基因工程实验流程 PDF版
基因工程 实验报告
基因工程实验报告学号姓名1实验目的（1）学习并掌握基因工程操作技术中最常用的载体质粒DNA的提取方法。
（2）学习琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法，检测质粒DNA的浓度与分子量。
（3）了解PCR的基本原理，掌握PCR的基本操作技术。
（4）学习利用限制性内切酶切割DNA的方法，并通过电泳检测酶切的效果。
（5）学习DNA重组技术中的核心步骤，DNA片段之间的体外连接方法。
（6）学习制备感受态细胞并将体外重组DNA引入受体细胞的技术。
（7）掌握利用蓝白斑筛选出转化子的方法。
2 实验原理2.1质粒DNA提取的原理菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，双链DNA氢键断裂，DNA双螺旋结构遭破坏而发生变性，但由于质粒DNA分子量相对较小，且呈环状超螺旋结构，即使在高碱性pH条件下，两条互补链也不会充分分离，当加入中和缓冲液调时，变性质粒DNA又恢复到原来的构型；而线性的大分子量的细菌染色体DNA则不能复性，与细胞碎片、蛋白质、SDS等形成不溶性复合物。
当加入中和溶液后，质粒DNA能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；变形的蛋白质和DNA呈絮状，离心时可以沉淀下来。
碱裂法获得的质粒DNA 经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀除去残余的蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA可满足实验要求。
2.2 PCR扩增功能基因的原理将反应体系(模板DNA、引物1、引物2、Mg2+、4种dNTP和Taq DNA聚合酶)置于高温(94℃)下变性，使模板双链DNA解链为两条单链。
在低温(37~65℃)下退火，使引物与模板链3’端结合，形成部分双链DNA。
在中温(~72℃)下，通过Taq DNA聚合酶使引物从5’端向3’端延伸，随着4种dNTP的掺入合成新的DNA互补链，完成第一轮变性、退火和聚合反应循环。
反复进行这种变性、退火和聚合反应循环，可使两端引物限定范围内的DNA 序列以指数形式扩增。
循环的次数主要取决于模板的浓度，从理论上将一个目的DNA分子经20轮扩增后，可达106。
基因工程试验指导
《基因工程》实验指导湖南师范大学生命科学学院遗传与发育生物学系2009年5月基因工程课程综合实验---转基因斑马鱼的构建一、实验目的本课程的教学目的是让学生对基因工程技术所涉及的主要环节的基本原理、完整流程和基本技术进行系统地学习和掌握，培养学生具有通过这些原理进行基因工程实验和研究方面的设计能力。
在基因工程理论课程的讲授和实践课程的实际操作过程中对学生进行基因操作与社会伦理方面的训练和教育，重在素质和能力的培养。
二、实验原理转基因动物（transgenic animal）是指动物所有细胞基因组中整合有外源基因的一类动物，具有将外源基因遗传给子代的能力，整入动物基因的外源基因被称为转基因（transgene）。
转基因动物技术是常规分子生物学技术的延伸和拓展，是基因工程技术的核心内容之一，它不仅为人们研究生命科学提供了一个更有效的工具，转基因技术是生物学领域最新重大进展之一，已能渗透到生物学、医学、畜牧学等学科的广泛领域。
转基因动物已成为探讨基因调控机理、致癌基因作用和免疫系统反应的有力工具。
同时人类遗传病的转基因动物模型的建立，为遗传病的基因治疗打下坚实的理论和实验基础。
转基因技术涉及外源基因的获取、重组载体的构建与检测鉴定、受体系统的准备、显微注射基因导入、供转基因胚胎发育的体外培养系统和宿主动物的饲养等方面的内容。
三、材料限制性内切酶：Eco R I、Sal I、Age I、Not I、Bam H I；T4 DNA聚合酶；LA DNA聚合酶混合物均为大连TaKaRa公司产品；3. 2菌株及细胞系DH5α感受态细胞：由本实验室自行制备并存于-20℃；3. 3 质粒与表达载体系统3. 3.1 pEGFP-N1载体pEGFP- N1载体是一种把异源性的蛋白质融合至EGFP的N端的哺乳动物表达载体，为Clontech公司的产品。
含有人类巨细胞病毒（CMV）启图1 含有绿色荧光蛋白基因的卡那霉素抗性的pEGFP-N1质粒动子，SV40 Poly A尾，pUC复制起始点（原核）和SV40复制起始点（真核），20个多克隆位点，具有筛选标志卡那霉素（原核）和新霉素（真核）的抗性基因，见图1。
基因工程-基因工程的基本操作程序1
步骤三：目的基因导入受体细胞
• 常用的受体细胞： 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、
酵母菌和动植物细胞等。
• 将目的基因导入受体细胞的原理 借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。
①直接导入法有电击、显微注射、直接吸收、基因枪等 方法。
（1）电击法：借助电击仪高压脉冲把目的基因打入宿主细胞。 （2）显微注射法：利用微量注射器在显微镜下直接把目的基因注 入宿主细胞。 （3）直接吸收法：把目的基因和宿主细胞混在一起，让其吸收。 （4）基因枪法：在金属微粒上涂一层目的基因，然后发射到宿主 细胞中。
步骤二：基因表达载体的构建
1）用一定的限制酶切割质粒，使其出现一 个切口，露出黏性末端。
2）用同一种限制酶切断目的基因，使其产 生相同的黏性末端。
3）将切下的目的基因片段插入质粒的切口 处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重 组DNA分子（重组质粒）
目的基因与运载体的结合过程，实际 上是不同来源的基因重组的过程。
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1.将目的基因导入植物细胞
2.将目的基因导入动物细胞
3.将目的基因导入微生物细胞
大肠杆菌细胞最常用的转化方法是:
首先用Ca2+ 处理细胞,以增大细菌细胞壁的 通透性,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分 子的生理状态,这种细胞称为感受态细胞.
