基因工程试验指导

《基因工程》实验指导

湖南师范大学生命科学学院

遗传与发育生物学系

2009年5月

基因工程课程综合实验---转基因斑马鱼的构建

一、实验目的

本课程的教学目的是让学生对基因工程技术所涉及的主要环节的基本原理、完整流程和基本技术进行系统地学习和掌握，培养学生具有通过这些原理进行基因工程实验和研究方面的设计能力。在基因工程理论课程的讲授和实践课程的实际操作过程中对学生进行基因操作与社会伦理方面的训练和教育，重在素质和能力的培养。

二、实验原理

转基因动物（transgenic animal）是指动物所有细胞基因组中整合有外源基因的一类动物，具有将外源基因遗传给子代的能力，整入动物基因的外源基因被称为转基因（transgene）。转基因动物技术是常规分子生物学技术的延伸和拓展，是基因工程技术的核心内容之一，它不仅为人们研究生命科学提供了一个更有效的工具，转基因技术是生物学领域最新重大进展之一，已能渗透到生物学、医学、畜牧学等学科的广泛领域。转基因动物已成为探讨基因调控机理、致癌基因作用和免疫系统反应的有力工具。同时人类遗传病的转基因动物模型的建立，为遗传病的基因治疗打下坚实的理论和实验基础。转基因技术涉及外源基因的获取、重组载体的构建与检测鉴定、受体系统的准备、显微注射基因导入、供转基因胚胎发育的体外培养系统和宿主动物的饲养等方面的内容。

三、材料

限制性内切酶：Eco R I、Sal I、Age I、Not I、Bam H I；T4 DNA聚合酶；LA DNA聚合酶混合物均为大连TaKaRa公司产品；

3. 2菌株及细胞系

DH5α感受态细胞：由本实验室自行制备并存于-20℃；

3. 3 质粒与表达载体系统

3. 3.1 pEGFP-N1载体

pEGFP- N1载体是一种把异源性的蛋白质融合至EGFP的N端的哺乳动物表达载体，为Clontech公司的产品。含有人类巨细胞病毒（CMV）启

图1 含有绿色荧光蛋白基因的卡那霉素抗性的pEGFP-N1质粒

动子，SV40 Poly A尾，pUC复制起始点（原核）和SV40复制起始点（真核），20个多克隆位点，具有筛选标志卡那霉素（原核）和新霉素（真核）的抗性基因，见图1。异源性蛋白与EGFP阅读框一致地克隆入pEGFP-N1，形成的表达重组体在CMV启动子启动下，表达EGFP和目标蛋白的融合蛋白。该融合蛋白保持了EGFP的荧光特性，可对融合蛋白进行活细胞内

3. 3.2pMD18-T载体

pMD18-T载体是线状DNA，2.7kb，3’端有oligo(dT)，可插入PCR扩增产物。插入位点两侧有常用的限制性内切酶酶切位点和T7、SP6 RNA聚合酶转录起始位点。带有氨苄青霉素抗性基因，见图2。

图2 含有氨苄青霉素抗性的pMD18-T载体

3. 4 试剂盒

质粒小量抽提试剂盒购自安比奥生物技术公司；

琼脂糖凝胶DNA回收纯化试剂盒购自北京TIANGEN公司；

无内毒素质粒大量抽提试剂盒购自北京TIANGEN公司；

DNA Ligation Kit Ver.2购自大连TaKaRa生物公司。

3. 5 其他试剂

琼脂糖粉（Agar A）购自上海Yito公司；氯化钠、异丙醇和丙三醇购自长沙分路口塑料化工厂；无水乙醇购自天津市大茂化学试剂厂；胰蛋白胨（Trytone）、酵母提取物（Yeast Extract）、琼脂糖（Agar M）购自加拿大BBI公司；EB染液购自深圳市达科生物技术有限公司。

3. 6 DNA分子量Marker

DNA ladder mix #SM0331（深圳晶美公司）

DNA ladder 100 bp #SM0321（深圳晶美公司）

DNA ladder 100 bp #SM0241（深圳晶美公司）

3.7 PCR引物

CMLC2 启动子上游引物（CMLC2-L），下游引物（CMLC2-R）序列如下：

CMLC2-L：5’-GAATTCAATGAGCTCTCCAAATCAGCAG-3’(划线部分为Eco R I酶切位点)

CMLC2-R：5’-GGATCCGAGGAAACCGATTGCTACAAACC-3’(划线部分为Bam H I酶切位点)

3.8主要仪器

PCR仪，低温高速台式离心机，fresco离心机，SHINADZU电子天平，超净工作台，ZF-90型暗箱式紫外透射仪，DYY-III 8B型稳压稳流电泳仪，微波炉，XK96-A快速混匀器，GBII240-89不锈钢电热恒温水浴锅，电热恒温鼓风干燥箱，HX-1050恒温循环器，隔水式电热恒温培养箱，GIS-1000数码凝胶图象分析系统，6031-000-012核酸蛋白定量仪（Biophotometer），超纯水仪，紫外分光光度计，立式压力蒸汽灭菌器，恒温摇床，SCOTSMAN 制冰机，荧光显微镜，37℃细胞培养箱。

四、基本方法

4.1转化实验

4.1.1大肠杆菌感受态的制备

（1）从-80℃冰箱中将E.coli DH5α菌种取出解冻，用未加抗生素的LB培养皿划线，37℃培养过夜；

（2）挑取单个菌落入3ml LB（未加抗生素）液体培养基中，37℃、200 rpm振荡培养过夜；

（3）取过夜菌液0.5ml接种于50mlLB培养液中，37℃剧烈振荡培养2-3h；

（4）冰浴10min，然后4℃、5,000rpm离心5min；

（5）弃上清，加25ml预冷的100 mmol/L CaCl2，悬浮菌体；

（6）冰浴30min，然后4℃、5,000rpm离心5min；

（7）弃上清，加3.3ml预冷的100 mmol/L CaCl2，悬浮菌体；

（8）4℃放置12h后加入终浓度为15%的无菌甘油，按70μl分装，-80℃保存备用。

4.1.2 培养基的配制

液体培养基：Trytone 5g，NaCl 5g，Yeast Extract 2.5g，加水至500ml。

固体培养基：Agar A 7.5g，Trytone 5g，NaCl 5g，Yeast Extract 2.5g，加水至500ml。

4.1.3 转化步骤

（1）将感受态细胞置于冰上，将一半体积的连接子加入感受态细胞，混匀，冰上放置30min，另一半连接子-20℃保存备用；

（2）42℃水浴60-90s热休克；

（3）迅速冰上冷却3-5min；

（4）加入1ml液体LB（不含抗生素），37℃摇床培养1h；3,000rpm