军团菌属检验标准操作规程
细菌总数检查标准操作规程
细菌总数检查标准操作规程1目的建立规范细菌总数检查标准操作规程，确保检查操作正确。
2范围适用于本公司的细菌总数检查操作。
3职责4术语及定义无5 内容5.1实验5.1.1仪器设备：电热恒温培养箱、电动移液器、生物安全柜、电子天平、PH计。
水浴锅、研钵、玻璃珠、三角瓶。
5.1.2试剂：生理盐水、卵磷脂吐温80-营养琼脂培养基、吐温80、液体石蜡、0.5%氯化三苯四氮唑。
5.1.3耗材：10 mL刻度移液管、90mm培养皿5.2实验前准备5.2.1检查样本是否保持原有的包装状态。
容器不应有破裂，在检验前不得打开，防止样品被污染。
5.2.2接到样品后，应立即登记，编写检验序号，并按检验要求尽快检验。
5.2.3若只有一个样品而同时需做多种分析，如微生物、毒理、化学等，则宜先取出部分样品做微生物检验，再将剩余样品做其他分析。
5.2.4在检验过程中，从打开包装到全部检验操作结束，均须防止微生物的再污染和扩散，所用器皿及材料均应事先灭菌，全部操作应在符合生物安全要求的实验室中进行。
5.2.2供试品处理5.2.2.1液体样品5.2.2.1.1.水溶性的液体样品，用灭菌吸管吸取10mL 样品加到90mL 灭菌生理盐水中，混匀后，制成1：10 检液。
5.2.2.1.2油性液体样品，取样品10g，先加5mL灭菌液体石蜡混匀，再加10mL灭菌的吐温80，在40℃—44℃水浴中振荡混合10min，加入灭菌的生理盐水75mL（在40℃—44℃水浴中预温），在40℃—44℃水浴中乳化，制成1：10 的悬液。
5.2.2.2膏、霜、乳剂半固体状样品5.2.2.2.1亲水性的样品：称取10g，加到装有玻璃珠及90mL 灭菌生理盐水的三角瓶中，充分振荡混匀，静置15min。
用其上清液作为1:10 的检液。
5.2.2.2.2疏水性样品：称取10g，置于灭菌的研钵中，加10mL 灭菌液体石蜡，研磨成粘稠状，再加入10mL 灭菌吐温80，研磨待溶解后，加70mL 灭菌生理盐水，在40℃—44℃水浴中充分混合，制成1：10 检液。
军团菌检验方法实施细则
军团菌检验方法实施细则1适用范围：本细则适用于各类样品中军团菌的检测鉴定。
2检测依据：国家《传染病诊断标准》WS195-2001 军团病诊断标准及处理原则军团病诊断标准及处理原则，卫生部，2002年上海市卫生防疫站1979；卫生防疫细菌检验，第一版，上海科技出版社3设备与材料3.1冰箱：4～-20℃。
3.2恒温培养箱：36±1℃。
3.3振荡器3.4显微镜40x 100x3.5离心机12000rpm3.6架盘药物天平：0 g -500g, 精度0.5g。
3.7锥形瓶：100 mL、500 mL。
3.8灭菌吸管：1mL (具0.01mL刻度)、10mL (具0.1mL刻度)。
3.9灭菌平皿：直径90 mm。
3.10灭菌试管：16 mm×160 mm.。
一般用的是18*180mm3.11 温水浴箱：36±1℃3.12 二氧化碳培养箱：5%CO236±1℃3.13 紫外灯3.14 过滤器4培养基和试剂4.1 BCYEα琼脂成份：N-2-乙酰胺基-2-氨基乙烷磺酸（ACES） 10.00 克氢氧化钾片（85%KOH 试剂级） 2.80 克活性炭（Norit A） 1.50 克酵母浸膏（Difco） 10.00 克琼脂（Difco） 17.00 克α-酮戊二酸（单钾盐） 1.00 克L-半胱氨酸盐酸盐（溶于10毫升蒸馏水中） 0.40 克焦磷酸铁（溶于10毫升蒸馏水中） 0.25 克蒸馏水 1000 毫升4.2甘氨酸、万古霉素、多粘菌素B（GVP）琼脂成份：除上述每升BCYEα琼脂成份外，再加：甘氨酸 3.00 克万古霉素 5.00 毫克多粘菌素B 10 万单位4.3 明胶酶试验培养基：此培养基的制备，除用明胶（每100ml 中加3g ）代替琼脂外，其它同BCYE α培养基。