基因工程实验流程
基因工程实验注意事项1．上实验课不能迟到。
上实验课不能迟到。
2．一定要提前预习实验内容，弄懂实验原理，理清实验顺序。
根据实验内容和步骤制定一个详细的试验计划（没有计划或计划不合理者不能进入实验操作）。
3．实验指导中所写的实验一、实验二等并非严格的实验顺序，只是提供一种相关的实验操作技术。
各小组学生需要根据整体的实验策略制定自己的实验顺序和计划。
作技术。
各小组学生需要根据整体的实验策略制定自己的实验顺序和计划。
4．由于实验内容多，时间短，多数实验需要同时或穿插进行，一定要做好统筹安排。
由于实验内容多，时间短，多数实验需要同时或穿插进行，一定要做好统筹安排。
5．本实验课中的所有实验都属于从克隆到表达的整体流程，时间上没有上下午晚上休息等本实验课中的所有实验都属于从克隆到表达的整体流程，时间上没有上下午晚上休息等严格的作息安排，一切服从实验进度，但必须在10天之内完成。
天之内完成。
6．实验的每一步都要详细地记录操作内容、时间、步骤、结果等，以备查询！7．对任何自己不熟悉的实验仪器都不要随意操作（尤其是微量移液器！）。
在操作的过程中发现任何意外的现象都要及时向任课教师汇报。
发现任何意外的现象都要及时向任课教师汇报。
8．写作实验报告一定要文字整洁，观察记录详细（包括操作的错误），分析现象透彻。
，分析现象透彻。
9．在实验室内不能大声喧哗。
在实验室内不能大声喧哗。
10．在实验的过程中制造的任何垃圾都要丢到垃圾筐里（或先放在自己的桌面一角），严禁随地投弃！随地投弃！11．实验结束后要把用过的器皿清洗后归放整齐并清点数目，向教师汇报征得同意后方可离开实验实。
开实验实。
12．值日组的同学最后离开，等待清扫实验室的卫生，关闭门窗水电。
．值日组的同学最后离开，等待清扫实验室的卫生，关闭门窗水电。
13．实验时损坏的任何物品都要按规定赔偿。
．实验时损坏的任何物品都要按规定赔偿。
实验流程参考图PCR 扩增NK 制备感受态菌DH5a, BL21 提质粒pMD18-T-NK ，pET-his ，EcoRI+BamHI 酶切酶切与pUCm-T 连接连接转化DH5a 筛选鉴定筛选鉴定提质粒pUCm-T-NK 回收pET-his EcoRI+BamHI 酶切酶切回收NK 片断片断 pET-his-NK 诱导表达诱导表达SDS-PAGE 鉴定鉴定转化DH5a 连接连接pET-his pMD18-T-NK DH5a BL21 筛选鉴定筛选鉴定提质粒pET-his-NK 转化BL21 第一部分质粒DNA的提取和酶切电泳鉴定实验一质粒DNA的小量制备1．目的学会最常用的小量制备质粒的DNA的碱裂解方法。
基因工程实验报告的实验步骤
实验一：大肠杆菌5 a和21感受态细胞的制备【实验步骤】1从平板上挑取新活化的大肠杆菌 5 a单菌落，接种到5培养基中，37C振荡培养过夜。
2取1培养物接种到100培，养基（250三角瓶）中，37C振荡培养2~3h。
3将菌液转移到50离心管（2管）中，冰上放置15。
4 4C 4000离心5,弃去上清液，倒置使培养液流尽。
5用20冷2溶液悬浮菌体沉淀合并成一管，在4C 4000离心5,弃去上清液。
6用10冷2溶液悬浮菌体沉淀，冰浴30。
7 4 C 4000 离心5，弃去上清液，用2的冷2溶液悬浮。
8分装到数个管中，每管200，冷冻保存备用。
实验二：目的基因质粒（或218）和表达载体质粒（32或30）的转化及大量提取【实验步骤】一、载体的转化（无菌条件，冰上进行）1、取200新鲜制备的感受态细胞，分别加入质粒 2 （32a, 18），混匀，冰上放置30。
2、将管放到42C保温90s,冰浴2。
3、加入800液体培养基，37 C慢摇复苏1 h。
4、将100的复苏细胞涂布在含有（100）的培养皿中，正置平皿30 （使菌液被培养基吸收）。
5、倒置平皿37C培养16 h，出现菌落。
二、质粒的提取1挑取单菌落接种于100加入50的液体培养基中，振荡培养过夜。
2过夜培养的菌液加入1.5的小指管（20个每组）中，每次1 , 4 C, 12000，离心1 ,4次，弃上清。
3加入150溶液I悬浮细胞，漩涡振荡，室温静置10。
