基因工程实验指导 - 专业实验I
实验指导书-基因工程
生命科学学院《基因工程》实验指导书适用专业生物技术、生物科学二OO 七年八月前言该指导书以基因工程的研究程序为主线，综合了目的基因的分离、克隆，载体的构建等方面的实验内容，在注重专业性和可操作性的前提下突出先进性和系统性。
通过本课程的学习和实践，使学生对基因工程的全过程有系统、明确的认识，达到熟识、理解并掌握DNA 重组实验原理和操作方法，提高分析问题和解决问题的能力，开拓创新能力，为从事生物技术及其相关领域的科学研究工作打下基础。
实验设置内容包括：目的基因的PCR扩增及DNA片断的体外连接、转化（设计性实验），农杆菌介导的植物遗传转化（综合性实验），转化植物的表型分析及鉴定等内容（综合性实验）。
本课程的目的是培养高年级本科生及研究生进行基因操作的能力。
教学中，要求调动教学双方的主观能动性，组织学生参加实验准备，让学生和教师共同讨论理论和实验问题，指导学生分析总结实验结果。
本书可作为高等院校生物技术、生物科学等生命科学各有关专业本科生《基因工程原理与应用》的配套实验教材。
目录1、实验一：目的基因的PCR扩增及DNA片断的体外连接、转化···································32、实验二：农杆菌介导的植物遗传转化·······································································83、实验三：转化植物的表型分析及鉴定·······································································104、实验报告基本内容要求····························································································125、实验报告格式··········································································································13实验一目的基因的PCR扩增及DNA片断的体外连接、转化实验学时：7实验类型：综合实验要求：必修一、实验目的在学习分子生物学课程，并熟练掌握分子生物学实验操作技能的基础上，综合运用PCR、细菌感受台细胞制备、转化等手段，完成DNA体外扩增、扩增片段的连接、转化全过程，使同学掌握基因扩增和载体的基本方法和思路，培养独立设计实验并进行操作的能力，为从事基因工程相关研究奠定基础。
《基因工程》实验教学教案
《基因工程》实验教学教案一、实验教学目标1. 让学生了解基因工程的基本概念、原理和操作步骤。
2. 培养学生运用基因工程技术解决实际问题的能力。
3. 帮助学生掌握基因克隆、基因编辑等实验技能。
二、实验教学内容1. 基因克隆实验：让学生通过PCR扩增目的基因，并进行琼脂糖凝胶电泳分析。
2. 基因编辑实验：让学生利用CRISPR/Cas9系统对目标基因进行编辑，并通过PCR和琼脂糖凝胶电泳验证编辑效果。
3. 基因表达实验：让学生将目的基因插入到表达载体中，转化大肠杆菌，并通过IPTG诱导表达。
4. 抗原-抗体反应实验：让学生利用基因工程方法制备重组抗原，并进行抗原-抗体特异性反应检测。
5. 基因工程应用实例：让学生了解基因工程在生物制药、农业、环保等领域的应用。
三、实验教学方法1. 讲授法：讲解基因工程的基本原理、操作步骤和实验技巧。
2. 演示法：演示基因克隆、基因编辑等实验操作，让学生直观地了解实验过程。
3. 实践操作：让学生动手进行实验，培养实验操作能力和团队协作精神。
4. 讨论法：引导学生针对实验结果进行分析和讨论，提高解决问题的能力。
四、实验教学准备1. 教材和参考资料：准备《基因工程》等相关教材和参考资料，为学生提供理论支持。
2. 实验器材：准备PCR仪器、琼脂糖凝胶电泳设备、表达载体、大肠杆菌等实验所需的器材和试剂。
3. 实验指导：制定详细的实验步骤和操作指南，方便学生查阅。
五、实验教学评价1. 过程评价：评价学生在实验操作过程中的规范性和团队协作精神。
3. 应用评价：评价学生运用基因工程知识解决实际问题的能力。
4. 学生互评：鼓励学生互相评价，提高自我认知和沟通能力。
六、实验教学流程1. 实验前准备：讲解实验原理、目的和操作步骤，检查实验器材和试剂。
2. 实验操作：按照实验指导进行基因克隆、基因编辑等实验操作。
3. 实验结果分析：对实验结果进行分析和讨论，解释实验现象。
5. 实验总结：总结实验收获和不足，提出改进措施。
基因工程试验指导
《基因工程》实验指导湖南师范大学生命科学学院遗传与发育生物学系2009年5月基因工程课程综合实验---转基因斑马鱼的构建一、实验目的本课程的教学目的是让学生对基因工程技术所涉及的主要环节的基本原理、完整流程和基本技术进行系统地学习和掌握，培养学生具有通过这些原理进行基因工程实验和研究方面的设计能力。
在基因工程理论课程的讲授和实践课程的实际操作过程中对学生进行基因操作与社会伦理方面的训练和教育，重在素质和能力的培养。
二、实验原理转基因动物（transgenic animal）是指动物所有细胞基因组中整合有外源基因的一类动物，具有将外源基因遗传给子代的能力，整入动物基因的外源基因被称为转基因（transgene）。
转基因动物技术是常规分子生物学技术的延伸和拓展，是基因工程技术的核心内容之一，它不仅为人们研究生命科学提供了一个更有效的工具，转基因技术是生物学领域最新重大进展之一，已能渗透到生物学、医学、畜牧学等学科的广泛领域。
转基因动物已成为探讨基因调控机理、致癌基因作用和免疫系统反应的有力工具。
同时人类遗传病的转基因动物模型的建立，为遗传病的基因治疗打下坚实的理论和实验基础。
转基因技术涉及外源基因的获取、重组载体的构建与检测鉴定、受体系统的准备、显微注射基因导入、供转基因胚胎发育的体外培养系统和宿主动物的饲养等方面的内容。
