医院微生物室李斯特菌属检验操作规程

合集下载

3M环境李斯特菌测试片操作以及判读

3M环境李斯特菌测试片操作以及判读3M 环境李斯特菌测试片操作以及判读一、测试环境李斯特菌数操作方法1.将未开封的测试片贮藏在<=8o C (46oF)的环境下，并在包装上标示的有效期内使用。

在高湿度的地方，最好在使用前将测试片回复到室温。

2.已开封的测试片，将开口反折，用胶带封好。

3.为防止暴露于潮湿的环境中，请不要冷藏已开封的测试片。

将胶带封好的测试片贮藏在低温干燥的地方，保持时间不超过1个月。

请勿将测试片放在温度>25oC (77oF)和(或)相对湿度>50%的环境中。

4.用涂抹棒、海棉或其它采样设备收集环境样本。

湿润采样设备的液体应<=10mL。

湿润剂可以是无菌水、缓冲蛋白胨水(Buffered Peptone Water,BPW)，或中和缓冲液，如Letheen 肉汤或Dey/Engley (DE)中和肉汤。

5.在无菌环境下在收集的样品中添加5mL，20-30oC，灭过菌的缓冲蛋白胨水(BPW)溶液。

不要将Petrifilm EL 测试片与Vermont 培养基(UVM)、Fraser 肉汤、李斯特菌增菌培养基(LE B)或缓冲李斯特菌增菌培养基(BLEB)共用。

6.混合，蠕动或旋转样品与BPW 的混合液将近一分钟。

将样品置于室温(20-30oC)1h，最久不超过1.5h，以修复损伤的李斯特菌。

7.将测试片置于平坦表面处，揭开上层膜。

8.用3M TM电子移液枪或其它移液器垂直滴加3mL 样品到下层膜的中央。

9.将上层膜缓慢盖下，以免产生气泡。

10.轻轻地将塑料压板放在位于接种区上层膜上。

不要压，扭转或滑动压板。

提起压板。

等至少10分钟，以使胶体凝固。

11.将测试片透明面朝上，可叠放至10片，在35o C±1o C或37o C±1o C下培养28h±2h。

12.Petrifilm EL测试片能够用标准的菌落计数器或其它光学放大器计数或判读。

微生物限度检查操作流程

微生物限度检查工作流程实验前：1.对实验器皿的准备：对玻璃器皿进行清洗，将洗净干燥的平皿、乳钵、刻度吸管等用牛皮纸包裹，放入鼓风干燥箱中于160℃干热灭菌2小时或放入高压蒸汽灭菌柜于121℃湿热灭菌30分钟，备用。

2.对实验用培养基及稀释液的准备：按规定比例配制实验所需的各种培养基及稀释液，包好，放入高压蒸汽灭菌柜于121℃湿热灭菌30分钟，备用。

3.洁净服的准备：将当天实验所用洁净服放入高压蒸汽灭菌柜于121℃湿热灭菌30分钟，备用。

实验中：1.将实验所需器皿、培养基、洁净服、样品、稀释液放入相应的传递窗中，打开紫外灯，照射30分钟。

2.打开洁净室的通风设备1小时以上，观察洁净室各个规定区域的压差是否符合相应规定范围，若不符合，则因通知设备部门及时进行调整。

3.进入洁净室，换上工作鞋，用洗手液洗手，烘干，换上洁净服，戴上口罩、手套，并与喷手器下用75%乙醇或0.1%新洁尔灭对双手进行消毒。

4.进入万级洁净走廊，观察各个规定房间的温度、湿度、压差是否符合规定，并与传递窗中将经紫外灯照射后的样品、器皿稀释液及培养基，放入相应的实验室（如微生物限度检查室或无菌检查室）。

并将培养基的温度控制在45℃以下（若培养基出现凝固现象时，因微波炉加热融化；若温度太高时，则因用纯化水降温至不烫手背宜。

5.打开超净工作台的紫外灯，照射30分钟，然后再打开超净工作台的通风设备。

用75%乙醇或0.1%新洁尔灭对实验所用工作台面进行擦拭消毒（消毒时应遵循由里到外，由上到下，由洁净要求高到洁净要求低的原则）。

6.按照适宜的次序于超净工作台内摆放好稀释液、天平、消毒液、集菌仪、剪刀、镊子等物品，用75%酒精棉球进行消毒，将样品内包装表面用碘酒棉球以及75%酒精棉球依次进行消毒。

