基因工程实验报告

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基因工程实验报告

、

小麦GAPDH截短体的重组与表达

摘要：本实验通过基因工程（genetic engineering）手段对小麦总RNA进行提取、PCR扩增及与质粒载体的重组构建的操作，并将重组质粒以氯化钙法导入大肠杆菌感受态细胞，诱导目的基因表达，并在蛋白水平进行Western检测。通过本对实验的实践，我们对基因工程技术将会有一个比较全面的认识和了解。

关键字：小麦基因；载体；感受态

前言

基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术。为在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。它克服了远缘杂交的不亲和障碍。

（一）实验过程

1.实验部分流程：

片段胶

小麦幼苗小麦总RNA

RT-PCR扩增小麦pGEX-4T-1

表达载体

表达菌株

目的蛋白

目的蛋白

Western

2．小麦总RNA提取（Trizol法）

2.1 材料

小麦幼苗

2.2 试剂配制及器具处理

① 0.1％的DEPC H2O（DEPC：焦碳酸二乙酯）

②器具处理：试剂瓶、量筒、研钵、大小枪头和1.5ml和0.2ml 的EP管等用纱布包裹，在

0.1％的DEPC H2O中浸泡过夜（37℃），高压灭菌，80℃烘干备用。剪刀、镊子和药匙等160℃烘烤6h以上。

③无RNA酶灭菌水（DEPC H2O）：用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃×2h）装蒸馏水，然后加入

0.1%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。

④Trizol

⑤ 75%乙醇：用新打开的无水乙醇和DEPC处理过的水配制75%乙醇（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。

⑥氯仿(最好用新的)。

⑦异丙醇(最好用新的)。

2.3 操作步骤：

①先在研钵中加入液氮，再将小麦叶片剪成小段在液氮中磨成粉末，用液氮预冷的药匙取50～100mg组织粉末加入已盛有1ml的Trizol液的EP管中（注意研磨粉末总体积不能超过所用Trizol体积的10%），充分混合均匀。

②室温放置5min，然后加入200µL的氯仿，盖紧EP管并剧烈摇荡15秒钟。

③ 12000rpm离心10min，取上层水相于一新的EP管中（千万不要将中间的沉淀层和下层液混入，否则重新离心分离），加入500µL异丙醇，温和颠倒混匀。室温放置10min，12000rpm 离心10min。

④小心地弃去上清液，加入1ml的75%乙醇，涡旋混匀，4℃下12000rpm离心5min。

⑤重复步骤④。

⑥弃去上清液（尽量将残余液体除去），室温或真空干燥5～10min（注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度）。用30µL DEPC处理过的水将RNA溶解，必要时可55℃～60℃水浴10min。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。

3. RT-PCR扩增目的基因cDNA

3.1 试剂

① RNA模板

②Olig（dT）18

③反转录缓冲液

④dNTP

⑤ M-MULV反转录酶

⑥ RNA抑制剂（RNasin）

⑦Premix EX Taq DNA聚合酶

⑧ PCR特异引物

3.2操作步骤：

3.2.1 RNA的反转录

采用Thermo Scientific（Fermentas）RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit Total RNA 6µL（需加入RNA约1μg）

OligodT primer 1µL

H2O（nuclease-free）5µL

12µL

65℃ 5min，补加下列试剂：

5× Reaction buffer4µL

RibolockRNase Inhibitor 1µL

10mM dNTP Mix 2µL

RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase 1µL

20µL

42℃ 60min

70℃，5min，﹣20℃保存

3.2. 2 PCR 扩增目的基因

用表达引物扩增目的基因（25µL 体系）

2×PCR Mix 12.5µL 95℃ 1min

95℃ 10s 58℃ 20s 72℃ 45s 72℃ 10min 16℃∞

cDNA 1µL 引物GA22PDH1-1 1µL 引物GAPDH1-2 1µL H 2O 9.5µL total 25µL

PCR 产物经胶回收。 4．核酸琼脂糖电泳分析 4.1 试剂

① TAE 缓冲液（50×）：用时需稀释50倍 ② 点样缓冲液Loading buffer （10×）：含0.25%溴酚蓝和40%甘油 ③ 溴乙啶染色液(EB)：10mg/ml 溴乙啶，注意EB 具致癌作用。 ④ 琼脂糖 4.2 操作步骤

4.2.1 琼脂糖凝胶的制备

称1g 琼脂糖加入100ml TAE 缓冲液中加热熔化。 4.2.2 胶板制备

将凝胶槽清洗干净，在一端插好梳子。然后倒入熔化好的琼脂糖，待凝胶完全凝固后，将凝胶槽移至电泳槽（槽中已加入TAE 缓冲液），拔掉梳子。注意：缓冲液要高出胶面2mm 。 4.2.3 点样

每个样品中加入1/10体积Loading buffer （10×），混匀后小心地加入点样孔中，要避免相互污染。 4.2.4 电泳

接通电源，80V 电压电泳40min 左右，当溴酚蓝到达凝胶前沿约2㎝处时停止电泳。 4.2.5 观察及照相

将凝胶取出，在EB 溶液中浸泡10min 后，用凝胶成像系统照相。 5.pGEX 4T-1质粒的提取 5.1 实验材料 含质粒的大肠杆菌

5.2 试剂

质粒提取试剂盒(天根生物科技)

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