喹诺酮类抗菌药耐药新机制

喹 诺 酮 类 抗 菌 药 耐 药 新 机 制

刘健华,陈杖榴

(华南农业大学兽医学院广东省兽药研制与安全评价重点实验室,广东广州510642)中图分类号:S859.7 文献标识码:E 文章编号:052926005(2007)0120054202

近年来喹诺酮类的耐药性问题备受关注。细菌对喹诺酮类的耐药机制过去普遍认为主要起因于染色体基因突变(靶位改变、主动外排和膜孔蛋白缺失),而不存在水平传播的可转移基因。近年来开始出现一些新的喹诺酮耐药机制,包括qn r、m f pA和氨基糖苷乙酰转移酶的变异基因(aac(6’)2Ib2cr)介导的喹诺酮耐药性,其中qn r和aac(6’)2Ib2cr位于质粒上,使得喹诺酮耐药性在人畜病原菌间的迅速扩散成为可能,更加严重地威胁感染性疾病的治疗。

收稿日期:2006207205

作者简介:刘健华(19732),女,副教授,博士,从事兽药安全评价和细菌耐药性研究;E2m a il:jh liu@scau.ed

通讯作者:陈杖榴,E2m a il:chenz l@scau.ed 现就近年来新出现的喹诺酮类耐药机制综述如下。1　qn r介导的耐药机制

1.1　qn r的发现及对喹诺酮类的作用机制　1998年M artinez等[1]首次报道从美国阿拉巴马州伯明翰医学中心分离的一株肺炎克雷伯氏菌中获得了一个有广泛宿主菌可转移喹诺酮类耐药性的质粒pM G252。将该质粒转入外膜孔蛋白缺失的肺炎克雷伯氏菌可使其对环丙沙星的M I C升高8～16倍,转入外膜孔蛋白正常的肺炎克雷伯氏菌可使其对环丙沙星的M I C升高32倍。含有该质粒的E.coli转化子其耐药性突变的频率比不含该质粒的菌株高100倍,且对环丙沙星的M I C从0.008m g L上升到0.25m g L。这一质粒在其他肠杆菌(如E.coli、伤寒

的检测准确性好。尿样经萃取处理后可去除一些干扰因素,其检测结果应更为可靠,对检测结果不相符的尿样进行萃取处理前后的检测试验说明,TCC、B I O 和DN试剂盒对低含量或阴性尿样的直接检测均存在非特异反应的情况。而CER试剂盒对阴阳性尿样的检测(包括经萃取处理的尿样)均呈阳性。分析认为,有两方面因素,一方面可能该试剂盒本身不适合用于尿样的直接检测;另一方面,该试剂盒的反应活性偏低,也可能影响了检测结果的准确性。我们共采用了6盒CER试剂(含3个批次),在试剂盒提供的操作程序的基础上,延长了个别反应步骤的时间,但不同试剂盒的0ng m l标准的OD值均只达到0.9～1.0ng m l。除了试剂盒自身因素,试剂在销售和运输过程中若储藏不当也可能造成反应活性偏低。

3.4　在实践工作中,确定合理阳性阈值对于EL ISA 结果判定非常重要。一般而言,将阳性阈值定得较高,可减少非特异反应的情况,但也可能造成一些低残留水平的样品漏检,给进出口把关带来风险。对阳性阈值的确定,需综合考虑所检测药物在动物体内的残留规律、试剂盒本身的特点、样品的前处理方法、把关要求等因素。

3.5　尿样的质量和前处理方法对检测结果也有较大影响。我们发现,一些用原液测得含量为10～50ng m l的尿样,经10倍稀释后用同一试剂盒测得含量为0,说明稀释处理可减少一些干扰因素。为保证检测质量,尿样应新鲜采集并注意低温保存。对尿样采用本研究介绍的有机溶剂萃取法或试剂盒提供的酶消化法进行前处理,也可进一步减少干扰因素。

4　小结

综上所述,根据本研究比对试验结果,并综合考虑试剂盒检测原理、质量、标准品设置、操作是否便利等因素,4种试剂盒当中,本研究推荐选用B I O试剂盒进行活动物莱克多巴胺残留快速检测。但B I O试剂盒对经简单处理的尿样的检测也存在非特异反应的情况。实际检测工作中,除通过设定合理阳性阈值、对尿样进行必要的前处理等方法以尽可能较少非特异干扰因素之外,还可对检测呈阳性的样品另用不同试剂盒检测,综合有关检测结果进行判定,必要时应采用色谱等方法对EL ISA结果进行确证。

参考文献:

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沙门氏菌、弗氏柠檬酸杆菌)和假单胞菌(如铜绿假单胞菌)都有广泛的宿主菌并能表达喹诺酮类耐药性[1]。质粒pM G252的存在既不改变宿主菌外膜蛋白的表达也不降低喹诺酮类在细胞内的聚积,说明此质粒介导了一种新的喹诺酮耐药机制。

为了证明这种新的喹诺酮耐药机制的存在, T ran和Jacoby[2]克隆了质粒pM G252上的喹诺酮类耐药基因qn r(现命名为qn r A),并成功表达出qn r A 蛋白,发现qn r A蛋白能够逆转喹诺酮类对DNA旋转酶的抑制作用。T ran等[3]进一步研究qn r A的作用机制,发现qn r A通过减少DNA促旋酶与DNA的结合达到降低喹诺酮类药物作用的全酶2DNA靶位,从而保护DNA促旋酶不被喹诺酮类抑制,qn r A 蛋白同样可以保护拓扑异构酶 [4]。M artínez2 M artínez等[5]将质粒pM G252转化到gy r A基因突变的菌株、接合转移到多重耐药操纵基因m a rR突变的菌株、转导入外膜蛋白(o m p)缺失的菌株,发现后者对喹诺酮类的M I C提高了4～128倍,提示qn r A能显著增强由于靶基因突变、外输泵激活及外膜孔蛋白缺失引起的耐药性。

qn r蛋白由218个氨基酸组成,属于五肽重复家族[2]。五肽重复家族有超过90个成员,特点是在一前一后重复出现A(D N)L XX,其中X代表某种氨基酸。在许多种细菌中发现这类蛋白,但在蓝细菌中最常见,既可作为膜蛋白,也可出现在细胞质中。