将营养琼脂平板与超净工作台的做、中、右各置一个（平板需经下预培养48小时且无菌生长），开盖暴露30min，测定的沉降菌每平板不得超过1cfu，则符合百级超净工作台的沉降菌标准（注：在洁净工作台进行操作时，为防止污染，应用酒精棉球对双手反复消毒）。

微生物限度检查操作规程

微生物限度检查操作规程《微生物限度检查操作规程》一、目的微生物限度检查是用于确认产品是否符合微生物水平要求的一种分析方法。

本操作规程的目的是制定微生物限度检查的操作步骤，确保检查结果的准确性和可靠性。

二、适用范围本操作规程适用于所有需要进行微生物限度检查的产品，包括食品、医药和化妆品等。

三、操作步骤1. 准备工作：清洁实验室工作台面和仪器设备，准备所需的培养基和试剂，并确保仪器设备的正常运转。

2. 取样：按照产品的取样标准，从不同批次或不同位置进行取样，并确保取样的代表性。

3. 样品制备：将取样的产品进行样品制备，包括稀释、搅拌和过滤等步骤，以便于后续的微生物检查。

4. 培养：将样品接种在适当的培养基上，根据不同的微生物种类和要求进行培养，并进行恒温培养一定时间。

5. 计数：在培养一定时间后，对培养基上的菌落进行计数，并按照标准方法进行结果的记录和确认。

6. 结果判定：将检查结果与产品的微生物限度标准进行比对，根据结果作出是否合格的判定。

7. 结果记录：将微生物限度检查的结果进行记录，包括样品信息、操作步骤、检查结果和判定等信息，并将结果报告给相关部门或供应商。

四、注意事项1. 操作人员应具备一定的微生物检测知识和操作技能，严格按照操作规程执行。

2. 实验室应保持清洁、卫生，并进行定期消毒和验证。

3. 实验室设备应定期维护和校准，确保设备的准确性和可靠性。

4. 所使用的培养基和试剂应符合相关标准，存放在干燥、阴凉、避光的环境中。

5. 检查结果应及时报告，并根据结果采取相应的控制措施。

以上就是《微生物限度检查操作规程》的主要内容，希望能够帮助大家更好地进行微生物限度检查，确保产品质量和安全。

微生物检测操作规程

微生物检测操作规程《微生物检测操作规程》一、目的微生物检测操作规程旨在规范微生物检测实验的操作流程，确保检测结果的准确性和可靠性。

二、适用范围本规程适用于实验室内进行微生物检测实验的操作人员，包括但不限于食品、医药、环境等领域的微生物检测。

三、操作流程1. 实验前准备（1）检查所需物品和设备的完整性和清洁度；（2）准备好所需的培养基、培养皿、移液器等实验用品；（3）佩戴实验服和手套，保持操作环境清洁。

2. 样品处理（1）按照标准操作程序采集样品，并确保准确记录样品信息；（2）样品处理前进行必要的预处理，如稀释、离心等。

3. 培养和检测（1）按照操作规程在培养基上均匀涂布样品；（2）标注培养皿的信息，包括样品编号、培养基种类、培养温度等；（3）放置在适当的培养温度下培养一定时间；（4）观察培养皿的生长情况，记录培养时间和结果。

4. 结果分析（1）根据培养结果进行初步鉴定和计数；（2）必要时进行进一步的分离、鉴定和鉴定。

四、质控要求（1）实验操作人员应具备相应的微生物检测知识和技能，并接受相关的培训；（2）严格遵守操作规程，确保实验操作的准确性和一致性；（3）定期对实验室设备、试剂和培养基等进行检查和质量控制，确保其完好和有效。

