发酵法生产透明质酸

发酵法生产透明质酸

透明质酸(Hyaluronic acid,HA)是一种大分子的粘多糖,是一种由-D-N -乙酰氨基葡萄糖和β-D-葡萄糖醛酸为结构单元,β-1，4-糖苷键连接成的一种链状高分子粘多糖。其分子量在几十万到几百万之间，又称糖醛酸，透明质酸具有特殊的保水作用，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，被称为理想的天然保湿因子，为目前所公认的最佳保湿成分，在化妆品工业、医学研究、临床治疗等领域有广泛的应用。

透明质酸的提炼的方法有三种：组织提取，微生物发酵和化学合成。组织提取法和化学合成法的成本高，产量低，受原料资源限制，不能满足市场需求。而微生物发酵法生产透明质酸具有不受原料资源限制、成本低、产量高、有较高的相对分子量、分离纯化工艺简便、易于大规模生产等特点成为透明质酸生产的发展方向，因此开发先进的微生物发酵法生产HA的技术十分必要。目前HA产业前景广阔，发酵法己成为HA生产的主流工艺，而发酵法生产HA的工艺仍需进一步完善。

微生物产HA的研究可以追溯到上个世纪30年代，1937年，Kendall发现链球菌可以产生HA，后来发现主要是一些A群和C群链球菌，它们具有合成与代谢以HA为主要成分的荚膜的能力。随后很多人进行了大量的研究。研究结果证明某些种属链球菌在一定的环境条件下，能同化吸收葡萄糖或其他碳源，以代谢物形式产生HA。随后经过不断地选育菌种和优化工艺，借助现代深层发酵技术与设备，HA的微生物发酵法被建立和应用起来。目前多选用链球菌、乳酸球菌类等（因此以下均以链球菌举例说明）。日本用发酵法生产了HA制剂．并对该产品做了大量的药效、毒理、药代动力学等非临床实验和临床实验。结果表明，发酵法生产的HA无局部及全身毒副作用、安全性高、疗效确切。

发酵法生产透明质酸主要包括两部分：发酵部分和下游提取工艺部分。发酵法生产HA的质量主要取决于菌种、培养基和分离提纯工艺的选择。

一.发酵部分：

经过阅读与分析文献，我个人将发酵部分划分为以下几个模块：

1.菌种的筛选

2.菌种的诱变

3.培养基配方的优化

4.菌株的最佳培养条件

首先以链球菌制备HA的过程为例简单介绍一下发酵法生产透明质酸的基本流程：链球菌复苏培养后，用诱变剂诱变，挑出不溶血、不含HA酶的高产率菌株。进行稳定传代后增菌培养，所得的菌种即可作为生产菌株。放入发酵培养液后，在通风搅拌的情况下发酵40小时，对粘稠的发酵醪进行提纯分离等处理后得到分子量高、粘度大的HA。

下面我将针对这几个模块分别做详细的叙述与分析。

1.菌种的筛选：

优良的微生物菌种是发酵工业的基础，得到这类产物的两个成功要素在于产生菌的选择和筛选方案的确定。以目的代谢物透明质酸为目标筛选出能产生它的菌种是前提，设计出科学合理的筛选方案是事关筛选工作成败的关键。菌种初筛方法必须快捷、简便、有效，才能一次或多次从现有菌群中把多数无用的微生物淘汰掉，把少量有用的微生物筛选分离出来。经研究发现在牛鼻粘膜上分离到的HA产生菌种即乙型溶血性链球菌比较适合用来发酵。

1.1筛选步骤：

牛鼻粘膜--稀释分离涂平板--初筛菌株--复筛摇瓶发酵--发酵液离心--上清液乙醇沉淀--定性分析--获得目的菌株--斜面培养

1.2 菌种筛选操作方法：

1.2.1 初筛：

将牛鼻黏膜用0．1％蛋白胨溶液分成梯度涂于血琼脂平板，37℃，培养24h。观察各菌落在血平板上的溶血性和形态，用接种针挑起看其黏度。荚膜染色并镜检。

1.2.2 荚膜染色

抹片自然干燥，甲醇固定，以久贮的多色性美蓝液做简单染色。荚膜呈淡红色，菌体呈蓝色。菌落选择的依据：产生HA的菌落透明度很高，隆起，呈水滴状色泽近似蛋清。

1.2.3 复筛

发酵摇瓶中接人初筛疑似菌株，每株五瓶，在200 r/min、37℃下培养24h。取复筛发酵液100ml，离心4000 r/min，20min。上清液用三倍体积无水乙醇沉淀。沉淀物用红外吸收光谱作定性分析。