1.2　qn r A的基因环境　对不同来源的qn r A基因两侧的基因环境进行分析,发现qn r A基因位于基因结构不同的属In4家族的 类整合子上[2,6～8]。携带qn r A的 类整合子的基因结构类似于整合子In6和In7,共同结构从左到右依次为:5’2CS(含in tI1)、基因盒区、3’2CS1(含qacE△1和su l )、保守区CR1 (含orf513)、特异区域(含qn r和其他基因)、3’2CS2 (含qacE△1和su l ),除基因盒区域和特异区域外,其他基因结构都一样[2,6～8]。orf513以前叫orf341,编码捕获耐药基因的位点特异性重组酶,许多耐药基因(如编码Β2内酰胺类、氯霉素类、大环内酯类和四环素类等的耐药因子)发现与这种CR1和orf513有关,导致耐药基因播散。这些耐药基因盒,包括qn r A,都丢失了59碱基元件,说明orf513的作用很有可能是位点特异性捕获耐药基因[9]。qn r A的启动子序列与CR1的末端重叠,提示CR1在qn r A耐药基因的表达上起了一定的作用[6]。

1.3　qn r A类似基因　H ata等[10]在分离自日本的福氏志贺菌2b临床分离株中发现一种新的介导喹诺酮耐药性的qn r A类似基因(qn rS),这种基因位于可转移的大小为47kb的质粒上,编码的蛋白有218个氨基酸,与qn r A有59%的氨基酸同源性。qn r S与qn r A 一样仅介导低水平的喹诺酮耐药性。最近德国研究人员从禽源肠炎沙门氏菌中检测到qn rS基因(GenB ank登录号AM234722),这也是第一次有关动物源细菌出现质粒介导喹诺酮耐药性的报道。

近期Jacoby等[11]从肺炎克雷伯氏菌中发现又一质粒介导的喹诺酮耐药基因qn r B,其编码蛋白qn r B 同样属五肽重复家族,与qn r A有40%的氨基酸同源性,柯氏柠檬酸杆菌、阴沟肠杆菌、E.coli和肠炎沙门氏菌中也检测到qn r B[11,12]。从引起人类感染的非伤寒沙门氏菌中检测到qn r B,说明有可能通过食物传递过来,这将是一个重要的公众健康问题[12]。

1.4　qn r的起源　Po irel等[13]在研究qn r基因的起源时,发现海藻希瓦菌存在qn r A类似蛋白,与qn r A 仅有2～4个氨基酸的差异,说明qn r A来源于海藻希瓦菌。海藻希瓦菌属革兰氏阴性杆菌,广泛分布在海水和淡水环境中。从香港分离的肠炎沙门氏菌中检测到的qn r A类似蛋白与qn r A有3个氨基酸差异,与来自海藻希瓦菌的qn r A3完全一样[14]。此外,qn r A和qn rS与两种海洋病原性弧菌2明亮发光杆菌和创伤弧菌的一种蛋白也有一定的同源性,分别为66%、60%,64%和53%[15]。副溶血狐菌含有qn r A类似蛋白,与qn r A有58%的氨基酸同源性,与qn rS有56%的同源性[15]。以上研究提示我们不仅兽医领域的革兰氏阴性杆菌,而且环境中的革兰氏阴性杆菌也将成为人类病原菌耐药基因的储存库。喹诺酮类药物同样用于水产养殖,推测水中亚抑菌浓度的喹诺酮类药物可能会选择出水源海藻希瓦菌,从而促进喹诺酮耐药决定因子在自然环境条件下传递给肠杆菌科细菌[13]。

1.5　qn r的普遍性　目前有关由qn r引起可水平传播的喹诺酮耐药性的研究还较少,现有的研究结果也表明qn r的普遍性不高。到目前为止,先后有10个国家和地区(美国、中国内地、埃及、法国、日本、德国、韩国、土耳其、英国和中国香港)发现了可转移喹诺酮耐药性的质粒,大部分由qn r A基因介导,国内先后从上海、安徽和江苏无锡分离的细菌中检测到qn r A基因。qn r A基因从肺炎克雷伯氏菌、E.coli、弗氏柠檬酸杆菌、产酸克雷伯菌、阴沟肠杆菌、斯氏普罗维登斯菌和肠炎沙门氏菌等多种细菌中检出。qn r B和qn rS的报道还较少。

2　mf pA介导的耐药机制

m f pA是在研究喹诺酮类的外排泵时从耻垢分支杆菌基因组中克隆出来的一个蛋白,介导了一种新的喹诺酮耐药机制。M on tero等[16]在野生型耻垢分枝杆菌基因组中筛选到介导喹诺酮耐药的开放阅读框m f pA,m f pA编码的蛋白在多拷贝质粒中表达时,可导致耻垢分枝杆菌对环丙沙星和司帕沙星低水平耐药(M I C升高4～8倍)。在结核分枝杆菌中也发现了m f pA蛋白的类似蛋白2含有183个氨基酸残基的