五、记录和报告实验过程中产生的数据和结果应当及时记录，并进行审查和验证。

对于检测结果，应当制作详细的技术报告，包括检测方法、样品信息、结果分析和结论等内容。

六、实施本规程由实验室主管负责组织实施，并由实验室操作人员严格遵守。

七、附则本规程自发布之日起施行，如有变动将另行制定修订，并及时通知相关人员。

以上即为《微生物检测操作规程》的内容，希望广大实验室操作人员严格按照规程执行，确保微生物检测工作的准确性和可靠性。

微生物检验操作规范

微生物检验操作规范微生物检验是临床上常见的一种检验方法，在检验过程中，如果操作人员操作不规范，很容易导致微生物感染。

一、样品打开和处理接收和打开样本的人员应了解样本对健康的潜在危害，并接受如何使用标准保护方法的培训，特别是在处理破损或泄漏的容器时。

标本的内容器应在生物安全柜中打开，并准备消毒剂。

打开试样进行加工时：1、标本管应在生物安全柜内打开。

2、必须戴手套，并建议保护眼睛和粘膜（护目镜或口罩）。

3、打开试样管时，用纸或纱布抓住塞子，防止飞溅。

二、避免注入传染性物质1、通过认真的实践和操作，避免了因损坏玻璃器皿刺伤而引起的接种感染。

尽量用塑料制品代替玻璃制品。

2、尖锐的工具损坏（如通过皮下注射针、巴斯德玻璃吸管和碎玻璃）可能导致意外注入感染性物质。

3、以下两点可以减少针刺损伤：（1）减少注射器和针头的使用（可以使用一些简单的工具打开瓶塞，然后用吸管代替注射器和针头取样）；（2）当必须使用注射器和针头时，采用配套的锐器装置以确保安全安装。

4、不要再将护套放在用过的注射器针头上。

一次性物品应丢弃在容器中，容器盖应能防止锐器渗透。

三、血清分离1、这项工作只能由受过严格训练的人员进行。

2、术中戴手套及眼、粘膜防护用品。

3、标准的实验操作技术可以避免或减少飞溅物和气溶胶的产生。

血液和血清应小心吸取，不得倾倒。

禁止用嘴吸液体。

4、吸管使用后应完全浸入消毒剂中。

移液管应在消毒剂中浸泡一段时间，然后丢弃或消毒并清洗以供再次使用。

5、带血凝块的废弃样品管加盖后，应放置在适当的防漏容器中进行高压灭菌和/或焚烧。

6、应准备一种合适的消毒剂，以清洗溅出的样本。

四、血液和其他体液、组织和排泄物的标准保护方法设计标准保护方法（包括“常规预防措施”），以降低已知或未知感染源的微生物传播风险。

五、玻璃器皿和锐器1、尽量用塑料制品代替玻璃制品。

只能使用实验室级（硼硅酸盐）玻璃，任何破碎或破裂的玻璃产品都应丢弃。

2、皮下注射针不能用作吸管。

微生物检验操作规程

微生物检验操作规程《微生物检验操作规程》一、检验前准备1. 确保实验室环境清洁整洁，无菌操作台面及仪器设备；2. 熟悉操作规程，准备好所需的培养基、试剂和消毒液；3. 检查培养基和试剂的有效期，确保使用的培养基和试剂符合要求。

二、样本处理1. 将样本送检单与样本一同接收，并核对相关信息；2. 对样本进行消毒处理，避免污染实验室环境；3. 定量取样，确保取样的准确性和可靠性。

三、培养基制备1. 按照培养基说明书的要求，准备培养基，注意培养基的稀释和灭菌；2. 根据需要，将培养基注入培养皿中，准备好后放置在无菌条件下。

四、微生物接种1. 根据样本的来源，选择合适的培养基进行接种；2. 采用无菌技术，进行微生物接种，避免外部污染；3. 对接种的培养皿进行标记，清晰记录接种的菌种和数量。