4加入350溶液H （新鲜配制），轻微颠倒混匀20次，冰浴5。
（不能再剧烈震荡）5加入300溶液川（冰上预冷），颠倒混匀20次，不能剧烈震荡，冰浴10。
6 4 C, 12000，离心10，取上清转移至另一离心管中。
7向上清中加入0.6倍异丙醇，轻轻混匀，室温静置20。
8 4 C, 12000，离心10，弃上清，倒扣于吸水纸上，吸净液体。
9用1 70%乙醇洗涤质粒沉淀2次，每次4 C, 12000，离心3，吸去上清。
基因工程实验报告的实验步骤
实验一：大肠杆菌DH5α和BL21感受态细胞的制备【实验步骤】1 从LB平板上挑取新活化的大肠杆菌DH5α单菌落，接种到5mL LB培养基中，37℃振荡培养过夜。
2 取1mL培养物接种到100mL LB培养基（250mL三角瓶）中，37℃振荡培养2~3h。
3 将菌液转移到50mL离心管（2管）中，冰上放置15min。
4 4℃4000 rpm 离心5min，弃去上清液，倒置使培养液流尽。
5 用20 mL 冷CaCl2溶液悬浮菌体沉淀合并成一管，在4℃4000 rpm 离心5min，弃去上清液。
6 用10 mL 冷CaCl2溶液悬浮菌体沉淀，冰浴30min。
7 4℃4000 rpm 离心5min，弃去上清液，用2 mL的冷CaCl2溶液悬浮。
8 分装到数个EP管中，每管200 uL，冷冻保存备用。
实验二：目的基因质粒（T-SOD或T-IL218）和表达载体质粒（PET32或PET30）的转化及大量提取【实验步骤】一、载体的转化（无菌条件，冰上进行）1、取200 uL 新鲜制备的感受态细胞，分别加入质粒DNA 2 uL（PET32a，IL-18），混匀，冰上放置30min。
2、将EP管放到42℃保温90s，冰浴 2min。
3、加入800uL LB液体培养基，37℃慢摇复苏1 h。
4、将100 uL 的复苏细胞涂布在含有Amp（100mg/mL）的LB培养皿中，正置平皿30min （使菌液被培养基吸收）。
5、倒置平皿37℃培养16 h，出现菌落。
二、质粒的提取1 挑取单菌落接种于100 mL 加入50uL Amp 的LB液体培养基中，振荡培养过夜。
2 过夜培养的菌液加入1.5 mL的小指管（20个每组）中，每次1 mL，4℃，12000 rpm，离心1min，4次，弃上清。
3 加入150uL溶液Ⅰ悬浮细胞，漩涡振荡，室温静置10min。
4 加入350uL溶液Ⅱ（新鲜配制），轻微颠倒混匀20次，冰浴5min。
基因工程操作步骤
4.目的基因的检测与鉴定 在受体细胞中稳定遗传和正 确表达。
一、目的基因的获取
1 目的基因主要是编码蛋白质的基因： 如：与生物抗性相关的基因、与优良品质相 关的基因、与生物药物和保健品相关的基因、 与毒物降解相关的基因、与工业用酶相关的 基因、具调控作用的因子等。
合成
热稳定的DNA聚合酶
特点
半保留复制、 边解旋变复制
半保留复制、 全解旋再复制
结果
形成整个DNA分子
大量的DNA片段
随堂闯关 PCR技术扩增过程
a、DNA变性（90℃-95℃）: 双链DNA模板 在热作用下， 氢断键裂，形成____单__链_
b、复性（55℃-60℃）: 系统温度D降N低A ，引物 与DNA模板结合，形成局部__双__链____。
③例: 转基因抗虫棉
2.将目的基因导入动物细胞
①方法: 显微注射法
①程序
目的基因表达载体提纯
显微注射
受精卵
取卵（受精卵） 新性状动物
3.将目的基因导入微生物细胞
①微生物作受体细胞原因:
繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少
②常用菌: 大肠杆菌
③常用法: Ca2+处理获得感受态细胞
④过程:
Ca2+处理 大肠杆菌
1.2 基因工程的基本操作程序
知识回顾: 基因工程基本操作的四个步骤
有了目的基因, 我们才能赋予
1.目的基因的获取 一种生物以另一种生物的遗 传特性。
使目的基因在受体细胞中稳
2.基因表达载体的构建 定存在, 并可进行遗传、表达 和发挥作用
载体进入受体细胞稳定表达,
3.目的基因导入受体细胞 才能实现一种生物的基因在 另一种生物中的转化。
