻璃棒、电炉。
药品：NH 4NO 3、KNO 3、CaCl 2·2H 2O 、 MgSO 4·7H 2O 、KH 2PO 4、KI 、H 3BO 3、MnSO 4·4H 2O 、 ZnSO 4·7H 2O 、Na 2MoO 4·2H 2O 、 CuSO 4·5H 2O 、CoCl 2·6H 2O 、FeSO 4·7H 2O 、 Na 2-EDTA ·2H 2O 、肌醇、烟酸、盐酸吡哆醇(维生素B6)、盐酸硫胺素 (维生素B1)、甘氨酸。
2.2胡萝卜愈伤组织诱导培养培养基的配置 主要实验用具和仪器：冰箱、普通天平、三角瓶、移液管、量筒、烧杯、容量瓶、玻璃棒、医用口杯、精密pH 试纸（pH5.4~7.0）、药勺、称量纸、标签纸、封口膜、橡皮筋、电炉、高压蒸汽灭菌锅等。
药品和试剂：MS 培养基母液、琼脂、蔗糖、生长调节物质、蒸馏水、1mol ·L-1HCl 、1mol ·L-1NaOH2.3胡萝卜愈伤组织诱导 主要实验用具和仪器：100ml 三角瓶、500ml 搪瓷杯、25ml 量筒、10ml 和5ml 吸管、pH 试纸（5.4~7.0）、封口膜、扎口用棉线、药勺、称量纸、酒精棉球、小块纱布、已灭菌滤纸、枪状镊子、手术剪、解剖刀、已灭菌培养皿、酒精灯等。
胡萝卜愈伤组织诱导培养实验
云南大学生命科学学院本科教学实验教学中心细胞工程实验实验报告胡萝卜愈伤组织诱导培养实验摘要：以胡萝卜为实验材料，利用直根形成层为外植体诱导出愈伤组织，探讨了不同激素比例对胡萝卜愈伤组织诱导的影响，然后在诱导后的愈伤组织多次继代培养获得生长旺盛的分化组织，接着进行再分化，在胡萝卜培养过程中掌握诱导培养技术还有细胞培养所要求的无菌技术。
关键字：胡萝卜；愈伤组织；继代培养；再分化；组织培养胡萝卜(Daucus carota L)为伞形科两年生草本植物，因其营养丰富、又具药用价值，且耐运输、易栽培、病虫害少和耐贮藏，而成为人们常食蔬菜。
同时又作为生物技术研究的理想材料，因此建立一个高效的、实用的组织培养快速繁殖体系则是研究植物遗传转化的基础。
本文对胡萝卜愈伤组织诱导的最佳培养基进行探讨，研究了激素对胡萝卜愈伤组织诱导的影响，为其高效生产次生代谢产物α-胡萝卜素、β-胡萝卜素以及将来组织培养的工厂化和分子生物学研究打下基础【1】。
1.材料和方法1.1材料来源：胡萝卜根，长10~20cm，直径1cm以上。
1.2方法：1.2.1愈伤组织的诱导培养（1）培养基的配制：MS +2，4-D 2mg/L + KT 0.5mg/L+3%（30g/L）白砂糖+0.95%（9.5g/L）琼脂，pH5.8（2）胡萝卜的选材、修剪和清洗：选择新鲜较粗的萝卜，先用自来水冲洗，再2％洗涤剂浸泡20分钟，清水冲洗（注意材料损伤）（3）对材料进行灭菌：在超净工作台上用75％乙醇30-60s；0.1%升汞8-10分钟; 无菌水冲洗3-5次；（4）无菌修剪：用解剖刀进一步去除两端1cm，将中断切成0.5cm厚的薄圆片，然后再切去外壁2—3mm厚的皮，选取中间的部分移至无菌的部分，用刀通过形成层切成1cm2的小块；（5）接种：无菌操作将处理好的材料接种于培养基上，2-3个材料/瓶（6）培养及观察记录：25 ℃，光照培养，定期观察污染情况，生长状况1.2.2继代培养从培养瓶中取出愈伤组织，置于无菌培养皿内，用解剖刀将愈伤组织坏死部分剔除并将愈伤组织切成黄豆大小颗粒，放在无激素的新鲜培养基表面，用镊子轻轻压实，每个培养瓶接种2~3个切块。
胡萝卜愈伤组织悬浮培养体系的建立和再分化的诱导1
无菌条件下切割分开
接种在分化培养基上
适当条件下培养1-3周 培养反应的观察
3 胡萝卜素的分离提取和含量测定
悬浮细胞的收集 甲醇萃取 β-胡萝卜素 乙醚纯化 β-胡萝卜素 β-胡萝卜素含量的测定
悬浮细胞的收集
用纱布/滤纸过滤培养液收集细胞 待溶液完全过滤后称纱布/滤纸和细胞的重量
将细胞转移入圆底烧瓶后再次称纱布/滤纸重量 计算细胞鲜重
含量的测定
在波长452nm下测定吸光值A452。
• 己烷中的β-胡萝卜素在波长452nm 下的摩尔消光系数ε1cm1%=2500， 即溶液的OD452为0.25时每ml含β胡萝卜素1μg。
做今天实验之前:
►前面实验的观察和数据收集 ------胡萝卜愈伤组织的诱导和生长反
应的观察 ►植物细胞工程实验部分实验报告的
撰写
污染源: 细菌,霉菌?现象?