五、培养条件1. 根据不同微生物的生长要求，设置适当的培养条件，包括温度、湿度、气体组成等；2. 定期观察培养皿的生长情况，记录菌落形态、数量和颜色等信息。

六、鉴定和鉴定1. 根据菌落形态、生理生化特性等进行初步鉴定；2. 利用鉴定试剂或生化指标进行进一步鉴定；3. 如有需要，可进行分子生物学方法进行鉴定。

七、结果记录和报告1. 将鉴定结果详细记录在报告中，包括鉴定的微生物种类、数量、鉴定方法和结果等；2. 及时向送检单位提交检验报告，确保检验结果准确无误。

八、实验后清洁1. 将使用过的培养皿和试剂进行正确的处理和清洁；2. 对实验室操作台面和设备进行消毒，保持实验室环境整洁。

以上是《微生物检验操作规程》的基本操作流程，每一步的操作都应严格遵守操作规范，保证微生物检验结果的准确性和可靠性。

微生物检验操作规程

微生物检验操作规程1.0目的建立微生物检验标准操作规程，保证检验操作规范化。

2.0适用范围适用于本公司相关的微生物检验活动的全过程。

3.0职责3.1 微生物检验员负责微生物检验的全过程；3.2 QC主管负责监督检查本规程的有效实施。

4.0作业内容4.1无菌操作要求4.1.1 接种细菌时必须穿工作服、戴工作帽。

4.1.2专用的工作服、帽及拖鞋，应放在无菌室缓冲间，工作前经紫外线消毒后使用。

4.1.3 接种样品时，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75％酒精棉球将手擦干净。

4.1.4 进行接种所用的吸管，平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼三次后使用。

4.1.5 从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不得触及试管或平皿边。

4.1.6 接种样品、转种细菌必须在酒精灯旁操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞（即硅氟胶塞）都要通过火焰消毒。

4.1.7 接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到环和针与杆的连接处。

4.1.8 吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。

4.2无菌间使用要求4.2.1 无菌间内应保持清洁，工作后用消毒溶液消毒，擦拭工作台面，不得存放与实验无关的物品。

4.2.2无菌间使用前后应将门关紧，打开紫外灯，照射时间不少于30min，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻擦拭，除去上面灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响。

4.2.3处理和接种样品时，进入无菌间操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。

4.3消毒灭菌要求4.3.1灭菌前准备（1）所有需要灭菌的物品首先应清洗晾干，玻璃器皿用纸包装严密，如用金属筒应将上面通气孔打开。

（2）装培养基的三角瓶，内容物不应超过总体积的2/3（例如500mL的三角瓶最好装300～350mL培养基，以防再次加热融化时爆沸）。

李斯特菌检测方法

李斯特菌检测方法
李斯特菌检测方法包括传统的培养方法和分子生物学方法。

传统的培养方法包括：
1. 食物中毒患者粪便、脑脊液、血液等标本的培养：将标本接种于含有富营养的培养基中，如PALCAM、Fraser等培养基，经过24-48小时的培养，观察是否出现李斯特菌的生长。

2. 食品和环境样品的培养：将样品接种于含有富营养的培养基中，如OXOID Brilliance Listeria Agar、PALCAM等培养基，经过24-48小时的培养，观察是否出现李斯特菌的生长。

分子生物学方法包括：
1. PCR检测：通过PCR扩增李斯特菌的DNA序列，检测样品中是否存在李斯特菌。

2. 实时荧光PCR检测：利用实时荧光PCR技术，通过检测PCR反应体系中荧光信号的变化，快速、准确地检测样品中的李斯特菌。

3. 基因芯片检测：利用基因芯片技术，检测样品中李斯特菌的DNA序列，快速、高通量地检测李斯特菌。

4. 免疫学检测：利用抗体对李斯特菌进行检测，包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、荧光免疫分析（FIA）等方法。