基因工程实验的详细步骤
基因工程实验实验一、质粒DNA的提取、分离和纯化试剂A.LB液体培养基（L）: 1000ml蛋白胨（tryptone）10g,酵母提取物（yeast extract）5g,NaCl 10g,加去离子水至1000ml用5MNaOH调至pH7.2-7.5。
121o C高压下蒸汽灭菌20分钟。
B.LB固体培养基（L）：每升液体培养基加15g 琼脂粉，高压下蒸汽灭菌20分钟。
C.氨苄青霉素（Amp）母液：配成50mg/ml水溶液，-20 o C下保存备用。
Amp使用时配成100mg/ul,按千分之一加入培养基中。
D.溶液I：50mmol/L葡萄糖、25mmol/L TrisCl (pH8.0), 10mmol/LEDTA(pH8.0). 高压蒸汽灭菌15分钟, 储存于4 o C冰箱。
E.溶液II：0.2mol/L NaOH (临用前用10 mol/L NaOH母液稀释)， 1%SDS.F.溶液III: 5mol/L KAC 60ml, 冰醋酸 11.5ml, 水28.5ml.G.RNase A母液：将RNase A酶粉溶于10mmol/L TrisCl (pH7.5)、15mmol/LNaCl, 终浓度为10mg/ml。
100 o C加热15分钟，冷却后分装。
H.饱和酚：市售酚需重蒸。
重蒸后加0.1%8-羟基喹啉，并用等体积的0.5mol/L TrisCl (pH8.0)和0.1mol/L TrisCl (pH8.0)缓冲液反复抽提，使pH达到7.6以上。
I.氯仿：按氯仿/异戊醇=24：1混合。
J.酚/氯仿：将上述饱和酚和氯仿按1：1混合。
K.TE缓冲液：10mol/L TrisCl (pH8.0)， 1mmol/L EDTA(pH8.0). 高压蒸气灭菌15分钟, 储存于4 o C冰箱。
三、操作步骤1．细菌的培养和收集：将含有质粒pBS的DH5α菌株接种在LB固体培养基（含50μg/ml Amp）中，37o C培养12-24小时。
基因工程技术操作具体流程
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基因工程的基本操作程序
适温延伸（在Taq酶的作用下合成 与模板互补的DNA双链）
重复循环
3 工程项目管理规划
2、具体过程
3 工程项目管理规划
PCR(多聚酶链式反应)
3 工程项目管理规划
① 概念：PCR全称为_聚__合__酶__链__式__反__应__，是一项 在生物_体__外_复制_特__定__D_N_A_片__段_的核酸合成技术
鉴定—— 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
3 工程项目管理规划
归纳: 基因工程的基本操作程序1. 获取目的基因 从基因 利用PCR技术扩增 化学方法人工合成
2. 构建基因表达载体 目的基因、启动子、终止子、标记基因
3. 将目的基因导入受体细胞 农杆菌转化法、显微注射法
4. 目的基因的检测与鉴定 检测：是否插入、转录、翻译 鉴定：
③.使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂 交带,表明染色体已插入染色体DNA中
3 工程项目管理规划
3 工程项目管理规划
归纳步骤
DNA分子杂交示意图
采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分 子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补 的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合 在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序 列的部位，仍然是两条游离的单链。
3 工程项目管理规划
3 工程项目管理规划
归纳步骤
(四)目的基因的检测与鉴定
——检查是否成功
检测—
①检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因 方法—— DNA分子杂交