三、材料限制性内切酶：Eco R I、Sal I、Age I、Not I、Bam H I；T4 DNA聚合酶；LA DNA聚合酶混合物均为大连TaKaRa公司产品；3. 2菌株及细胞系DH5α感受态细胞：由本实验室自行制备并存于-20℃；3. 3 质粒与表达载体系统3. 3.1 pEGFP-N1载体pEGFP- N1载体是一种把异源性的蛋白质融合至EGFP的N端的哺乳动物表达载体，为Clontech公司的产品。
含有人类巨细胞病毒（CMV）启图1 含有绿色荧光蛋白基因的卡那霉素抗性的pEGFP-N1质粒动子，SV40 Poly A尾，pUC复制起始点（原核）和SV40复制起始点（真核），20个多克隆位点，具有筛选标志卡那霉素（原核）和新霉素（真核）的抗性基因，见图1。
基因工程实验
基因⼯程实验实验⼀⼤肠杆菌基因组DNA的提取及电泳鉴定⼀、琼脂糖凝胶电泳注意的问题：1. 缓冲系统：在没有离⼦存在时，电导率最⼩，DNA不迁移，或迁移极慢，在⾼离⼦强度的缓冲液中，电导很⾼并产热，可能导致DNA变性，因此应注意缓冲液的使⽤是否正确。
长时间⾼压电泳时，常更新缓冲液或在两槽间进⾏缓冲液的循环是可取的。
2. 琼脂糖：不同⼚家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的强度，应有选择地使⽤。
3. 凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相⼀致，溶解的凝胶应及时倒⼊板中，避免倒⼊前凝固结块。
倒⼊板中的凝胶应避免出现⽓泡，影响电泳结果。
4. 样品加⼊量：⼀般情况下，0.5cm宽的梳⼦可加0.5ug的DNA量，加样量的多少依据加样孔的⼤⼩及DNA中⽚段的数量和⼤⼩⽽定，过多的量会造成加样孔超载，从⽽导致拖尾和弥散，对于较⼤的DNA此现象更明显。
5. 电泳系统的变化会影响DNA的迁移，加⼊DNA标准参照物进⾏判定是必要的。
6. DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率，平⾏对照样品应使⽤同样的缓冲条件以消除这种影响。
7. DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度，迁移分⼦的形状及⼤⼩。
采⽤不同浓度的凝胶有可能分辨范围⼴泛的DNA分⼦，制备琼脂糖凝胶可根据DNA分⼦的范围来决定凝胶的浓度。
⼩⽚段的DNA电泳应采⽤聚丙烯酰胺凝胶电泳以提⾼分辨率。
⼆、如果提取的DNA中含有蛋⽩质和RNA污染,应如何解决?蛋⽩污染可以考虑⽤酚氯仿多抽提⼏次,记得吸上清的时候⼩⼼点,宁可浪费也别吸到界⾯.⼀般后续还需要⽤氯仿/异戊醇抽提来去除酚.这样基本蛋⽩污染就可以去⼲净.实在不⾏,抽提⼀次后,就⽤蛋⽩酶K消化30min,再抽提.如果DNA多,RNA污染就添加RNase A消化,你可以中途取少量跑胶检测,RNA去⼲净了再抽提,再沉淀DNA.三、如果提取的DNA产量较低，分析原因并提出解决办法。
1）样本材料⽼化或反复动容导致DNA含量下降。
基因工程实验报告的实验步骤
实验一：大肠杆菌5 a和21感受态细胞的制备【实验步骤】1从平板上挑取新活化的大肠杆菌 5 a单菌落，接种到5培养基中，37C振荡培养过夜。
2取1培养物接种到100培，养基（250三角瓶）中，37C振荡培养2~3h。
3将菌液转移到50离心管（2管）中，冰上放置15。
4 4C 4000离心5,弃去上清液，倒置使培养液流尽。
5用20冷2溶液悬浮菌体沉淀合并成一管，在4C 4000离心5,弃去上清液。
6用10冷2溶液悬浮菌体沉淀，冰浴30。
7 4 C 4000 离心5，弃去上清液，用2的冷2溶液悬浮。
8分装到数个管中，每管200，冷冻保存备用。
实验二：目的基因质粒（或218）和表达载体质粒（32或30）的转化及大量提取【实验步骤】一、载体的转化（无菌条件，冰上进行）1、取200新鲜制备的感受态细胞，分别加入质粒 2 （32a, 18），混匀，冰上放置30。
2、将管放到42C保温90s,冰浴2。
3、加入800液体培养基，37 C慢摇复苏1 h。
4、将100的复苏细胞涂布在含有（100）的培养皿中，正置平皿30 （使菌液被培养基吸收）。
5、倒置平皿37C培养16 h，出现菌落。
二、质粒的提取1挑取单菌落接种于100加入50的液体培养基中，振荡培养过夜。
2过夜培养的菌液加入1.5的小指管（20个每组）中，每次1 , 4 C, 12000，离心1 ,4次，弃上清。
3加入150溶液I悬浮细胞，漩涡振荡，室温静置10。
4加入350溶液H （新鲜配制），轻微颠倒混匀20次，冰浴5。
（不能再剧烈震荡）5加入300溶液川（冰上预冷），颠倒混匀20次，不能剧烈震荡，冰浴10。
6 4 C, 12000，离心10，取上清转移至另一离心管中。
7向上清中加入0.6倍异丙醇，轻轻混匀，室温静置20。
8 4 C, 12000，离心10，弃上清，倒扣于吸水纸上，吸净液体。
9用1 70%乙醇洗涤质粒沉淀2次，每次4 C, 12000，离心3，吸去上清。
基因工程实验手册
《本科实验教学》基因工程实验指导贵州大学农业生物工程研究院2015年4月实验一DNA片断的连接、转化及酶切鉴定一、实验原理：实验所用载体为Promega公司T载体pGEM®-T Easy Vector，特点为在载体中存在两个T末端。
使用LA Taq进行扩增得到的大部分PCR产物3’端附有一个“A”碱基。
T4噬菌体DNA连接酶可在体外使外源DNA片段和线状质粒载体之间形成新的3'，5'磷酸二酯键。
PCR胶回收产物游离A末端与载体的T末端可互补配对并在连接酶作用下连接形成重组质粒。
转化指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA分子导入受体细胞体内，使法），其原理之获得新的遗传特性的一种方法。