• 观察
生 有污染 长 反 应 无污染
原因: 外植体?环境?操作?
不生长,发白或死亡
不生长,不死亡,也无愈伤形成 发生部位
愈伤形成 颜色质地 差异原因?
• 培养基： MS+2，4-D 0.5mg/L+KT
0.2mg/L
• 培养条件： ？
三 实验操作
1.悬浮培养体系的建立
外植体
无菌 脱分化愈伤诱导Fra bibliotek愈伤继代细胞分裂、 分化调节
培养基： MS+2，4-D 0.5mg/L+KT
0.5mg/L
单细胞或细胞细胞团块的获得
方法（机 械和酶法）
液体培养
细胞活力 细胞分裂和生长 分化和代谢调节
无菌条件下将愈伤组织的细胞轻轻地剥离和分开
单细胞或小细胞团块
愈伤组织培养(共70张PPT)
第五章 愈伤组织的培养
1 愈伤组响---重要因素。 转移到新鲜培养基：定期地将它们分成小块，接种到新鲜的培养基上，可以长期保持旺盛的生长。
脱分化：细胞由静止期进入分裂期，恢复分裂机能 影响培养的难易：一般生理状态年轻，来源于生长活跃或生长潜力大的组织和器官的细胞容易培养。
1 愈伤组织 形态 发 生方式
通过体细胞胚胎/胚状 体途径再生植株
愈伤组织器官发生
2 愈伤组织器官发生
先不定芽，在茎基部长根 先长根 后长芽
在不同部位分别形成根和芽
影响愈伤组织器官发生的因素：
无机盐混合物类
营养条件 有机物类 植物激素类
植物激素的作用
天然复合物类
外因
渗透压
酸碱度
影响因子
环境条件 湿度
From embryo culture
From root
2 愈伤组织的形成
从外植体脱分化形成典 型的愈伤组织大致可 分为三个时期：
愈伤组织形成
起始期
分裂期
形成期
2. 1 起始期：
细胞准备进行分裂的时期。 外植体的细胞处在静止状态。 一些刺激因素(如机械损伤、改变光照强度、增加氧等)和
各种生长素对黄瓜各外植体愈伤组织诱导的效应 （各种生长素浓度为10μmol/L）
生长素
种子
愈伤组织形成 下胚轴
果皮
IBA
无愈伤组织形成 愈伤组织增殖强
IBA浓度为1μmol/L时愈 伤组织生长良好
NAA
无愈伤组织形成 所有外植体均产生 愈伤组织
愈伤组织增殖强
2,4-D
所有外植体均产 2,4-D浓度为1μmol/L时
4）其他培养条件对胚状体发生的影响 液体培养 适宜pH5-6 光照：不需要光或半天光照时间 温度25 ℃左右
胡萝卜愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养研究
胡萝卜愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养研究
尹文兵;李丽娟;黄勤妮;李艳红
【期刊名称】《山西师范大学学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2004(018)002
【摘要】分别以胡萝卜子叶、下胚轴和直根形成层为外植体诱导出愈伤组织,并建立细胞悬浮系.实验结果表明:胡萝卜下胚轴是诱导愈伤组织和进行细胞悬浮培养的理想外植体;诱导松散型愈伤组织的最佳激素浓度配比是1.0mg/L 2,4-D+0.5mg/L KT;细胞悬浮培养细胞最佳起始密度为1.125×104个/mL～2.325×104个/50mL 时,7d～9d为对数生长期;继代培养4代～5代时,可得到稳定的悬浮细胞系.