②检测目的基因是否转录出了mRNA 方法—— 分子杂交（注意与上不同之处）
③检测目的基因是否翻译成蛋白质 方法—— 抗原抗体杂交
3 工程项目管理规划
基因工程实验流程
DEPC 、 RNase-free DNase I 、 RNase-free 耗材
离心机、旋涡混匀器
洗脱
去盐和回收
三、目标片段的克隆和 • 目标基因的获得； • 通过噬菌体载体自切割或T-Vector、平末端载体 克隆获得目标质粒； • 利用测序仪和通用引物对克隆的目的基因测序；
一、实验起始材料的选取和准备
人工气候箱、制冰机 分离准备工作
超净工作台、显微操作系统
水稻卵细胞的分离 RNase 抑制剂
RNase-free 耗材、液氮罐
材料的速冻
超低温冰箱
长期保存
二、卵细胞mRNA的提取、纯化
200℃ 烘箱 Oligotex系列试剂盒
细胞裂解
旋涡混匀器
离心机 恒温水浴锅
匀浆 去蛋白和细胞残渣
限制性内切酶、过滤柱
琼脂糖
培养基 DMSO
2.目标基因的克隆
• 利用特异探针，通过核酸杂交的方菌斑通过印迹转于尼龙膜，并于核酸交联仪中固定。在杂 交箱中利用特定探针杂交。最后在恒温摇床中洗膜（探针标记：放射性和非 放射性） 将噬菌体培养于平板，于42℃培养几小时后，于37℃用IPTG诱导融合蛋白的 表达并印记于尼龙膜上，利用抗原-抗体反应进行杂交
玻璃珠进行涂布。涂布均匀后将平板倒臵放于37OC培养箱内过夜培养。
第二天从转化的平板上挑去白色的菌落以验证是否是阳性克隆
V. 克隆的筛选与鉴定
1. 用移液枪在1.5mlEP管中加入液体LB培养基500ul，再用灭过菌的牙签
在生长蓝白斑的平板上挑取阳性克隆放于EP管中，丢弃牙签，盖紧
管口，用报纸包好放到37OC，200r/min的摇床中过夜培养； 2. EP管出现混浊，用质粒提取试剂盒提取质粒。 3. 对于得到的质粒再酶切电泳检测阳性克隆，如果酶切后的电泳图上 出现了与插入片断相应大小的条带，证明是此单菌落是阳性克隆，
基因工程实验报告
基因工程实验技术实验报告百度ID：龍吟EX炫1 材料和方法1.1 实验材料1.1.1 实验对象实验室提供的小鼠；含pGEX 4T-1质粒的大肠杆菌BL21 (DE3)，大肠杆菌Top10。
1.1.2 试剂LB液体培养基，LB固体培养基，0.1% DEPC水，无水乙醇，氯仿，异丙醇，Trizol，Olig(dT)18，反转录缓冲液，dNTP，M-MULV反转录酶，RNA抑制剂，2×PCR Mix，Olig(dT)18引物，表达引物EB3、EB4，5×TBE缓冲液，10×Loading buffer，核酸染料Super Gel Red，琼脂糖，Bam H I，Sal I，Bam H I buffer，10×ligation缓冲液，T4 DNA连接酶，ddH2O，氨苄青霉素，IPTG，30%丙烯酰胺，1.5mol/L和0.5mol/L Tris-HCl，10% SDS，10%过硫酸铵溶液，染色液，脱色液，TEMED，Tween-20，DAB工作液、显色液，TIANGEN胶回收试剂盒，TIANGEN质粒提取试剂盒。
1.1.3 仪器高速冷冻离心机，核酸电泳设备，PCR扩增仪，恒温水浴锅，凝胶成像系统，蓝光切胶仪，无菌操作台，恒温摇床，蛋白电泳设备，电转移设备，移液枪1.2 方法1.2.1 实验材料的处理对小鼠进行处死，解剖并取出肝脏组织，备用。
1.2.2 Trizol法提取总RNA将组织剪成小块在液氮中磨成粉末，取50～100mg加入已盛有1ml Trizol离心管中，轻轻混合以排除气体，再充分混匀；室温放置5min，然后加入200μl氯仿，盖紧离心管，并剧烈摇荡15秒钟；12,000rpm离心10min，取上层水相到新的离心管中，加入500μl异丙醇，温和颠倒混匀。
室温放置10min后12,000rpm离心10min；小心地弃去上清液，加入1ml DEPC水配制的75%乙醇，颠倒混匀，12,000rpm离心5min，再重复一次上述操作；弃去上清液，室温或真空干燥3～5min，后用30μl DEPC水溶解RNA。
（整理）基因工程试验.