微生物检验操作规程

微生物检验操作规程微生物检验操作规程一、实验室的准备工作1.确保实验室环境整洁卫生，空气流通。

2.检查实验室设备及试剂的完好性，如有损坏或过期的试剂应予以更换。

3.准备所需的培养基、试剂和培养器具，并确保其质量符合要求。

4.准备好必要的个人防护用品，如实验手套、口罩、护目镜、实验服等。

二、标本采集和处理1.标本的采集应遵循无菌操作的原则，采集器具需经过高温高压消毒处理。

2.将采集的标本迅速送至实验室，避免暴露于空气中。

3.对于液体标本，如尿液、血液等，应进行无菌操作并进行适当的稀释。

4.对于固体标本，如组织、分泌物等，应进行无菌取样，并进行适当的处理。

三、培养基的准备和使用1.根据需要，准备所需的培养基，并按照说明书进行正确的配制。

2.确保培养基的无菌性，防止细菌、真菌等污染。

3.使用培养基前应进行质控试验，确保培养基的质量符合要求。

4.在使用培养基前，要检查培养基是否出现变质、褪色等异常情况，若有发现，应立即更换。

四、微生物的分离和培养1.将标本取适量，在无菌条件下均匀涂抹于培养基表面，避免重叠。

2.将涂抹好的培养基置于细菌培养箱中，设置适当的温度和湿度，促使微生物的生长。

3.培养箱内不宜存放过多的培养基，以免影响空气流通和温度控制。

4.定期观察培养基的生长情况，并进行记录，一般培养时间为24小时至48小时。

五、微生物的鉴定和鉴定1.根据菌落的形态、大小、颜色等特征，初步判断微生物的种类。

2.利用显微镜观察菌液或菌落的形态、数量、运动性等特征，进一步鉴定微生物。

3.对于不易鉴定的微生物，可使用生化试剂或分子生物学方法进行鉴定。

4.鉴定微生物的结果应进行记录，并与对应的标准对照互相核对。

六、微生物的灭活和处理1.工作台和实验器具在使用前后应进行消毒，以防止微生物的传播。

2.将已鉴定的微生物进行灭活处理，可使用高温高压或化学消毒剂。

3.遵循规定将已处理的微生物进行妥善的处置，防止对环境和人员造成污染和危害。

微生物检验操作规程

食品卫生微生物检验实验室操作技术要求第一节实验室管理制度一、实验室管理制度1．实验室应制定仪器配备管理、使用制度，药品管理、使用制度，玻璃器皿管理、使用制度，并根据安全制度和环境条件的要求，本室工作人员应严格掌握，认真执行。

2．进入实验室必须穿工作服，进入无菌室换无菌衣、帽、鞋，戴好口罩，非实验室人员不得进入实验室，严格执行安全操作规程。

3．实验室内物品摆放整齐，试剂定期检查并有明晰标签，仪器定期检查、保养、检修，严禁在冰箱内存放和加工私人食品。

4．各种器材应建立请领消耗记录，贵重仪器有使用记录，破损遗失应填写报告；药品、器材、菌种不经批准不得擅自外借和转让，更不得私自拿出，应严格执行《菌种保管制度》。

5．禁止在实验室内吸烟、进餐、会客、喧哗，实验室内不得带入私人物品，离开实验室前认真检查水、电、暖气、门窗，对于有毒、有害、易燃、污染、腐蚀的物品和废弃物品应按有关要求执行。

6．科、室负责人督促本制度严格执行，根据情况给予奖惩，出现问题立即报告，造成病原扩散等责任事故者，应视情节直至追究法律责任。

二、仪器配备、管理使用制度1．食品微生物实验室应具备下列仪器：培养箱、高压锅、普通冰箱、低温冰箱、厌氧培养设备、显微镜、离心机、超净台、振荡器、普通天平、千分之一天平、烘箱、冷冻干燥设备、均质器、恒温水浴箱、菌落计数器、生化培养箱，电位PH计、高速离心机。

2. 实验室所使用的仪器、容器应符合标准要求，保证准确可靠，凡计量器具须经计量部门检定合格方能使用。

3．实验室仪器安放合理，贵重仪器有专人保管，建立仪器档案，并备有操作方法，保养、维修、说明书及使用登记本，做到经常维护、保养和检查，精密仪器不得随意移动，若有损坏需要修理时，不得私自拆动，应写出报告，通知管理人员，经科室负责人同意填报修理申请，送仪器维修部门。

4. 各种仪器（冰箱、温箱除外），使用完毕后要立即切断电源，旋钮复原归位，待仔细检查后，方可离去。

李斯特菌检验

李斯特氏菌李斯特菌是1926年英国南非裔科学家穆里在病死的兔子体内首次发现的，1940年被第三届国际微生物学大会命名为李斯特菌。

感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。

李斯特氏菌 - 概况李斯特菌李斯特菌（也称李氏杆菌）引起的急性传染病，以败血病为主要症状，伴有内脏器官和中枢神经系统病变。

李斯特菌是1926年英国南非裔科学家穆里在病死的兔子体内首次发现的，为纪念近代消毒手术之父、英国生理学家约瑟夫·李斯特（1827～1912），1940年被第三届国际微生物学大会命名为李斯特菌。