【总页数】6页(P71-76)
【作者】尹文兵;李丽娟;黄勤妮;李艳红
【作者单位】首都师范大学生物系,北京,100337;首都师范大学生物系,北
京,100337;首都师范大学生物系,北京,100337;首都师范大学生物系,北京,100337【正文语种】中文
【中图分类】S631.2
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胡萝卜愈伤组织诱导
胡萝卜愈伤组织的诱导摘要:以胡萝卜直根为外植体,进行植物组织培养，并探讨解决胡萝卜组织培养不易成功的因素。
先后进行了两次实验,研究了不同的植物生长调节剂(2,4-D、6-BA)对胡萝卜脱分化形成愈伤组织速度的影响。
实验结果表明在母液中加入2,4-D(2.2 mg/L)效果最好,优于加入6-BA(0.5mg/L)+ 2,4-D(1.0mg/L)。
关键词：胡萝卜；愈伤组织；激素一、引言19世纪30年代，德国植物学家施莱登和德国动物学家施旺创立了细胞学说，根据这一学说，如果给细胞提供和生物体内一样的条件，每个细胞都应该能够独立生活。
1902年，德国植物学家哈伯兰特在细胞学说的基础上，大胆提出要在试管中人工培育植物。
他预言离体的植物细胞具有发育上的全能性，能够发育成为完整的植物体。
这种细胞全能性的理论是植物组织培养的理论基础。
1958年，一个振奋人心的消息从美国传向世界各地，美国植物学家斯蒂瓦特等人，用胡萝卜韧皮部的细胞进行培养，终于得到了完整植株，并且这一植株能够开花结果，证实了哈伯兰特在五十多年前关于细胞全能的预言。
植物的组织培养是根据植物细胞具有全能性这个理论，近几十年来发展起来的一项无性繁殖的新技术。
植物的组织培养广义又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。
狭义是指用植物各部分组织，如形成层、薄壁组织、叶肉组织、胚乳等进行培养获得再生植株，也指在培养过程中从各器官上产生愈伤组织的培养，愈伤组织再经过再分化形成再生植物。
植物组织培养新技术在快繁脱毒、育种、种质资源保存、次生代谢物提取、基因转化等方面有着良好的前景以及研究热点。
在植物育种上的应用：单倍体育种，离体胚培养和体外受精，细胞融合，基因转化，培养细胞突变体、在植物脱毒和快速繁殖上、在人工种子和种质保存方面、在提取植物次生产物生产上、在植物免疫方面的皆能有其应用。
胡萝卜肉质根愈伤组织的诱导与继代增值培养实验报告
综合性实验报告胡萝卜肉质根愈伤组织诱导及继代增殖培养一、实验原理及目的（一）实验目的1、通过MS培养基母液的配制和保存，掌握配制于保存培养基母液的基本技能。
2、通过MS固体培养基的配制，掌握培养基的制备基本技能。
3、学会和掌握诱导愈伤组织的基本技术。
4、初步掌握组织培养的无菌操作技术。
5、初步掌握外植体的消毒技术。
6、掌握组培室常用的化学试剂。
7、学会和掌握愈伤组织继代培养的基本操作技术。
（二）实验原理1、配制培养基时，为了使用方便和用量准确，通常采用母液法进行配制，即将所选培养基配方中各试剂的用量，扩大若干倍后再准确称量，分别先配制成一系列母液置于冰箱中保存，使用时按比例吸取母液进行稀释配制即可。
2、在自然情况下，根主要为植物吸收和固定的重要器官，同时，有些植物的根亦具有繁殖的功能。
植物根生长快、代谢能力强、变异小，使得其在研究根的营养吸收、生长和代谢的变化规律、器官分化、形态建成规律等方面具有重大的理论与实践意义。
依据细胞全能性原理，即指任何具有完整细胞核的细胞（动物、植物等），都拥有形成一个完整个体所必需的全部遗传信息（DNA）。
就胡萝卜根来说，其肉质根细胞同样具有形成完整再生植株的能力。
这种由单个根衍生而来并经继代培养而保存的，在遗传上具有一致的根的培养物，称为离体根无性系。
利用这些离体根的无性系可以进行器官再生体系、苗木无性系快速繁殖和其他方面的实验研究。
3、愈伤组织（callus）原指植物体的局部受到创伤刺激后，在伤口表面新生的组织。
它由活的薄壁细胞组成，可起源于植物体任何器官内各种组织的活细胞。
在植物体的创伤部分，愈伤组织可帮助伤口愈合；在嫁接中，可促使砧木于接穗愈合，并由新生的维管组织使砧木与接穗沟通。
在植物器官、组织、细胞离体培养时，条件适宜也可以长出愈伤组织。
其发生过程是：外植体的活细胞经诱导，恢复其潜在的全能性，转变为分生细胞，继而其衍生的细胞分化为薄壁细胞组织而形成愈伤组织。
胡萝卜愈伤组织的培养
胡萝卜愈伤组织的培养一、实验目的1、理解胡萝卜愈伤组织培养的培养方法及条件。
2、了解培养基的成分及掌握培养基的配制方法。
3、会对外植体胡萝卜进行预处理和正确消毒。
4、能严格按照操作规程进行无菌操作。
二、实验原理在离体根培养中，首先解决外植体消毒问题，因为在自然条件下，根生长在土壤中，要进行彻底灭菌、消毒。
为了消灭这种污染源，在把植物组织接种到培养基上之前必须要进行彻底的表面消毒；内部已受到真菌或细菌侵染的组织在组织培养研究中一般都淘汰不用。