1.2.4 红外吸收光谱法

取HA 2mg，KBr压片，用IR一400红外分光光度计在4000—5000m-1范围内扫描。发酵液提取物的红外吸收图谱在3400 cm-1附近有强的OH伸缩振动的特征吸收，表明有多羟基结构；在2900 cm-1附近有CH2的伸缩振动，1620cm-1及1560cm-1附近有CO、CN的伸缩振动，表明存在着乙酰氨基结构；在1400cm-1和1320cm-1附近有COC 的伸缩振动和OH的弯曲振动偶合产生的两个吸收峰，表明存在着糖醛酸上解离羧基结构和多糖羟基结构。上述结果提示筛选菌株的产物呈较典型的HA红外吸收图谱。

1.2.5测定

通过测定各种物质的含量来判断筛选结果是否正确。

(1)HA中葡萄糖醛酸含量的测定。参照硫酸-咔唑法进行测定。

(2)菌体量的测定：采用紫外可见分光光度计法，将培养液稀释后，在660nm处测其OD值。

(3)HA含量测定：采用Bitter-Muir氏法。以葡萄糖醛酸标准品为对照，测得样品溶液中葡萄糖醛酸的含量。由于葡萄糖醛酸的含量占整个产量的48．38％，因此测得葡萄糖醛酸的含量除以48．38％，再乘以稀释倍数就可以得到HA 的产量。

(4)葡萄糖含量测定：采用3，5-二硝基水杨酸法。

(5)蛋白质含量：参照考马斯亮蓝法测蛋白质含量，以牛血清白蛋白(BSA)标准品做对照。

(6)相对分子质量测定：采用粘度法。使用0．5-0．6mm的乌式粘度计，参比液

为0．2mol／L氯化钠，测定温度30℃，三点外推出特性粘数[µ]，根据公式[µ]=3.6x10-4Mr的0.78次方，计算出产品的平均相对分子质量Mr。

2.菌种的诱变：

以链球菌为例，野生型的链球菌多会产生溶血素(Streptolysin)，溶血素混入成品HA，会使HA的品质降低。一般情况下不会超过2g/L，得到的HA分子量也很低,所以规模生产必须获得非溶血性的菌株。因此必须经过诱变等手段获得HA 产量高、优良性状稳定的菌株。诱变菌种的常规方法是以紫外线和γ射线为诱变剂的物理诱变方法和化学试剂如亚硝基胍、硫酸二乙酯等。但化学诱变剂污染环境、操作不安全，有待改进。诱变工作中，应该尽量利用菌落可以鉴别的特性进行初筛，把初筛选得菌株用摇瓶方法测定，可提高工作效率。

2．1 菌种诱变步骤

菌种--平面培养--同步培养--制备菌液--诱变处理--中间培养--稀释涂平板--突变株分离

--保藏及扩大试验

2．2 菌种诱变操作方法

2．2．1平面培养

将筛选的菌种挑取一环接种到平板培养基上，37℃，培养14—16h。

2．2．2同步培养

从平面培养基上菌落上挑取2-3环接种到盛有20ml培养基的250ml锥形瓶中，37℃振荡培养14—16h。

2．2．3制备菌液

将菌液进行离心3500r／min，离心10min后弃上清。供紫外线诱变处理的菌体用生理盐水洗涤2次，重新悬浮于5ml生理盐水中，摇匀后倒人盛有45mi灭菌生理盐水并带玻璃珠的100ml锥形瓶中，振荡10min，调整细胞浓度至10／ml。供NTG诱变处理的菌体用0．1mol/L，pH= 6．0磷酸盐缓冲液来代替生理盐水，其它同供紫外线诱变处理菌体的菌液制备。

2．2．4诱变处理

2.2.4.1紫外线诱变处理：

紫外线诱变的主要作用是使同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体，二聚体的出现会减弱双链间氢键的作用，并引起双链结构的扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起菌株的突变或死亡。

(l)预热紫外线：紫外灯功率15W，照射距离30 cm，照射前打开紫外灯预热20 min，使紫外线强度稳定。

(2)加菌液：两套标明1min和2min的无菌培养皿，分别加入3ml菌液和磁力搅拌棒。

(3)照射：将上述两套培养皿磁力搅拌器上，打开皿盖搅拌照射1min和2min。盖

上皿盖关闭紫外灯。

2.2.4.2NTG诱变处理：

(1)NTG溶液的制备：用分析天平称取1mg NTG于无菌离心管中，然后加入0．1 mol ／L，pH6．o磷酸缓冲液1ml，于暗处振荡溶解。

(2)诱变处理：取4ml菌液加人上述离心管中，充分摇匀，立即置于37℃水浴振荡处30min(NTG处理终浓度100；g／m1)后，离心收集菌体，将含NTG的上清液倒人浓NaOH溶液弃去，用无菌水洗涤菌体3次，以大量稀释法终止NTG的诱变作用，最后向离心管中加5ml无菌生理水。

2.2．5中间培养