（整理）基因⼯程试验.基因⼯程实验流程实验⼀丹参总DNA的提取实验⽬的：掌握从植物或动物的组织（细胞）中抽提DNA的⽅法。
实验材料：丹参叶⽚实验器材：台式离⼼机，恒温⽔浴锅，电泳仪，研钵和杵，离⼼管，微量移液器，枪头实验步骤：第⼀次使⽤前请先在漂洗液WB和结合液PQ中加⼊指定量的⽆⽔⼄醇，充分混匀，加⼊后请及时在⽅框打钩标记已加⼊⼄醇，以免多次加⼊!取所需适量裂解液PL放置在65℃预热，使⽤前加⼊β-巯基⼄醇到终浓度2%。
1.取适量植物组织（新鲜组织100mg 或⼲重组织30 mg）在研钵中加⼊液氮充分碾磨成细粉。
2.转移细粉到⼀个1.5ml离⼼管，不要解冻，加600µl 65℃预热的裂解液PL (确认已加⼊β-巯基⼄醇⾄2%)，剧烈涡旋振荡混匀，⽤⼤⼝径枪头轻柔吹打帮助裂解。
如果组织裂解困难，可根据需要加⼀个轻柔匀浆10秒的步骤帮助裂解。
3.65℃⽔浴20-60分钟，在⽔浴过程中颠倒离⼼管以混合样品数次。
可选如果组织⼲燥或者产量低，可以适当延长⽔浴时间。
如RNA残留多，可在⽔浴前加⼊6µlRNA酶（20mg/ml）。
4.加⼊700µl氯仿/异戊醇（体积⽐24：1混合），颠倒充分混匀⼏分钟（或者涡旋混匀），13,000rpm 离⼼5分钟。
若提取的植物组织富含多糖多酚，可以在第4步前⽤等体积酚/氯仿（1：1）抽提⼀遍。
5.⼩⼼吸取上清到⼀个新的1.5ml离⼼管，注意不要吸到界⾯物质。
如上清⽐较浑浊，则需要重复步骤4⼀遍，直到得到透亮上清。
6.较精确估算上清量，加⼊1.5倍体积结合液PQ （请先检查是否已加⼊⽆⽔⼄醇!）后⽴刻涡旋，充分混匀。
此时可能出现沉淀，但不影响实验结果。
7.将上⼀步所得混合物（包括可能出现的沉淀）加⼊⼀个吸附柱AC中，（吸附柱放- 5 - ⼊收集管中）13,000rpm离⼼30秒，倒掉收集管中的废液（先加700µl离⼼，弃废液，再加⼊剩余的溶液，再次离⼼）。
基因工程的基本操作程序
基 因 工 程 的 基 本 操 作 程 序
含目的基因 的表达载体
显微 注射
动物的 受精卵
早 期 胚 胎
移 植
分裂 分化
含目的基因 的受精卵
雌性动物输 卵管或子宫
陕 西 师 大 附 中
发 育
转基因 动 物
问题
为什么将目的基因导入动物细胞常用的受体细胞 是受精卵？ 是受精卵？
（三）导入微生物细胞
陕 西 师 大 附 中
基 因 工 程 的 基 本 操 作 程 序
质粒
重组DNA 重组 限制酶
目的基因
陕 西 师 大 附 中
DNA连接酶 连接酶
（一）构建目的
基 因 工 程 的 基 本 操 作 程 序
使目的基因在受体细胞中稳定存在， 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可遗传给下 一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。 一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。
用适当 限制酶切割
许多 DNA片段 片段
与载体录酶 核酸酶H 核酸酶 DNA聚合酶 聚合酶 与载体连接 导入受体菌群 mRNA 杂交双链 单链DNA 单链 双链DNA 双链
基 因 工 程 的 基 本 操 作 程 序
1. 过程
Ca2+ 处理法
处理细菌， （1）制备感受态细胞：用Ca2+（CaCl2）处理细菌，使细菌易 制备感受态细胞： 于接受外源DNA分子。 于接受外源DNA分子。 DNA分子 （2）重组DNA分子与感受态细胞混合孵育，完成转化。 重组DNA分子与感受态细胞混合孵育，完成转化。 DNA分子与感受态细胞混合孵育
陕 西 师 大 附 中
（一）分子水平
基 因 工 程 的 基 本 操 作 程 序
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u 倒掉上清，加入750微升的wash buffer ,12000r/min离心1分钟； u 倒掉上清，重复步骤三；
u 倒掉上清，在12000r/min下空转1分钟；
u 把带有膜的管子换到新的EP管中，加入30~50微升的水，静置1分钟， 12000r/min离心一分钟，即得到所要回收的片断。此样品可用来做酶 切等。
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u 电泳染色后，在紫外分析仪上切取所需要的条带，按1克胶：1000添加
ØIV. DNA片段的体外重组
心，用封口胶封口。
u 将EP管放入金属浴当中37度酶切两个半小时左右，取出酶切产物，用 试剂盒进行割胶回收进一步纯化酶切片断以进行连接反应。 酶切体系： 40.0ul ddH2O 9.0ul 连接体系： （20.0ul） 10×Buffer 4.0ul 酶切产物 3.0ul DNA 25.0ul Buffer 1.0ul Xba I、 1.0ul 载体 14.0ul Hind III 1.0ul Liagse 2.0ul u 连接反应：