胡萝卜的肉质根，其硬度较大，容易操作，可直接用灭菌剂进行处理。
无菌操作技术室用于防止微生物进入实验室区内的操作技术。
要求：①在进行无菌操作之前将界面上的细菌和病毒等微生物杀灭；②操作过程中是界面与外界隔离，避免微生物的侵入。
目前，多数实验室都使用各种类型的超净工作台进行无菌操作。
三、实验材料与用具1、器具：培养瓶、电磁炉、玻璃棒、酒精灯、解剖刀、镊子、酒精棉球（浓度为75%）、烧杯、废液缸、滤纸、玻璃棒、移液管、PH试纸2、材料：新鲜健康的胡萝卜肉质直根3、试剂、2.4-D、6-BA、大量元素母液、微量元素母液、铁盐母液、有机物母液、蔗糖、琼脂、钙盐母液、无菌水、蒸馏水四、实验方法与步骤1、配制培养基（1）、确定配方和配制量：根据实验需要，确定配制培养基的配方。
（2）、计算各种母液和药品用量：a、确定培养基配制量b、查看MS培养基母液的扩大倍数、植物生长调节剂母液浓度c、由母液用量=培养基配方浓度/培养基母液浓度*培养基配制量植物生长调节剂母液用量=培养基配方浓度/植物生长调节剂母液浓度*培养基配制量（3）、量取：由表一的数据仔细量取相应的量并用托盘天平分别称取蔗糖、琼脂。
（4）、溶解：a、在锅内加配制量60%左右的蒸馏水，至于电磁炉加热b、加入琼脂，加热不断搅拌，待琼脂完全溶化后加入蔗糖c、将所量取的各种母液的混合液倒入锅中，搅拌均匀d、琼脂必须完全熔化，以免造成浓度分布不均匀（5）、用蒸馏水定容：a、将完全溶解、混匀后的培养基倒入烧杯中b、加蒸馏水定容至规定体积。
胡萝卜愈伤组织诱导
胡萝卜愈伤组织的诱导摘要:以胡萝卜直根为外植体,进行植物组织培养，并探讨解决胡萝卜组织培养不易成功的因素。
先后进行了两次实验,研究了不同的植物生长调节剂(2,4-D、6-BA)对胡萝卜脱分化形成愈伤组织速度的影响。
实验结果表明在母液中加入2,4-D(2.2 mg/L)效果最好,优于加入6-BA(0.5mg/L)+ 2,4-D(1.0mg/L)。
关键词：胡萝卜；愈伤组织；激素一、引言19世纪30年代，德国植物学家施莱登和德国动物学家施旺创立了细胞学说，根据这一学说，如果给细胞提供和生物体内一样的条件，每个细胞都应该能够独立生活。
1902年，德国植物学家哈伯兰特在细胞学说的基础上，大胆提出要在试管中人工培育植物。
他预言离体的植物细胞具有发育上的全能性，能够发育成为完整的植物体。
这种细胞全能性的理论是植物组织培养的理论基础。
1958年，一个振奋人心的消息从美国传向世界各地，美国植物学家斯蒂瓦特等人，用胡萝卜韧皮部的细胞进行培养，终于得到了完整植株，并且这一植株能够开花结果，证实了哈伯兰特在五十多年前关于细胞全能的预言。
植物的组织培养是根据植物细胞具有全能性这个理论，近几十年来发展起来的一项无性繁殖的新技术。
植物的组织培养广义又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。
狭义是指用植物各部分组织，如形成层、薄壁组织、叶肉组织、胚乳等进行培养获得再生植株，也指在培养过程中从各器官上产生愈伤组织的培养，愈伤组织再经过再分化形成再生植物。
植物组织培养新技术在快繁脱毒、育种、种质资源保存、次生代谢物提取、基因转化等方面有着良好的前景以及研究热点。
在植物育种上的应用：单倍体育种，离体胚培养和体外受精，细胞融合，基因转化，培养细胞突变体、在植物脱毒和快速繁殖上、在人工种子和种质保存方面、在提取植物次生产物生产上、在植物免疫方面的皆能有其应用。
实验2-4胡萝卜愈伤组织的继代培养
及时继代
愈伤组织在培养过程中会逐渐老化， 为保证实验的准确性，应及时进行继 代培养。
03
实验结果与分析
实验结果
实验观察记录
在继代培养过程中，胡萝卜愈伤组织表现出良好的生长状态，细 胞分裂活跃，质地松软，颜色鲜艳。
显微镜观察
通过显微镜观察，发现细胞分裂旺盛，细胞排列紧密，呈现出典型 的愈伤组织结构。
在未来的实验中，我们可以尝试优化 培养条件，如温度、光照、湿度等， 以提高愈伤组织的生长速度和质量。
此外，我们还可以进一步研究愈伤组织在继 代培养过程中的基因表达和分子机制，为植 物组织培养和基因工程领域的发展做出贡献 。
我们可以通过添加植物激素或其他生 长因子来调节愈伤组织的生长和分化， 以实现更好的实验效果。
2. 制备培养基
按照MS培养基配方，添加适量的植物生长调节剂和糖， 搅拌均匀后倒入培养容器中，待培养基凝固。
3. 接种外植体
将准备好的外植体放置在培养基上，确保外植体与培养 基接触良好。
4. 培养条件
将培养容器放置在恒温、恒湿、无菌的环境中，保持适 宜的温度和光照条件。
5. 继代培养
经过一段时间的培养后，观察愈伤组织的生长情况，当 愈伤组织长满培养基时，将其切割成小块，重新接种到 新的培养基上，进行继代培养。
薄壁细胞团。