4.4 酪氨酸BCYE α培养基：在BCYE α琼脂中除去碳粉，再于每升培养基中加0.45g 酪氨酸。
军团菌属
3. 抵抗力
1）对化学消毒剂、干燥、紫外线较敏感 2）对氯或酸有一定抵抗
二、致病性与免疫性
1. 致病物质：
多种酶：磷酸酯酶
毒素：细胞毒素
菌毛 微荚膜
2.所致疾病：军团菌病
* 传播途径：
1)主要通过呼吸道吸入带菌飞沫 2)中央空调冷却塔用水污染军团Biblioteka 菌而导致感染* 临床类型：
1)流感样型（轻症型） 2)肺炎型（重症型） 3)肺外感染
一、生物学性状
1. 嗜肺军团菌的形态学特征
* G－杆菌，常规染色不易着色
Giemsa染色：呈红色
Dieterle镀银染色：呈黑褐色
* 端生或侧生鞭毛，有微荚膜和菌毛
* 在组织中呈短杆状，人工培养基上呈
多形态性
2. 培养特性及抗原结构
* 需氧菌，营养要求高 * 抗原组成： 菌体抗原：分型依据，我国流行 1~6型 鞭毛抗原
军团菌属
检验系 刘涛
* 军团菌是引起军团病的病原体，首发于1976 年的美国退伍军人一次聚会，故称作军团病 * 军团菌在自然界普遍存在，在天然水源及人 工冷、热水管系统更多见 * 军团菌在1984年被正式列入变形菌门、γ-变
形菌纲、军团菌目、军团菌科、军团菌属，
其属下共有46个菌种。
嗜肺军团菌 L. pneumophila
3. 免疫性
* 嗜肺军团菌为胞内寄生菌
* 细胞免疫在抗感染中起主要作用
三、微生物学检查法
四、防治原则
谢谢
军团菌检验-金盛楠
根据WHO官方网站的数据，温度对军团菌生长的影响如下：
◆ Above 70 °C (158 °F) - 几乎立即死亡 ◆ At 60 °C (140 °F) - 90% 在2分钟内死亡 (Decimal reduction time (D) = 2) ◆ At 50 °C (122 °F) - 90% 在 80-124 分钟内死亡, 根据菌株不同而有所 区别 (Decimal reduction time (D) = 80-124) ◆ 48 to 50 °C (118 to 122 °F) – 能够生存，但不能繁殖 ◆ 32 to 42 °C (90 to 108 °F) – 理想生长温度 ◆ 25 to 45 °C (77 to 113 °F) – 生长温度范围 ◆ Below 20 °C (68 °F) – 能生存，处于休眠状态，即使在冰冻条件下
Etiologic agent
Legionella species
Legionella species
Attack rate*
< 5%
> 90%
Isolation of organism
Possible
Virtually never
Outcome
Hospitalization common Case-fatality rate: 5-30%**
流行病学特点
1、传染源 兼性厌氧保内寄生菌，广泛存在于自然界水源与人工管道水源中，