单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的病原菌。

它能引起人畜的李氏菌的病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。

它广泛存在于自然界中，食品中存在的单增李氏菌对人类的安全具有危险，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一，因此，在食品卫生微生物检验中，必须加以重视。

李斯特菌在环境中无处不在，在绝大多数食品中都能找到李斯特菌。

肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等都已被证实是李斯特菌的感染源。

李斯特菌中毒严重的可引起血液和脑组织感染，很多国家都已经采取措施来控制食品中的李斯特菌，并制定了相应的标准。

其中单增李斯特菌是唯一能引起人类疾病的。

单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的病原菌。

它能引起人、畜的李氏特菌病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。

李斯特氏菌 - 特点李斯特菌快速检测试剂盒1、分布广：存在于土壤、水域(地表水、污水、废水)、昆虫、植物、蔬菜、鱼、鸟、野生动物、家禽。

2、生存环境可塑性大：能在2-42℃下生存(也有报道0℃能缓慢生长)能在冰箱冷藏室内较长时间生长繁殖。

3、适应范围大：酸性、碱性条件下都适应。

4、带菌较高的食品有：牛奶和乳制品；肉类(特别是牛肉)；蔬菜；沙拉；海产品；冰淇凌等。

李斯特氏菌 - 生存环境单核细胞李斯特菌在半固体培养基上生长情况李斯特菌具有较强的反抗力，秋冬时期在土壤中能存活5个月以上，在冰块内也可存活3～5个月，许多冷冻肉类都是它的“温床”。

微生物检验操作规程

QW-8.2.3-04
微生物检验操作规程
1、实验前用0.2%过氧乙酸擦净台面及四周，放好需用的实验器材
及各种溶液，开紫外灯消毒40-60分钟。

2、进入无菌室前应用肥皂洗手，然后用75%酒精球棉将手擦干净。

3、进入无菌间必须穿的专用工作服、帽及拖鞋、口罩，应放在无
菌室缓冲间，工作前经紫外线消毒后使用。

4、使用的吸管、平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使
用的器皿，不能放置再用，消毒用器皿放置不得超过一周。

5、从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位及试管或平
皿边。

6、接种样品必须在酒精灯前操作，接种样品时，吸管从包装中取
出后及打开试管塞都要通过火焰消毒。

7、实验完毕，清洁瓷砖台面。

8、用过的器材进行整理，污染细菌的器材需经高压灭菌或煮沸消
毒。

9、实验者在实验后用肥皂清洗双手或将双手浸泡于0.2%过氧乙
酸溶液中3分钟，用清水冲洗，再用肥皂清洗双手。

10、换下的隔离衣、帽等进行高压消毒，拖鞋放回原处。

11、用毕，再开紫外灯消毒40—60分钟。

12、无菌室和缓冲间每周大扫除一次，保持整洁。

13、每月进行一次紫外线对空气消毒效果测定，如灯管发黑，超过
使用期限，及时更换紫外灯管。

ISO李斯特菌

ISO李斯特菌1、国标标准ISO11290-11996〔E〕食品和动物饮料微生物学----单核增生李斯特氏菌的检测和计数方法------第一部分检测方法1.范围2.参考标准3.定义4.原理5.培育基和试剂6.设备和玻璃器皿7.取样8.待检样品前处理9.程序10.结果表达11.检测报告附录：A.检测程序图B.培育基和试剂的组成和配制C.亨氏斜射光镜检食品和动物饮料微生物学----单核增生李斯特氏菌的检测和计数方法------第一部分检测方法警告：为了保障试验室人员的健康，剧烈推举在适当装备、由有阅历的微生物专家掌握以及检测中的全部培育物得以谨慎处理的试验室进行单核增生李斯特氏菌检测；尤其是剧烈建议孕妇不要从事单核增生李斯特氏菌的2、培育工作。

1.范围本ISO11290具体说明了单核增生李斯特氏菌检测和计数方法。

在绪论中受讲座的局限性，本ISO11290适用于供给人类消费或作为动物饲料的产品。

2.参考标准以下文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后全部的修改单〔不包括勘误内容〕或修订版均不适用于本标准，然而，鼓舞依据本标准达成协议的各方讨论是否可使用这些文件的最新版本。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