通过将愈伤组织进行继代培养， 可以保持其生长和分化能力，并 对其进行遗传转化、次生代谢产
物生产等方面的研究。
实验采用的培养基通常含有植物 生长调节剂、无机盐、维生素等 成分，以促进愈伤组织的生长和
分化。
实验背景
植物细胞培养技术是近年来发展迅速的生物技术领域之一，在农业生产、生物医药、 工业生产等方面具有广泛的应用前景。
第四章之二愈伤组织的诱导、形成及分化
第一节 愈伤组织的概念及类型
一、定义 callus
在一定条件下从外植体的切口（伤口）部位生成的无 特定结构和功能的薄壁细胞团。 二、愈伤组织的起始条件
创伤+激素
★机械性创伤 ★微生物入侵
★昆虫袭击
三、来源
植物各种器官、组织、细胞均有产生愈 伤组织的潜在可能性
★光照 暗 弱光 ★温度 20-30℃ ★培养基
N源 NH4+/NO3C源 蔗糖
激素 生长素：2,4-D IAA NAA 0.01-10mg/L
细胞分裂素：KT ZT 6-BA 0. 1-10mg/L
二、愈伤组织的形成过程
特点
愈伤组织形成
起始期 分裂期
改变原来的分化方向和代谢方式， 合成代谢加强，合成大量蛋白质和 核酸物质为细胞的分裂和增殖奠定 基础
外植体外层细胞开始分裂，细胞脱 分化，愈伤组织结构疏松，缺少组 织结构，颜色浅而透明
形成期
Callus表层细胞分裂逐渐停止， 而转向其内部的局部地区，并改
变分裂面的方向，出现瘤状结构 外表，Callus中可以发现维管组 织，但不形成维管系统
❖ **诱导期长短因植物种类、外植体的生理状 态和外部因素而异，即使同一种物种不同基 因型同一外植体的愈伤组织诱导期也不同。
0.056
80d
0.253 0.227 0.219 0.124
0.063
第四章之二愈伤组织的诱导、 形成及分化
第一节 愈伤组织的概念及类型 第一节 愈伤组织的诱导和形成 第三节 愈伤组织的继代及其生长分析 第四节 愈伤组织形态建成 第五节 愈伤组织的形成及其生理生化基础
胡萝卜组织培养系统实验
胡萝卜组织培养系统实验文档编制序号：[KKIDT-LLE0828-LLETD298-POI08]云南大学生命科学实验教学中心实验报告课程名称：细胞工程实验院系：生命科学学院年级专业：2013级生物技术（国家生命科学与技术基地班）姓名：杨梦梅选课号：学号：座号：A2开课日期：学期：2015秋季学期任课教师：吕琦、牛芸云南大学生命科学实验教学中心制胡萝卜愈伤组织的诱导、继代及细胞悬浮培养研究第一作者：杨梦梅同组实验者：赵姗( 云南大学生命科学学院,昆明650504)摘要: 以胡萝卜肉质根为外植体诱导出愈伤组织, 并建立细胞悬浮系. 实验结果表明: 胡萝卜肉质根是诱导愈伤组织和进行细胞悬浮培养的可行外植体; 诱导致密型愈伤组织的最佳激素浓度配比是 mg/ L 2, 4- D+ mg/ L KT;继代培养1代~ 2时,可得到高活性的悬浮细胞系；细胞悬浮培养细胞经过 14 天达到高峰期（生长平台）。
关键词: 胡萝卜; 组织培养; 细胞悬浮培养; 致密型愈伤组织;The study about inducement, subculture and suspension cell lines ofCarrots’ callusAbstract: Carrots’ flesh roots can induce callus as explants, and then it establishessusp ension cell lines. The experimental results show that: Carrots’flesh roots really can induce callus and then make suspension cell lines. In order to induce high density callus, the best hormone ratio is mg/ L 2, 4- D+ mg/ L KT. Subculturing the cell line for 1 to 2 times, we can obtain the suspension cell line with high activity. After 2 weeks, the cell line reaches to thepeak of growth.Keywords: Carrot; tissue culture experiments; suspension cell; callus in high density 胡萝卜( Daucus carota L . ) , 属于十字花科植物, 是一种十分重要的蔬菜作物, 由于胡萝卜肉质根营养丰富，约含有88％的水、6％～8％糖、1％～2％植物纤维，0．7％～1．2％蛋白质、1％灰份及0～3％脂肪，及其适于生食、加工、烹调等多种用途, 在世界范围内广泛栽培。
胡萝卜愈伤组织的培养