大肠杆菌转化常用化学法（CaCl2溶液致敏处理，就可以成为高是培养至对数生长期的细菌在0℃经过低渗CaCl2效的感受态细胞，这种感受态细胞与质粒混匀置于0℃30min，混合物中的DNA 形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，再经42℃短时热激处理，促使质粒进入细胞实现转化，利用质粒上的遗传选择标记在LB平板上进行初步筛选转化菌落。
蓝白斑筛选是根据载体的遗传特征筛选重组子，如α-互补，抗生素基因等（本实验中使用的T载体pGEM®-T Easy Vector本身具有Amp抗性）。
现在使用的许多载体都有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。
在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主细胞。
因此，宿主和质粒编码的片段虽没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。
这样，β-半乳糖苷酶基因在缺失近操纵区段的宿主细胞与带有完整近操纵区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。
基因工程实验指导书
实验项目重组质粒DNA的提取、酶切及琼脂糖凝胶电泳检测实验项目类型：综合性所属课程名称：《基因工程》实验计划学时：8学时一、实验目的学会最常用的小量制备质粒DNA的碱裂解方法。
学会用酶切法筛选重组质粒转化成功的克隆菌。
二、实验原理1、提取质粒原理根据共价闭合环状质粒DNA与线性DNA在拓扑学上的差异来分离。
在pH12.0~12.5这个狭窄的范围内，线性DNA双螺旋结构解开而被变性。
尽管在这项的条件下共价闭合环状质粒DNA也会变性，但两条互补链彼此互相盘绕，仍会紧密结合在一起。
当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快，而线性的染色体DNA复性缓慢，经过离心与蛋白质和大分子RNA一起沉淀下去。
2、质粒DNA的酶切鉴定原理利用转化后宿主菌所获得的抗菌素抗性性状筛选出获得质粒的菌落克隆。
再从这些菌落中鉴定出质粒上带有外源基因插入片断的克隆菌落。
三、实验材料与仪器1、仪器超净工作台，接种环，酒精灯，台式离心机，旋涡混合器，微量移液取样器，1.5ml微量离心管，恒温摇床，摇菌试管，双面微量离心管架，试管架，标签纸，磁力搅拌机。
2、试剂pGEM-T-AT8载体菌，LB培养基1000ml（含100ug/ml氨苄青霉素），葡萄糖/Tris/EDTA(GTE)溶液（溶液I），NaOH/SDS溶液(溶液II)，KAc溶液（pH4.8）(溶液III)，RNase A，95%乙醇，70%乙醇，TE buffer（pH8.0）。
EcoR I，Xba I，Sac I ，Xho I，内切酶缓冲液（10×），10×电泳加样缓冲四、操作步骤1、实验准备氨苄青霉素储存液（无菌水配制5mg/ml，分装后-20︒C保存），配制LB培养基（胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g加200mL dd water 搅拌完全溶解，用约200μL 5N NaOH调pH至7.0，加dd water至1L，121︒C 20min灭菌）；溶液I（50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris HCl pH8.0，10mmol/L EDTA pH8.0）；溶液II（0.2mol/L NaOH，1% SDS）；溶液III（60mL 5mol/L Kac，加冰乙酸调pH4.8，补dd water至100ml），70%乙醇（-20︒C 保存），TE buffer（10mmol/L Tris HCl pH8.0，1mmol/L EDTA pH8.0）；10mg /mL RNase A （RNA酶A溶于10mmol/L Tris HCl pH7.5，15mmol/L NaCl中）；摇菌试管洗净并盖上棉花塞、1.5ml离心管装入铝制饭盒、移液器吸头装入相应的吸头盒，一起高压灭菌（121︒C 30min）。
基因工程实验方案实验
基因工程实验方案实验一、实验目的本实验旨在利用基因工程技术对大肠杆菌进行基因改造，使其能够表达外源蛋白。
具体来说，我们将利用质粒载体将感兴趣的外源基因导入大肠杆菌，并通过PCR、酶切、连接、转染等技术，构建表达载体，使其能够在大肠杆菌中表达外源蛋白。
通过本实验，我们希望能够探究基因工程技术在微生物工程中的应用，并为后续的基因改造研究提供实验基础。
二、实验材料1. 大肠杆菌菌种2. 质粒载体3. PCR试剂盒4. 酶切试剂盒5. 连接试剂盒6. DNA电泳仪7. 热循环仪8. 紫外可见分光光度计9. 转染试剂三、实验步骤1. 质粒载体提取首先，从实验室常用菌株中提取质粒载体。
我们选择一株质粒带有多克隆位点的大肠杆菌附着菌株，通过菌株复苏、培养、质粒提取等步骤，从中提取目标质粒载体。
2. PCR扩增外源基因根据我们感兴趣的外源基因序列，设计相应的引物，利用PCR技术扩增目标基因。
在PCR反应过程中，我们需要控制PCR反应的条件和时间，确保外源基因能够被充分扩增。
3. 酶切及连接将目标基因和质粒载体分别进行酶切处理，然后进行连接。
酶切及连接过程中需要保证实验操作无菌、操作准确，以确保目标基因能够成功插入质粒载体中。
4. 构建表达载体通过连接实验，成功将外源基因插入质粒载体中，构建表达载体。
之后，通过DNA电泳、酶切鉴定等技术手段，对构建的表达载体进行验证和鉴定。
5. 大肠杆菌转染将构建的表达载体转染至大肠杆菌，使其内源化。
转染过程中需要严格控制转染条件，保证外源基因能够成功表达。
6. 蛋白表达检测经过转染后，我们将进行蛋白表达检测。
通过蛋白印迹、Western blot、质谱等技术手段，对外源蛋白的表达情况进行检测和分析。