IEC 和ISO成员保存目前有效的国际标准的注册。

ISO6887：1983微生物学—微生物检测中稀释液制备的一般导则ISO：1996，食品及动物饲料微生物学—微生物检测通则3.定义本部分ISO3、11290提供以下定义：3.1单核增生李斯特氏菌：在因体选择性培育基上形成典型菌落，并且当进行鉴定和确认其形态的、生理的和生化特征与本部分ISO11290的描述一致的微生物。

3.2单核增生李斯特氏菌的检测：根据本部分ISO11290实施细则确定单核增生李斯特氏菌在给定单位质量或体积的样品中存在与否。

4.原理在本部分ISO11290的限定范围内，检测单核增生李斯特氏菌需要四个连续的阶段〔见附录A检测程序图〕。

葡萄球菌,链球菌,李斯特菌的检验流程的

肠球菌普遍存在于自然界，一般栖居在各种温血和冷血动物的腔肠，甚至昆虫体内，也是健康人体的上呼吸道，口腔或肠道的常居菌。

本菌可以引起心内膜炎，胆囊炎，脑膜炎，尿路感染及伤口感染等多种疾病。

在人类粪便中的数量仅次于大肠菌群，每克成人的粪便中约含２×108个。

由于此污染指示菌比较大肠杆菌对外界环境温度适应性强、抵抗力强及耐受性强，甚至可以与多种抗生素相抵抗和生长营养要求不高，因此在自然界分布广，存活力持久。

在无粪便污染的环境中较大肠菌更易发现，所以，即使检出肠球菌也没有粪便污染的指示作用。

此外，即使在冷冻，干燥性和经中等强度加热处理的食品中检出肠球菌也不能提示肠道致病菌的存在，因为肠球菌比沙门氏菌，致病性大肠杆菌抵抗性及存活率均高。

食品微生物检验主要针对在１０℃和４５℃下可生长发育的粪肠球菌与屎肠球菌，二者在生化特性、ＤＮＡ杂交结果有明显不同。

在４５℃条件下，用含叠氮钠成分的培养基检测此类指示菌是其主要特征。

目前该菌多作为生活饮用水，管道水和一些水质的指示菌。

卫生学家认为，肠球菌类似于大肠菌群的生态活动，但其对恶劣的外环境和冷冻条件具有较强的抵抗力，作为监测水质卫生，环境卫生质量的污染指标更具有卫生学意义。

另据有关报道，大量的（１０9以上）肠球菌可以引起食物中毒，作为一个有卫生学意义的细菌（该菌的污染在某些食品中也常被发现），有些国家已经制定了针对肠球菌污染限量标准，大多制定在０／克～１０5／克范围内。

从预防食物中毒方面，保障人民身体健康考虑，借鉴国外标准，制定适宜的污染限量指标，应尽快摆到议事日程上来。

二、生物学性状１、形态与染色肠球菌属的细菌为革兰氏阳性球菌，多数菌种成双或呈短链状排列；一般无芽胞，无荚膜，少数菌种有鞭毛，陈旧培养物或在厌氧状态下有时呈革兰氏阴性。

２、培养特性在普通琼脂及麦康凯琼脂上形成小菌落，在血琼脂上形成较链球菌稍大的菌落，光滑、较湿润、易乳化，依据种的不同，α、β或γ溶血均可出现。

李斯特氏菌检验指导书

一、适用范围：本方法参照SN0184-93的标准。

适用于出口水产品中单增李斯特氏菌的检验二、原理:单核细胞增生李斯特氏菌是一种能引起人畜共患疾病的致病菌。

它能引起人畜的李氏病，感染后，主要表现为败血症，脑膜炎和单核细胞增多。

在牛津琼脂（OX A）平板上可观察到黑色菌落，在血平板上观察到窄小通明的型溶血环。

显微镜镜下可观察到典型的运动镜检。

三、设备和材料显微镜：1600倍双目光源镜恒温培养箱：36±1℃灭菌吸管：1.0 ml 10.0 ml灭菌试管：10.0 ml灭菌平皿\酒精灯\ 玻片\盖玻片\玻璃棒\药匙\接种环\接种针广口瓶：500 ml 锥形瓶：100ml四、培养基和试剂的配制（A）盐酸吖啶黄溶液精确称取盐酸吖啶黄素40mg溶于10ml的蒸馏水，摇匀，充分溶解，高压灭菌。