胡萝卜愈伤组织的培养摘要：实验中的胡萝卜的组织培养实验成功率比较低，主要体现在污染率较高和出芽率低上，在长期的实验中，有些胡萝卜的愈伤组织基本分化不出芽。
针对这一问题我们反复实验。
通过把培养出来的胡萝卜的愈伤组织进行悬浮培养后，再转接到固体培养基上，从而使得胡萝卜愈伤组织更容易分化出芽来。
并使整个过程控制在无菌条件下，现就胡萝卜组织培养的整个实验过程控制作一详细介绍。
关键词：胡萝卜；组织培养；无菌控制1.实验流程（1）实验总流程：MS母液培养基的配置→胡萝卜愈伤组织诱导培养培养基的配制→胡萝卜愈伤组织诱导→胡萝卜愈伤组织的继代培养→观察记录（2）无菌操作流程：实验员消毒→实验室、无菌台灭菌→实验器材的灭菌→无菌接种→消毒→实验台卫生（3）胡萝卜愈伤组织诱导培养流程：胡萝卜愈伤组织诱导培养基的配置→胡萝卜愈伤组织诱导培养培养基的分装→胡萝卜愈伤组织诱导培养培养基灭菌→取材及材料的消毒灭菌→接种与培养（4）胡萝卜愈伤组织的继代培养流程：器械及实验者的消毒灭菌→剥离愈伤组织诱导培养所得的愈伤组织→胡萝卜愈伤组织接种2.实验仪器及材料胡萝卜(市场购买)、超净工作台、光照培养架、高压蒸汽灭菌锅、恒温振荡器、打孔器、小刀、培养皿、解剖刀、镊子、植物组培试剂盒。
3.实验方法与步骤3.1胡萝卜愈伤组织的诱导①外植体消毒用清水洗干净胡萝卜直根，用小刀给其削去表皮，并切成小段放入烧杯中。
先用70%酒精对胡萝卜直根消毒5min，用无菌吸水纸吸干，再用10%的次氯酸钠溶液消毒10min（或用0.1%的升汞消毒10min,接着用无菌水漂洗一遍，再用无菌水浸泡30min），放入无菌水中漂洗2~3次，用无菌吸水纸吸干待用。
②外植体接种。
把消毒好的胡萝卜直根放入无菌培养皿中，用消毒好的小刀沿截面将其横切成厚度1mm左右的小圆片，然后将小圆片的韧皮部和木质部切去，留下形成层，再将形成层切成大约长5mm、宽5mm、高1mm的小长块(如图1a)。
植物组织培养植物组织培养技术愈伤组织的分化与再分化脱分化及形态发生分析PPT课件
•（二）培养基
4 物理性质：固体或液体状态、渗透压等。
——对形态发生有明显的影响。
➢ 培养基状态：
第一阶段诱导形成愈伤组织——固体培养基 第二阶段细胞和胚状体的增殖——液体培养基 第三阶段胚状体发育成可移植植株——固体培养基
➢ 培养基渗透压：
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• 形成期(分化期)：是指外植体经过诱导期和分
裂期后形成了无序结构的愈伤组织进行分化并形成器官的 时期。
主要特征如下：
• 1、细胞的平均大小相对稳定。
• 2、细胞分裂由原来局限在组织外缘分裂转为组织 内部较深层局部细胞的分裂。
• 3、形成分生组织结节。瘤状或片状的拟分生组织。分生组织
• 特点： • 1、细胞大小没有多大变化，外观无明显特征； • 2、细胞内物质代谢旺盛，RNA含量迅速增加，细胞核体积明显增大。
• 诱导期的长短，因植物种类和外植体的生理状况和 外部因素而异，如胡萝卜的诱导期要好几天，新鲜 的菊芋块茎则只要22h，但菊芋块茎经过5个月的贮 藏后，诱导期则须延长到40h以上。
• 不同激素的效果是不同的:如NAA对生根的作用比IAA和IBA的效 果好，但用IAA和IBA处理，产生的根比较健壮，而用 NAA处理，产生的根则较纤细。2，4-D往往利于愈伤组 织的诱导。
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愈伤分化
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•（二）培养基
• 2．无机营养元素 在植物组织培养，细胞的生长也要求满足植物
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优良的愈伤组织的 特点
• 1、高度的胚性或再分化能力——以便从这些愈 伤组织得到再生植物。
• 2、容易散碎——以便用这些愈伤组织建立优良 的悬浮系，并且在需要时能从中分离出全能性的 原生质体。
胡萝卜愈伤组织培养及继代培养
①仪器设备：
冰箱、普通天平、三角瓶、移液管、量筒、烧杯、容量瓶、玻璃棒、医用口杯、精密pH试纸（pH5.4~7.0）、药勺、称量纸、标签纸、封口膜、橡皮筋、电炉、高压蒸汽灭菌锅等。
②药品和试剂：
MS培养基母液、琼脂、蔗糖、生长调节物质、蒸馏水、1mol/LHCl、1mol/LNaOH
5.掌握组培室常用的化学试剂。
6.学会设计和配制胡萝卜细胞悬浮培养的培养基。
7.熟练掌握愈伤组织继代培养的基本操作技术。
8.使同学熟练掌握胡萝卜细胞悬浮培养的基本操作技术，进一步熟悉、规范无菌操作技术。
9.使同学了解胡萝卜愈伤组织器官分化培养的基本操作技术。
（二）、实验原理、实验流程或装置示意图
1、实验原理
②、培养瓶封口后置于恒温培养箱中全黑暗培养。温度控制在25℃左右。