7. 结果分析最后，对实验结果进行分析，包括目标基因的扩增情况、质粒构建情况、大肠杆菌转染情况以及蛋白表达情况等，总结实验结果。
四、实验注意事项1. 实验操作需严格遵守无菌操作规范，确保操作台面、设备、试剂均处于无菌状态。
基因工程实验报告的实验步骤
基因工程实验报告的实验步骤引言基因工程是一种通过改变生物体遗传物质的工艺来改变其性状的技术。
基因工程在医药、农业和环境保护等领域有广泛的应用。
本实验旨在通过简单的基因工程实验，介绍基因工程的基本原理和实验步骤。
材料与方法1.实验材料：-选择性培养基：含有特定抗生素、激素或其它附加物质的培养基，以选择或鉴别特定的细胞。
-质粒：小的DNA分子，通常用来将外源基因导入宿主细胞。
-酶：用于限制性内切酶切割DNA。
-细胞培养物：用于细胞培养和基因转染。
-DNA提取试剂盒：用于提取DNA。
-PCR试剂盒：用于DNA扩增。
-DNA凝胶电泳仪：用于分离DNA。
2.实验步骤：（1）提取DNAa.收集样本，如细菌培养物或植物叶片。
将样本细胞裂解并使用DNA提取试剂盒提取DNA。
b.检测DNA浓度和质量，并分装为合适的体积备用。
（2）DNA限制性酶切割a.根据研究目的选择正确的限制性酶。
将DNA与限制性酶一同加入反应管中，按照供应商说明的条件进行酶切反应。
b.将反应产物进行电泳分离，观察并记录DNA切割情况。
（3）DNA连接a.选择合适的酶切产物进行连接实验。
将DNA和相应酶与连接试剂进行反应，在恰当的温度下进行连接反应。
b.将反应产物进行电泳分离，观察并记录连接后的DNA条带。
（4）DNA扩增a.根据连接后的DNA序列设计引物，在PCR试剂盒中将DNA进行扩增反应。
b.将PCR反应产物进行电泳分离，观察并记录扩增结果。
（5）基因转染a.准备转染细胞，并将质粒导入细胞。
按照转染试剂盒说明进行操作。
b.观察转染细胞的表型变化，并进行相关分析。
结果与讨论在本实验中，我们成功完成了DNA提取、限制性酶切割、DNA连接、DNA扩增和基因转染的操作。
通过电泳分离，我们观察到了DNA切割、连接和扩增的结果。
此外，转染细胞的表型变化也支持基因导入的成功。
实验结论本实验展示了基因工程的基本步骤，并介绍了DNA提取、限制性酶切割、DNA连接、DNA扩增和基因转染等关键技术。
基因工程实验操作作业指导书
基因工程实验操作作业指导书前言：在进行基因工程实验操作之前，请确保已经具备相应的实验知识和技能，并遵守实验室的安全规定。
本实验操作指导书将详细介绍基因工程实验的步骤和注意事项，以确保实验顺利进行。
一、实验前准备1.确认实验的目的和所需材料：确定需要进行的基因工程实验目标，并准备所需的各种试剂、细胞培养物和实验器材。
2.实验室安全措施：穿戴实验室要求的个人防护装备，遵守实验室的规章制度。
确保实验室电源和排风系统正常运行。
二、实验步骤1.基因克隆a) DNA提取：从源生物体中提取DNA样本，利用适当的提取方法将DNA纯化并获得高质量的DNA。
b) PCR扩增：设计引物，进行PCR扩增反应，使目标基因扩增到所需的浓度。
c) 酶切：使用限制性内切酶对目标基因和载体进行酶切，创建黏性末端适配体。
d) 连接：将目标基因与载体连接，形成重组DNA。
e) 转化：将重组DNA转化到适宜的宿主细胞中，使其能够被宿主细胞内的酶复制和表达。
2.细胞培养a) 培养基准备：根据实验需求制备适宜的培养基。
b) 细胞传代：将宿主细胞进行传代，以保持活性和生长状态。
c) 质粒提取：从转化后的细菌中提取质粒DNA，作为后续实验的样本。
d) 菌液预处理：将细菌培养物进行适当的处理，如离心、洗涤等。
3.基因表达a) 表达培养条件控制：设置适宜的温度、培养时间和培养基成分，以获得高效的基因表达。
b) 转录与翻译：利用适当的启动子和加入适量的诱导剂，实现基因转录和翻译。
c) 蛋白质纯化：根据需要，对表达的蛋白质进行纯化，确保其纯度和活性。
4.实验结果分析a) 凝胶电泳：使用凝胶电泳分析方法，判断基因工程实验的成功与否。
b) 荧光检测：通过荧光标记的方法检测基因表达程度。
c) 其他分析方法：根据实验目的及需求，选择适当的分析方法进行结果分析。
三、实验操作注意事项1.实验室安全：佩戴手套、实验外套、护目镜等个人防护装备，避免实验材料和试剂对人体造成伤害。
基因工程实验操作
实验一质粒DNA的提取试验方法与步骤（1）、菌种的培养：将含质粒的菌液接种在含100ug/ml Amp的LB固体培养基中，37℃培养12-24小时。
用无菌牙签或接种针挑取单菌落接种到5ml含100ug/ml Amp的LB培养基中，37℃振荡培养过夜（约18小时）备用。
（2）用微量取液枪取1.5ml菌液于离心管中，将装有剩余菌液的锥形瓶瓶口在酒精灯火焰上灭菌后封口备用。
（3）、将离心管置于离心机中，12000rpm离心1min。
（4）、弃上清，将管口打开倒置于吸水纸上数秒使液体尽可能流尽。
（5）、加入250ul溶液I，用枪吹打悬浮后置于旋涡混合仪上振荡，使菌体充分悬浮，室温静置5min。
（6）、加入250ul新配制的溶液II，温和颠倒混匀，冰浴中静置5min。
（7）、加入350ul溶液III，轻轻颠倒混匀，冰浴中静置10min。
（8）、将管置于离心机中，12000rpm离心10min。
（9）、取上清液,置于套有离心管的吸附柱中,10000rpm离心1min,弃清液,留吸附柱。
（10）、取500ul的Buffer HB置于上述套有离心管的吸附柱中，10000rpm离心1min，弃清液，留吸附柱。
（11）、取500ul的Wash Buffe置于上述套有离心管的吸附柱中，10000rpm离心1min。
（12）、去清夜，离心空离心管，10000rpm离心1min。
（13）、去清夜，取500ul的EB于吸附柱，室温放置1~2min，13000rpm离心1min。
（14）、取200ul样品用水稀释50倍后，以水为对照测其OD260与OD280值。