限制性核酸内切酶酶切分离法简单基因组分离如质粒和病毒
目的基因制备
基因定位克隆 酵母双杂交
载体选择
体外扩增PCR
互补性黏性 DNA重组片段连接 不互补性黏性 末端 平末端 前处理防止自连
RNA提取
RT-PCR
TA克隆
蓝白选择
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表达引物PCR 载体 胶回收 PCR产物回收 转化感受态细胞
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具体实验步骤
Ø Ⅱ.TOC33基因片段的PCR扩增
Ø Ⅲ. DNA的琼脂糖凝胶上回收与纯化 Ø IV. DNA片段的体外重组与转化 Ø V. 克隆的筛选与鉴定 Ø VI.序列分析
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•
利用GSP（基因特异引物）通过PCR扩增出目标基因
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一、实验起始材料的选取和准备
人工气候箱、制冰机
超净工作台、显微操作系统
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分离准备工作 水稻卵细胞的分离 材料的速冻 长期保存
RNase 抑制剂
RNase-free 耗材、液氮罐
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Ø V. 克隆的筛选与鉴定
试剂盒质粒回收过程
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把过夜培养菌液，10000r/min离心1分钟，倒掉上清液； 向菌体中加入质粒回收试剂盒中的SolutionI400微升，震荡，直到沉淀 的菌体完全悬浮； 然后加入400微升的SolutionII，轻轻地颠倒混匀，然后在室温下放置2 分钟； 加入525微升的SolutionIII，颠倒混匀，直到出现白色的絮状沉淀， 10000r/min离心10分钟； 把上清液转移到试剂盒专用管中，10000r/min离心1分钟; 倒掉溶液，向管子中加入600微升的buffer HB，10000r/min离心1分 钟； 倒掉溶液，加入750微升的wash buffer, 10000r/min离心1分钟; 重复上一步骤7次； 倒掉溶液后空转一次，以尽量除尽残余的wash buffer ; 将带有膜的管子转移到新的EP管中，加入100微升的水，静置1分钟， 10000r/min离心1分钟，即得到所需要的质粒。
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Ⅲ. 琼脂糖凝胶上DNA的回收与纯化
提取缓冲液，放在60度的金属浴中溶解。然后把溶液转移到试剂盒专 用管中，6000转/分离心1分钟；
u 倒掉上清，再加入500微升的extraction buffer,12000r单个未知基因在整个基因 组中的比例很小且不能在体外特异性扩增，所b 心 bi oo 做 .c 生 om 物
油菜TOC33基因片的克隆
u 实验项目背景 国家自然科学基金项目（油菜叶绿体蛋白质转运突变体中差异表达基因的克 隆，编号：30170500）。 u 实验目的 通过本综合实验，掌握植物基因组DNA的制备技术、PCR技术、限制性 内切酶酶切技术、重组DNA技术、克隆鉴定技术、质粒DNA的制备、琼脂 糖凝胶电泳技术、测序技术、生物信息技术等，得到一个与科学研究过程 相近的分子生物学综合技能训练。
Ø Ⅰ.植物基因组DNA的制备
Ⅰ.植物基因组DNA的制备
分捣碎，加入0.6mL 抽提缓冲液，65℃水浴处理10min。 u 12,000rpm离心3min，取上清，加入二倍体积预冷的无水乙醇沉淀，遇有 絮状沉淀，4,000rpm离心5min。 u 沉淀用50ul TE-RNase（5.0mM Tris.HCl pH 8.0，1.0mM EDTA pH 8.0， RNase A 30ug/mL）溶解，37℃保温处理15min。 u 加 入 二 倍 体 积 预 冷 的 无 水 乙 醇 ， -20℃ 下 沉 淀 10min ， 4,000rpm离 心 3min，加适量70%乙醇洗沉淀，自然干燥或37℃烘干，加入50ul ddH2O 溶解备用。
超低温冰箱
二、卵细胞mRNA的提取、纯化
旋涡混匀器 离心机
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细胞裂解 匀浆 去蛋白和细胞残渣 温浴并结合 洗脱 去盐和回收