（B）萘啶酮酸溶液精确称取40mg萘啶酮酸溶于10ml的0.05mol/L氢氧化钠溶液，振摇均匀，充分溶解，高压灭菌后备用。

（C）0.05 mol /L氢氧化钠溶液精确称取0.1g氢氧化钠溶于50ml灭菌蒸馏水，振摇均匀，充分溶解，备用。

（D）缓冲蛋白胨水精确称取4.5g (±0.1 g)BPW,倒入500 ml锥形瓶中加入275ml蒸馏水搅拌均匀,静置10min，加热煮沸至完全溶解后注入500ml的广口瓶中，高压灭菌后冰箱备用。

（E）改良缓冲蛋白胨将已灭菌过的缓冲蛋白胨水每225ml加盐酸吖啶黄溶液1.8ml。

萘啶酮酸溶液1.1 ml，振摇均匀，备用。

（F）Fraser培养基精确称取的Fraser肉汤，用灭菌蒸馏水定容于10 0 ml的锥形瓶中，加热至完全溶解后，分装于10 ml的试管中，于121℃的高压灭菌15min后备用。

（每100 ml Fraser肉汤加1.7 ml吖啶黄溶液，加0.5 ml萘啶酮酸溶液）。

（G）牛津琼脂（OXA）准确称取6.0g的牛津琼脂用灭菌蒸馏水定容于100 ml的锥形瓶中，摇匀，加热至完全溶解，于121℃的高压灭菌15min，冷却至50-60℃加吖啶黄溶液及萘啶酮酸溶液各1.0ml摇匀，迅速倒入8-10个平皿，存入冰箱备用。

单增李斯特菌PFGE快速分子分型实验室标准操作程序

单增李斯特菌PFGE快速分子分型实验室标准操作程序单增李斯特菌PFGE分型实验室标准操作程序生物安全警示：目前李斯特菌感染剂量尚不确定，取决于宿主的易感性。

高风险感染群体为孕妇、婴儿、免疫力低下病人和老人。

所以，接触李斯特菌的实验人员必须意识到潜在的风险并且注意相关的建议。

Day 0受试培养物单菌落划线于脑心浸液平板，于37℃培养14-18 h。

建议利用螺口管保存菌种一支，并且用同一接种环划线平板。

确保需要时可以对同一培养物进行试验。

Day 11.开启水浴摇床（54-55℃）、水浴箱（55-60℃）和分光光度计。

2.准备TE buffer（10 mM Tris:1 mM EDTA，pH 8.0），配方如下：10 ml 1 M Tris，pH 8.0，2 mL 0.5 M EDTA，pH 8.0，稀释于1000 mL无菌超纯水（临床实验室试剂用水）。

注意：TE buffer用于SeaKem 琼脂糖胶栓制备、悬浮细胞和洗涤裂解的PFGE胶栓。

3.准备溶菌酶（sigma L7651）母液（20 mg/mL），配方如下：a.称量100 mg溶菌酶（器皿放置于冰上保持低温）b.加入5 mL TE buffer，涡旋混合。

c.分装（250 μL）于eppendorf管中，冷冻备用。

4.TE buffer (10 mM Tris:1 mM EDTA，pH 8.0)制备1% SeaKem 金琼脂糖+1%SDS，配方如下：a.20% SDS储液置于55-60℃水浴箱预热；b.称取0.25 g SeaKem 金琼脂糖，加入25 ml TE buffer，温和混匀，微波加热至完全溶解；c.加入2.5 ml 10% SDS，混匀，置于55-60℃水浴箱中备用。

5.将培养物编号标记于Falcon2054管，吸取2 mL TE buffer于管中，用灭菌棉签或接种环刮去培养物，轻轻转动接种环（棉签）将培养物悬浮于TE buffer 中，尽量避免产生气泡。