（15）、另取5ul样品与2ul 6×上样缓冲液混匀后进行琼脂糖凝胶电泳，检测其纯度和分子量。
（16）、其余样品作好标记后贮存于4℃冰箱中备用（用于构建重组子）。
实验二紫外分光光度法测定DNA纯度和浓度实验步骤（1）分光度计先用水在260nm和280nm两个波长下校零。
研究生基因工程实验手册1
基因工程实验指导（研究生用）西北农林科技大学2013-5基因工程实验指导编写：张大鹏王保莉目录实验一、细菌培养实验二、琼脂糖凝胶电泳法检测实验三、质粒载体DNA的提取实验四、质粒载体DNA酶切实验五、目的基因的获得及酶切处理实验六、质粒载体和外源DNA的连接反应实验七、感受态细胞的制备及转化实验八、重组质粒鉴定及转化实验九、目的蛋白的诱导表达及检测附录实验守则及要求一、实验前要认真预习实验指导，熟悉实验内容、方法和具体操作步骤，并对本实验中的部分设计型实验内容进行实验参数设计，写出预习报告。
二、实验过程中要认真操作、仔细观察、善于思考和提出问题。
作好实验数据及发生现象的记录。
三、爱护实验室的一切设备和实验仪器，如有损坏应主动向教师说明原因，并填写报损报废单，以便酌情处理。
四、每个小组的学生在进行实验过程中，要密切配合、互相帮助，力争圆满地完成各项实验内容。
五、实验室需要保持安静，不允许高声喧哗和谈笑及随便走动。
每次实验结束，应清理自己的实验台，把实验用具清洗完毕，安放妥当。
并组织值日生打扫，保持实验室的清洁卫生。
并注意实验室的水、电、门、窗等方面情况。
六、实验结束后认真整理数据、计算结果，对实验中的现象和问题进行必要的讨论；对改进实验提出合理化建议。
七、穿着要整洁，必须穿实验服。
在完成实验后，必须书写实验报告。
一份满意的实验报告必须具备准确、客观、简洁、明了四个特点。
写好实验报告除了正确的操作程序外，还必须有赖于仔细的观察及客观的记录，有赖于运用所掌握的理论知识对实验现象和结果的分析和综合能力。
实验报告的格式包括以下几方面：1、实验的目的和原理简单扼要地说明进行本次实验的目的和原理。
对实验中所用的技术和方法，要作简单的介绍。
2、实验操作程序在充分理解操作步骤和原理上。
对整个实验操作过程进行概括性的描述，要求简单明了，避免长篇抄录。
3、结果处理对实验过程中出现的现象仔细观察，对数据客观记录。
然后再进行处理计算等，得出结果。
10生工基因工程课程实验指导
基因工程综合实验2013.5本综合实验包含的实验内容：质粒DNA的提取、DNA的凝胶电泳、质粒DNA中靶基因的酶切分析及质粒DNA中重组进的靶DNA序列的PCR扩增，通过本综合实验，帮助大家理解质粒DNA的提取原理、凝胶电泳中DNA分离的机理、限制性内切酶的工作原理及PCR是如何实现DNA扩增的，通过实验同时让同学掌握DNA的提取技术、凝胶电泳技术、DNA酶切分析技术及靶基因的体外快速扩增技术，了解实验中出现的现象并学会分析与解决实验中出现的有关问题。
以下为按照内容划分的实验指导：实验一、碱裂解法提取质粒DNA、质粒DNA的纯化和凝胶电泳分析一、实验目的学习并掌握基因工程操作技术中最常用的载体质粒DNA的提取方法和进一步的纯化技术。
二、实验原理在碱性溶液中，双链DNA氢键断裂，DNA双螺旋结构遭破坏而发生变性，但由于质粒DNA分子量相对较小，且呈环状超螺旋结构，即使在高碱性pH条件下，两条互补链也不会充分分离，当加入中和缓冲液时，变性质粒DNA又恢复到原来的够型；而线性的大分子量细菌染色体DNA则不能复性，与细胞碎片、蛋白质、SDS等形成不溶物，通过离心沉淀可被除去，而质粒DNA及小分子量的RNA则留在上清液中。
混杂的RNA可用RNaseA酶消除，再用酚/氯仿处理，可除去残留的蛋白质，达到纯化质粒DNA的目的。
三、实验材料大肠杆菌DH5α（含重组了约1500bp DNA片断的pMD18-T表达质粒，Amp 抗性）四、实验仪器、用具高压灭菌锅、超净工作台、恒温摇床、台式离心机、涡旋振动器、培养管、移液器、离心管、吸管头、量筒、紫外观测仪五、实验试剂LB培养基、3mol/L醋酸钠（pH5.2）、TE缓冲液（pH8.0）、无水乙醇、75%乙醇、RNaseA（10mg/ml）、goldview DNA染色剂、氯仿、琼脂糖抽提质粒DNA所需的溶液：溶液Ⅰ：50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris-Cl（pH8.0），10 mmol/L EDTA (pH8.0)；溶液Ⅱ： 0.2 mol/L NaOH， 1%SDS(w/v)，现配现用；溶液Ⅲ：3 mol/L KAc，用冰醋酸调pH值至5.2；电泳缓冲液（0.5×TBE）：45 mmol/L Tris-硼酸，1 mmol/L EDTA，pH8.0；六、实验步骤：1、质粒DNA的提取（1）在LB固体平板上挑单菌落接入2ml 含Amp的LB液体培养基中（已灭菌），37℃振摇培养过夜 (注：此步已经完成)；（2）取1mL菌液放入Ep管中，12000 r/min（简写rpm）离心1min；弃尽上清；（注：先倒液体入废液缸，再倒扣用吸水纸吸干液体，残留液体可移液器吸干）（3）加入200μL预冷的含RNaseA的溶液I，旋涡以充分混匀；（4）加入200μL的溶液Ⅱ，温和混匀，室温静置5min以充分裂解细菌；（5）加入200μL的溶液Ⅲ，温和混匀，－20℃放置8min（常温也可，但产量可能下降）；（6） 12000rpm离心5min；（7）吸上清至另一新的1.5mL EP管，加500μL氯仿/异戊醇（V：V=24：1）充分混匀，12000rpm离心5min；（8）小心移取上清液500μL至另一新的1.5mL EP管，加入2倍体积无水乙醇，充分混匀，-20℃静置10min，12000 rpm离心10min，弃上清；（静置期间安排制备琼脂糖凝胶，每组制胶一块，具体见附件）（9）加入200μL 70%乙醇洗DNA沉淀，12000rpm离心5min，倒掉乙醇，再12000rpm离心几秒钟，用移液器尽可能除去乙醇，烘箱适度风干；（10）加入20μL RTE （含10μg/mL RNaseA 的TE，pH8.0）溶解质粒DNA，37℃放置10min（时间充分可以考虑放置30分钟，以充分消化RNA）。