③、接种结束后，清理和关闭超净工作台。
4、胡萝卜愈伤组织的继代培养
（1）、准备工作
接种室的清洁和消毒；超净工作台的开机和消毒；剪刀、镊子、已灭菌培养皿和滤纸、待用培养基等的准备；实验材料的准备（选择装有无污染的已分化出愈伤组织的外植体的三角瓶摆放于超净工作台）。
配制流程：
(1)根据需要配制培养基的量（各小组500ml）称好所需的琼脂放入医用口杯中，加入适量的蒸馏水置于电炉上加热溶解，边加热边用玻棒搅拌。
(2)待琼脂完全溶解后，加入规定用量的母液（可事先取好放在一烧杯中），再加入规定用量的蔗糖，继续加温并不断搅拌，待琼脂煮透后端离火源，根据培养基配方及培养基体积加入所需的生长调节物质，定容至所需的体积，并用玻棒搅拌均匀。
实验名称
胡萝卜肉质根愈伤组织诱导、继代增殖、细胞
第五章愈伤组织的培养ppt课件
（一）体细胞胚状体的概念及其特点
1、定义：
离体培养下没有经过受精过程，但经过了胚胎发育过 程所形成的体细胞胚或胚状体。
2、体细胞胚的结构与发育特点：
（1）与器官发生形成个体的途径相比： （2）与合子胚相比
2、体细胞胚的结构与发育特点
第五章 愈伤组织的培养
第一节 愈伤组织的诱导和分化 第二节 愈伤组织中的形态发生 第三节 人工种子
教学目的：
掌握愈伤组织诱导与形态发生的基本知识， 熟悉人工种子的制作技术，了解愈伤组织的 增殖方式及其状态的调控技术。
教学重点：
1、愈伤组织的诱导； 2、愈伤组织器官的形成； 3、体细胞胚胎发生； 4、人工种子。
①体细胞胚人工种子； ②非体细胞胚人工种子。
三、人工种子的优点：
①在无性繁殖植物中，有可能建立一种高效快 速的繁殖方法，它既能保持原有品种的种性， 又可以使之具有实生苗的复壮效应；
②可以对优异杂种种子不通过有性制种而快速 获得大量种子，特别是对于那些制种困难的植 物更具有重要的实用意义；
③对于一些不能正常产生种子的特殊植物材料 如三倍体、非整倍体、基因工程植物等，有可 能通过人工种子在短期内加大繁殖应用；
2、人工种子概念的发展：
（1）早期的人工种子：仅仅局限于由人工种皮包被 的体细胞。
体细胞人工种子的局限性：使其应用受限
• ①体细胞诱导在植物种类上的局限性； • ②体细胞胚在群体上的变异； • ③木本植物经过胚途径繁殖其幼年期较长等问题。
（2）人工种子概念的延伸（日本）：
认为使用适当方法包埋组织培养所获得的具有发育成 完整植株的分生组织（芽、愈伤组织、胚状体和生长 点等）、可取代天然种子播种的颗粒均为人工种子。
②成簇成团的体积小而细胞质致密的细胞，这类细胞具有成 胚能力，因而，把这类细胞团又称为胚性细胞团。
第四章愈伤组织培养PPT课件
再转入生长素含量极低或没有的培养基上====胚 一、愈伤组织培养中的形态发生 其中以维管组织（特别是木质部）的分化最为常见。 在离体条件下胡萝卜体细胞胚的发育是一个包括两个步骤的过程，每个步骤需要一种不同的培养基。 超过4％时则几乎完全为韧皮部； 体细胞胚胎发生的几个概念 二倍体细胞比单倍体细胞容易 愈伤组织的建立和增殖所需的是一种含有生长素的培养基，通常所用的生长素是2,4D，浓度范围0. 在组织培养的器官发生过程中，愈伤组织是一团无极性分化的细胞团，器官分化中芽或根分化只是具单极性，而胚状体在分化初期就 具胚根和胚芽两极，具明显的形态特征上的极性（Polarity）类似于合子发育中的种子结构。 2、影响维管组织分化的主要因素 幼年细胞和组织比成年的容易 赤霉素（GA3）抑制烟草、紫雪花（Plumbago indica）秋海棠（Begonia）及水稻的器官分化。
第四章愈伤组织培养
优选第四章愈伤组织培养
第一节 愈伤组织的诱导
郁李的愈伤组织
细胞的全能 性的体现
脱分化：一个已停止分裂的成 熟细胞转变为分生状态，并形 成未分化的愈伤组织的现象。
再分化 ：愈伤组织在一定的培养条
件下又可以经过胚胎发生形成双极性 的胚状体，或经过器官发生形成单极 性的芽或根，进而重新形成完整的植 株，这后一段过程一般称为再分化。
（一）诱导期（起动期）
诱导期又称起动期，指细胞准备进行分裂的时期，是愈伤组织形成 的起点。
Calrom root
Callus arising from vascular tissue
From embryo culture
Photo indicating where the
停止分裂的细胞发生生理 代谢变化而形成由不同形 态和功能的细胞组成的愈 伤组织。
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化的诱导
1
一、实验目的
• 学会建立胡萝卜细胞悬浮培养体系的方法 和相关操作。
• 通过胡萝卜悬浮培养生产胡萝卜素的整个 过程，了解利用植物细胞悬浮（大量）培 养技术生产有用次生代谢物这一个技术的 主要流程，技术体系和注意事项。
• 学会从愈伤组织诱导细胞再分化的原理和 方法。
撰写
7
污染源: 细菌,霉菌?现象?