200℃ 烘箱
Oligotex系列试剂盒
DEPC 、 RNase-free DNase I 、 RNase-free 耗材
获得的阳性单克隆送样测序，测序结果的同源性比较采用 GenBank中的BLAST分析程序，基因序列比较运用DNAsist软件。
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Ø VI.序列分析
• 实验起始材料的选取和准备 • mRNA的提取、纯化 • • • •
目标片段的克隆和分析 DNA、RNA的提取、纯化和分析 克隆化基因的表达及表达蛋白的纯化和功能分析 基因转化实验及转基因结果分析
恒温水浴锅
பைடு நூலகம்
离心机、旋涡混匀器
三、目标片段的 • 目标基因的获得； • 通过噬菌体载体自切割或T-Vector、平末端载体 克隆获得目标质粒； • 利用测序仪和通用引物对克隆的目的基因测序；
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1.通过SMART技术构建cDNA恒温水浴锅、制冰机 PCR仪
恒温水浴锅、离心机
电泳仪器、凝胶成像系统 恒温水浴锅
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第一链的合成 第二链的合成和扩增 酶切、纯化和e、RNase抑制剂
高保真Taq酶
限制性内切酶、过滤柱 琼脂糖
超净工作台、烘箱、PCR仪 超低温冰箱
培养基
DMSO
2.目标基因的克隆
ü 将培养于平板的噬菌斑通过印迹转于尼龙膜，并于核酸交联仪中固定。在杂 交箱中利用特定探针杂交。最后在恒温摇床中洗膜（探针标记：放射性和非 放射性） ü 将噬菌体培养于平板，于42℃培养几小时后，于37℃用IPTG诱导融合蛋白的 表达并印记于尼龙膜上，利用抗原-抗体反应进行杂交
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u 取0.2g样品嫩叶至1.5mL EP管中，放在液氮中冷冻处理后，在EP管中充
Ⅱ.TOC33基因片段的PCR扩增
u 引物设计，为扩增Toc33片段，用OLIG05. 0设计1对PCR引物: 上游引物P1: 5'一ATGGGGTCTCTCGTTCGTGAAT-3'， 下游引物P2：5'一TTAAAGTGGCTTTCCACTTGTC一3'。 u 在0.2mLEppendorf管内配制25ul反应体系： 10×PCR Buffer 2.5 ul Mg2+ 1.5 ul dNTP 1.0 ul 1) 94 oC 预变性 5 min Primer 1 1.0 ul 2) 94 oC变性 30 sec Primer 2 1.0 ul 3) 55 oC退火 30 sec Taq 酶 0.5 ul 4) 72 oC延伸 45 sec 模板 1.0 ul 5) 重复步骤2)-4)30次 ddH2O 16.5 ul 6) 72 oC延伸10 min
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u 琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果 1) 称取0.5g琼脂糖放入溶胶瓶中，再加入1ml 50×TAE缓冲液，49ml 高 水，置微波炉或水浴加热至完全融化，取出摇匀，则为1％琼脂糖凝胶 液。 2) 取电泳槽里面的胶板，用胶带将两端封好，调平，并放好样品梳子。 3) 将冷到60oC左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入胶板，直至胶板上形成一层 均匀的胶面。 4) 待胶凝固后，取出梳子，放在电泳槽内。电泳槽内应加入电泳缓冲液。 5) 用移液枪将已加入上样缓冲液的PCR产物加入加样孔。 6) 接通电泳槽和电泳仪的电源（注意正负极，DNA片段从负极向正极移 动）；选择合适的电压，开始电泳； 7) 当溴酚蓝燃料移动倒距离凝胶前言1－2cm处，停止电泳。 8) 将电泳的凝胶浸入溴化乙锭染色液中，染色10min后取出，用清水冲洗。 将胶放于凝胶成像系统内拍照，以观察样品在琼脂糖凝胶中的带（EB有 剧毒，戴手套操作）。
1. 用移液枪在1.5mlEP管中加入液体LB培养基500ul，再用灭过菌的牙签
在生长蓝白斑的平板上挑取阳性克隆放于EP管中，丢弃牙签，盖紧 管口，用报纸包好放到37OC，200r/min的摇床中过夜培养； 2. EP管出现混浊，用质粒提取试剂盒提取质粒。 3. 对于得到的质粒再酶切电泳检测阳性克隆，如果酶切后的电泳图上 出现了与插入片断相应大小的条带，证明是此单菌落是阳性克隆， 否则是假阳性的。