基因工程实验指导
《分子生物学大（综合）实验》实验指导不同生长期仿刺参性腺组织中基因差异性表达的研究幼参的性腺颜色一般为灰褐色，而成熟期，雌性生殖腺为橘红色，雄性为乳白色或浅乳黄色。
一、TRIZOL试剂盒提取RNA取新鲜健康的体长为3-5 cm 的幼参与12-15 cm 的成熟参，用无菌海水清洗其体表，置于无菌大培养皿上。
解剖刺参，取出其性腺。
以幼参的性腺提取物为对照组，成熟刺参的性腺提取物为试验组。
1 匀浆每50~100mg组织，加1ml的TRIZOL。
将样品放在干净已灭菌的研钵中，倒入液氮，迅速研磨样品，在研钵中直接加入TRIZOL。
样品的体积不要超过TRIZOL试剂体积的10%。
再用Tip头吸到EP管中。
2 离心匀浆后，2~8℃，12 000r/min，离心10 min。
取上清，去沉淀。
若上清顶层有一层脂肪，应去除。
将上清液移到干净的EP管中，添加氯仿，相分离。
3分离上清液在15~30℃下温育5 min，彻底去除核蛋白复合物。
每1ml的TRIZOL试剂加0.2ml 的氯仿，盖紧EP管盖。
用手剧烈震荡15sec，15~30℃下温育2~3 min。
2~8℃下，不超过12 000r/min, 离心15 min。
离心后，复合物分离出从下到上依次为：一较低的红色区、酚氯仿相、一个分界面和无色上清水相。
RNA保留在无色上清水相中，水相体积大约是用于匀浆的TRIZOL试剂体积的60%。
4 RNA沉淀将上清液移到干净的EP管中，通过混合异丙醇使RNA沉淀。
在匀浆初始使用的TRIZOL 试剂量，每1ml的TRIZOL，加入0.5ml的异丙醇。
混匀以沉淀RNA。
15~30℃下温育10 min。
2~8℃下，不超过12 000 r/min，离心10 min。
RNA沉淀在离心前不可见，离心后形成一胶状颗粒，粘附在管的侧面和底部5 RNA的洗涤去掉上清，用75%乙醇洗沉淀。
每1ml的TRIZOL（开始时），加入1ml 75%的乙醇，混匀样品，7 500 r/min，2~8℃，离心5 min。
基因工程实验
实验一从植物中提取DNA【实验目的】1、掌握提取DNA的技术及原理2、学习DNA提取的方法【实验原理】首先研磨粉碎的植物组织在LP缓冲液裂解完全，基因组DNA被释放出来。
在加入DA缓冲液沉淀后，去除大部分杂质。
然后，由于加入的P Binding缓冲液中适当的盐分及pH值得作用下，DNA被特异吸附于Biospin膜上。
通过洗涤，可将蛋白质等残留的杂质去除。
最后使用Elution Buffer将DNA从膜上洗脱下来，从而获得基因组DNA。
【实验材料】自己采取某种植物的叶子1. 实验试剂植物DNA提取试剂盒【实验操作】1.剪取约0.2-0.5g叶片于冷研钵后，迅速倒入液氮用玻棒研磨成为粉末，分装到1.5ml的离心管中。
2.加入450μl LP缓冲液，并混合均匀。
3.于65℃环境下温浴15分钟，温浴中可间或震荡离心管2-3次，然后移出。
4.加入150μlDA缓冲液，混合均匀后于冰浴中放置5分钟。
5.将混合物全部转移至Shredder spin colum，于离心机中3分钟。
6. 将滤液转移至一个新的1.5ml离心管。
7. 加750μl P Binding缓冲液，并混合均匀。
8. 将混合液转移至Spin column。
于离心机离心1分钟，弃去接液管中的液体。
9. 向Spin column中加入500μl的G Binding Buffer。
离心30秒，弃去接液管中液体。
10. 向Spin column中加入600μl的Wash Buffer。
离心30秒，弃去接液管中液体。
11. 重复步骤10一次。
12. 再次将Spin column离心1分钟，并将Spin column 转移至一个新的1.5ml离心管中。
13. 向Spin column中加入100μl的 Elution Buffer，并于室温温育1分钟。
离心1分钟，取离心管中的液体含有DNA。
实验二 PCR扩增 DNA【实验目的】1、掌握 PCR扩增 DNA的技术及原理2、学习 PCR扩增仪的使用【实验原理】聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种体外 DNA扩增技术，1985年由 Mullis 等人创立。
基因工程实验
实验一琼脂糖凝胶的制作及点样实验目的1．掌握琼脂糖凝胶的制做方法。
2．掌握琼脂糖凝胶的点样操作。
实验原理琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。
其分析原理与其他支持物电泳的最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。
琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。
但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。
蛋白质和核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速度不同，根据这个原理可将其分开。
电泳缓冲液的pH在6~9之间，离子强度0.02~0.05为最适。
常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。
琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广。
普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。
DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。