• 观察
生 有污染 长 反 应 无污染
原因: 外植体?环境?操作?
不生长,发白或死亡
不生长,不死亡,也无愈伤形成 发生部位
愈伤形成 颜色质地 差异原因?
• 拍照
• 分析
8
形式
综合性的一篇论文 分开的三次实验报告
实
验
结构上的完整性
报
文字 术语的正确使用
告
内容
图片
不同污染源导致的污染 不同生长情况的图片 不同愈伤组织的图片
悬浮振荡培养1周或更长
称重,计算细胞鲜重的增加(?g )
收集细胞,分离-提取-纯化胡萝卜素,并测定含量
10
2. 再分化诱导
• 8人/组 • 2-3瓶/人
建立起来的无菌培养物
无菌条件下切割分开
接种在分化培养基上
适当条件下培养1-3周 培养反应的观察
11
3 胡萝卜素的分离提取和含量测定
悬浮细胞的收集
细胞分裂、 分化调节
培养基： MS+2，4-D 0.5mg/L+KT
0.5mg/L
单细胞或细胞细胞团块的获得
方法（机 械和酶法）
液体培养
细胞活力 细胞分裂和生长 分化和代谢调节
6
做今天实验之前:
►前面实验的观察和数据收集 ------胡萝卜愈伤组织的诱导和生长反
应的观察 ►植物细胞工程实验部分实验报告的
3
由固体培养转向液体 培养，对细胞而言有 什么差别？
细胞悬浮培养的目的 和所需要的条件？
一个好的培养体系具 备什么样的特征？ 4
愈伤组织再分化的诱导
• 培养基： MS+2，4-D 0.5mg/L+KT
0.2mg/L
• 培养条件： ？
5
三 实验操作
1.悬浮培养体系的建立
外植体
无菌 脱分化
愈伤诱导 愈伤继代
16
感谢聆听
不足之处请大家批评指导
Please Criticize And Guide The Shortcomings
演讲人：XXXXXX 时 间：XX年XX月XX日
17
数据
存活率 污染率ຫໍສະໝຸດ 分析讨论 污染原因的分析 实验结果的分析
思考和讨论
9
具体操作：
1.悬浮培养 选择疏松性愈伤组织
• 8人/组 • 2瓶悬浮培养基/组 • 约1g 细胞/瓶
无菌条件下将愈伤组织的细胞轻轻地剥离和分开
单细胞或小细胞团块
接种入已预先称重的液体培养基,接种后再次称重,获得细胞的鲜重(1g 左右)
甲醇萃取 β-胡萝卜素
乙醚纯化 β-胡萝卜素 β-胡萝卜素含量的测定
12
悬浮细胞的收集
用纱布/滤纸过滤培养液收集细胞
待溶液完全过滤后称纱布/滤纸和细胞的重量
将细胞转移入圆底烧瓶后再次称纱布/滤纸重量 计算细胞鲜重
13
甲醇萃取 β-胡萝卜素
将收集好的细胞放入圆底烧瓶中 每克试样加10ml含10%KOH的甲醇溶液 水浴上加热(64.8度以上)避光回流30min
14
乙醚纯化
上清液（约10ml）放入分液漏斗 加入150ml乙醚振荡摇匀，静止分层
去除下层甲醇，保留上层乙醚溶液
倒入蒸馏瓶，蒸去乙醚，
残留物用4-5ml己烷溶解
15
结束语
当你尽了自己的最大努力时，失败也是伟大的， 所以不要放弃，坚持就是正确的。
When You Do Your Best, Failure Is Great, So Don'T Give Up, Stick To The End
2
二、实验原理
植物细胞的悬浮培养
• 胡萝卜愈伤组织经过多次继代，在细胞分裂， 细胞形态和分化方面会产生各种变化，合理 调节培养基中激素的种类和浓度配比，可以 诱导疏松性愈伤组织的产生。
• 利用愈伤组织获得单细胞或者小细胞团块， 可以建议细胞悬浮（大量）培养的初代培养 体系，并在此基础之上进行培养物的继代和 保持，进行有用次生代谢物的生产。