由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。
操作步骤1.洗净胶板和胶盒，晾干，把胶板放入胶盒内，插好梳子。
2.称取1g琼脂糖粉末，加入到盛有100ml1×TBE电泳缓冲液中，放置电炉上加热，等待沸腾2-3次，确保琼脂糖粉末完全溶解。
3.琼脂糖溶液稍稍冷却后，沿着远离梳子的一侧将琼脂糖溶液连续地倒入胶板内。
4.等待20分钟，待琼脂糖溶液完全凝固后，竖直地拔起梳子。
5.将胶板从胶盒内拿出，放入电泳槽中，在电泳槽中倒入1×TBE电泳缓冲液，加入量以淹没凝胶为准。
6.按照讲解的点样注意事项进行点样操作练习。
实验结果写点样的操作要点。
（自己写）实验二植物基因组DNA的提取实验目的掌握植物总DNA的抽提方法和基本原理。
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基因工程实验指导书缩略词表实验一植物总DNA 的抽提及电泳检测一【实验目的】1、了解植物DNA抽提的主要方法；2、掌握快速抽提DNA的方法。
3、了解掌握检测DNA质量的方法以及DNA定量的方法；4、了解影响DNA在琼脂糖凝胶中泳动速率的因素；5、训练DNA的琼脂糖凝胶电泳操作。
二【实验原理】该方法简便、快速，DNA产量高(纯度稍次，适用于一般分子生物学操作) 。
CTAB (十六烷基三乙基溴化铵)是一种非离子去污剂，植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA被释放出来。
CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。
经离心弃上清后，CTAB-核酸复合物再用70－75%酒精浸泡可洗脱掉CTAB。
再经过氯仿/异戊醇(24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等DNA沉淀剂将DNA沉淀分离出来。
CTAB能溶解于乙醇。
改进的CTAB植物DNA抽提液迅速裂解细胞和灭火细胞内核酸酶，氯仿抽提后通过离心清除多糖、多酚和蛋白质，上清加入异丙醇离心沉淀基因组DNA，进一步去除其它各种杂质，然后基因组DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗-离心步骤，进一步将多糖，多酚和细胞代谢物，蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液将基因组DNA从硅基质膜上洗脱。
琼脂糖凝胶电泳技术是DNA分子片段的分子量测定和分子构象研究以及DNA分离纯化的重要实验手段。
DNA分子在琼脂糖凝胶电泳中泳动时受到电场驱动力和凝胶的摩擦阻力。
一般情况下，单位长度双链DNA带有几乎相等的电荷，故在一定电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于凝胶的摩擦阻力，即DNA分子本身的大小和构型。
DNA分子的迁移速度与相对分子量的对数值成反比关系，具有不同长度的DNA 片段由于其泳动速度不同而得到分离。
具有相同一级结构但构型不同的DNA分子也可以通过这种方法进行分离。
溴化乙锭(EB)是一种荧光染料，在紫外光照射下可发出波长590nm的红色荧光，DNA分子与EB形成荧光络合物后，其发射的荧光比原来要增强数十倍，常用来观察凝胶中DNA 条带的位置。
三【试剂】试剂盒(Buffer P1、Buffer P2、Buffer P3、RNase A、漂洗液WB、洗脱缓冲液EB、吸附柱AC、分离柱A、收集管)、、70％乙醇、无水乙醇、β-巯基乙醇、溴化乙锭(EB)；TE缓冲液(含10 mmo1/L Tris和1 mmo1/L EDTA，pH 8.0，高压灭菌)；琼脂糖凝胶(0.7～1.5%，琼脂糖粉末与1×TAE配成)；TAE(Tris-乙酸盐，EDTA)电泳缓冲液（50×浓缩贮存液）：Tris碱242g；冰醋酸57.1mL；0.5 mol/L EDTA (pH8.0) 100mL；加600mL蒸馏水，剧烈搅拌，加蒸馏水至1000mL，浓盐酸调pH至8.0。
10×加样缓冲液：0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯青FF、15%的Ficoll水溶液、0.1mol/LNa2EDTA，pH8.0、1.0%SDS。
四【仪器设备及材料】1、仪器设备离心机、水浴锅、液氮罐、天平、研钵、EP管、微量移液器(20μL、200μL、1000μL)、刻度量筒、玻璃棒、三角烧瓶、移液枪及枪头、微波炉或沸水浴、凝胶灌制平板(塑料或玻璃制成)、凝胶样品梳、稳压稳流电泳仪、紫外分析仪、数码相机、封口胶带和电源等。
2、材料植物叶片。
五【植物总DNA 的抽提步骤】*第一次使用前请先在漂洗液WB中加入指定量无水乙醇！*将Buffer P1放置在65℃预热，使用前加入β-巯基乙醇到终浓度0.2%1、称取适量（每人取1g）叶片放入预冷的研钵中，加入适量液氮，迅速研成粉末，装入离心管中。
2、加热Buffer P1、研钵、研杵到65℃，65 ℃预热灭菌去离子水。
3、注意细粉(植物新鲜组织1g或干重组织300mg)到一个50ml离心管，不要解冻，迅速加入5.5ml 65 ℃预热Buffer P1(已经加入β-巯基乙醇到终浓度0.2%)和40ul RNase A 剧烈涡旋振荡混匀1分钟，室内放置10分钟。
4、加入1.3ml的Buffer P2，充分混匀，10000g以上离心10分钟。
5、小心吸取上清到一个分离柱A，注意不要洗到界面物质，4000rpm离心3-5分钟，收集下液。
6、加入1.5倍体积的Buffer P3立刻轻柔涡旋，充分混匀。
7、将上一部所得混合物(包括可能出现的沉淀)加入一个吸附柱AC中，(吸附柱加入收集管中)静置1分钟，12,000rpm离心10分钟，倒掉收集管中的废液。
8、将吸附柱移到新的收集管中并加入7ml漂洗液WB(请先检查是否已加入无水乙醇！)，12,000rpm离心5分钟，倒掉收集管中的废液。
9、重复8。
10、将吸附柱AC放回空收集管中，12,000rpm离心5分钟，尽量出去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
11、去除吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加1-2ml洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中预热，能提高洗脱效率)，室温放置5分钟，12,000rpm离心5-7分钟。
12、重复11换另外一个收集管收集DNA，第二次收集的产量比第一次低。
13、DNA可以存放在2-8℃，如果要长时间存放，可以放置在-20℃。
【琼脂糖凝胶电泳检测步骤】1、选择孔径大小适合的点样梳，垂直架在胶版的一端，使点样梳底部离电泳槽水平面的距离为0.5-1mm。
2、称取0.25g琼脂糖，加入25ml 1×TAE电泳缓冲液中，加热使琼脂糖溶解均匀。
3、于50ml的离心管中加入1.25μl EB (10mg/ml)。
4、待凝胶冷却至50℃左右，将凝胶倒入50ml离心管中。
5、将离心管中的凝胶溶液轻轻倒入电泳凝胶板上，除去气泡。
6、待凝胶凝固后，小心取出点样梳。
7、在电泳槽中加入1×TAE电泳缓冲液，将胶板放入电泳槽中（点样孔一端靠近电泳槽的负极），使电泳缓冲液没过胶面。
8、待测样品中加入1/6体积的6×上样缓冲液，混合后，移液枪点样，记录样品点样顺序及样量。
9、连接电泳槽与电泳仪之间的电源线，正极为红色，负极为黑色。
10、开启电源，开始电泳，最高电压不超过5V/cm。
11、当指示剂跑过胶板的2/3，可终止电泳；切断电源后，将电泳凝胶块放在凝胶成像仪中观察，拍照。
六【注意事项】1、尽量取材幼嫩叶片，如太老，酚类物质多，必须用10 mM的-ME处理。
2、所用试剂必需灭菌。
3、注意溴化乙锭(EB)是一种强诱变剂，有致癌嫌疑，操作过程戴手套和口罩，并注意把实验中沾染EB和未沾染EB的实验器具分开，防止EB交叉污染，万一接触了溴化乙锭，立即用大量的水冲洗。
4、配胶和灌电泳槽需使用同一批缓冲液。
因为pH或离子强度很小的差别也会在凝胶前部造成紊乱，严重影响DNA片段的泳动。
5、微波炉加热时间过长，琼脂糖溶液会变得过热或剧烈沸腾。
应调整好加热所有琼脂糖颗粒完全溶解需要的最短时间。
6、溴酚蓝与0.5kb大小的DNA的泳动度相近，这可给泳动最快的DNA片段提供一个指示。
7、凝胶要用于印迹分析或将要回收DNA条带时，每个样品必须使用一个新的枪头。
8、影响DNA 的迁移率的因素：（1）DNA分子大小：DNA分子越小，迁移越快。
（2）DNA分子构象：共价闭环DNA>线形DNA>开环双链DNA。
（3）琼脂糖浓度：其浓度越低，迁移越快。
（4）两极间电压：电压越高，迁移越快。
9、DNA区带不清晰，有可能是点样量少或过大，但也有可能是电压过高、凝胶有气泡、凝胶孔破裂的原因。
10、为了消除RNA的影响，可以在电泳前加RNA酶(约每10μL DNA加1μL R NA 酶)，37℃水浴30min。
11、在进行电泳的过程中，溴酚蓝有可能会变黄，这是由于电泳液使用过久或残留在电泳液中的凝胶变质引起DNA 结构改变或丢失。
时常更换电泳液和刷洗电泳槽即可。
实验二大肠杆菌感受态细胞细胞的制备一【实验目的】学习大肠杆菌感受态细胞的制备方法。
二【实验原理】在进行基因克隆时，体外构建的DNA重组子必须导入合适的受体细胞，才可以复制，增殖和表达。
裸露的外源DNA直接进入细胞体内称为转化。
载体与外源目的基因构成的重组载体可以通过转化直接导入受体细胞，从而实现基因在异源细胞的表达。
进行转化时，要求细胞处于容易吸收外源DNA的状态，即感受态，重组分子才能进入细胞内。
通过CaCl2处理的大肠杆菌细胞就是一种感受态细胞。
在0℃冷冻处理时，处于CaCl2低渗溶液中的大肠杆菌细胞膨胀成球形。
DNA可吸附于其表面。
在短暂的热冲击下，细胞吸收外源DNA，然后在丰富培养基内复原并增殖，表达外源基因。
带有选择标记基因的外源载体在受体细胞内可表达时，受体细胞表现标记基因的表型，使转化子与非转化子在选择培养基上区分开来。
三【试剂】1、LB 液体培养基：胰蛋白胨10.0 g/L 、酵母提取物5.0 g/L、NaCl 10.0 g/L用NaOH调pH值至7.0，高压灭菌。
固体培养基需加1％琼脂粉。
2、0.05mol/L CaCl2溶液：称取0.28g CaCl2（无水，分析纯），溶于50ml重蒸水中，定容至100ml，高压灭菌。
3、含15%甘油的0.05mol/L CaCl2：称取0.28g CaCl2（无水，分析纯），溶于50ml 重蒸水中，加入15ml甘油，定容至100ml，高压灭菌。
四【仪器设备及材料】E.coli DH5α菌株、eppendorf管、恒温摇床、电热恒温培养箱、台式高速离心机、无菌工作台、制冰机、分光光度计、微量移液枪、高压灭菌锅。
五【实验步骤】1、取大肠杆菌DH5α保存液50μl，接种于4ml LB（或SOB）液体培养基中，37℃，300rpm振荡培养过夜，第二天取50μl转接到新的4ml LB（或SOB）液体培养基中扩大培养3h至OD600=0.35～0.4，在无菌操作台上取1ml菌液于1.5ml离心管中，冰浴10min。
2、4℃，5000rpm离心2min，弃上清液。
3、加入750μl预冷的0.1M CaCl2重悬菌体，冰浴30min。
4、4℃，5000rpm离心2min，弃上清液。
5、加入100μl 冰冷的0.1M CaCl2轻轻重悬菌体，冰浴2h后，4℃保存备用。
六【注意事项】1、细胞生长状态和密度：不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌，最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。