空调系统冷却塔、循环蓄水池等是军团菌的常住地。主要寄生在原核 生物细胞体内，如阿米巴。原核生物不但提供各种军团菌所需要的营 养成分，在环境不利的情况下也为军团菌提供了一个庇护的场所，也 是军团菌转移、迁徙与感染高等动物与人的载体。原虫被军团菌裂解 后大量的菌体被释放到水体、环境中，通过宾馆一些能产生气溶胶的 器件而被人体吸入感染。
淋浴水嗜肺军团菌检测原始记录
淋浴水嗜肺军团菌检测原始记录管理编号：xxx/XX-XXX报告编号：第页/ 共页检测项目淋浴水中嗜肺军团菌送检日期检毕日期检测环境温度：ºС 相对湿度：% 检测地点样品来源样品编号仪器型号及编号检测方法或依据参照GB/T 18204.5-2013 《公共场所卫生检验方法第5部分：集中空调通风系统》和ISO11731-1998《水中军团菌检测方法》一、试验器材及试剂1、细菌培养皿2、BCYE培养基3、BCYE-CYS培养基4 、选择性培养基：GVPC培养基5、酸缓冲液6、灭菌水二、样品前处理1、采样：用高压灭菌的玻璃瓶取水样0.5L。
2 、送样：将样品避光避热一天内送达实验室，从采样到培养的时间间隔最大不超过15天。
三、检验步骤1、样品预处理水样：将水样mL用0.22μm微孔滤膜过滤，用镊子将滤膜转移到具帽容器中，加入15mL 灭菌水，在震荡器上震荡，时间不少于2min。
肉眼可见浑浊的污水水样可直接培养。
将预处理过的样品分成三部分，一部分不作处理，一部分热处理，一部分酸处理。
热处理：将1mL样品加入到无菌容器中50℃水浴处理30分钟。
酸处理：取1mL样品加入到无菌容器中，加入1 mL酸缓冲液，作用5min。
检测人：校核人：淋浴水嗜肺军团菌检测原始记录管理编号：xxx/XX-XXX报告编号：第页 / 共页2、接种各取0.1mL三种样品（未处理、热处理、酸处理）接种到GVPC培养基上，用无菌接种环将接种物均匀地涂抹于培养基表面。
热处理、酸处理的接种物处理过后立即进行接种。
3、培养待接种物水分被培养基吸收后，倒置培养基平皿，于5% CO2培养箱中37℃培养10天。
注意保持培养箱内湿度。
每隔三天观察培养的菌落的形态。
记下各种形态菌落的数目。
四、结果判定1、军团菌的鉴定从GVPC培养基上选择至少三个具有军团菌特征的菌落（未处理、热处理、酸处理的三种样品每个样品取三个菌落），接种于BCYE培养基和BCYE-CYS 培养基上，37℃培养2天以上。
军团菌诊断血清明书
军团菌诊断血清使用方法
经初步生化检查，疑似军团菌菌株时，应将可疑菌落制备成检测抗原，先用多价血清做玻片凝集实验，阳性反应时，再与相应的单价血清做玻片凝集实验，做出诊断。
具体方法如下：
1.产品在使用前最好恢复温度到室温。
2.将可疑菌落转接到BCYE平板中培养，在洁净玻片上用接种环滴加两滴彼此分离的生理盐水。
3.用接种环挑取一环用BCYE生长平板中培养2~3天的可疑菌落，分别与玻片上的生理盐水混匀。
4.用接种环滴加1~2滴血清于玻片上一个菌落与生理盐水的混合液中，另一个菌落与生理盐水的混合液中加入一滴生理盐水作为对照。
5.用接种环分别混匀玻片上的两种混合液。
6.凝集结果判断结果如下：
反应强度判断依据
4+ 反应澄清透明，凝集颗粒较多、较大
3+ 反应澄清透明，凝集颗粒较多、较小
2+ 反应有些混浊，但仍可见较多颗粒状凝集1+ 反应非常混浊，只有少许颗粒状凝集
- 反应完全混浊，未出现任何凝集。
关于军团菌
军团菌的历史一、1976年美国费城退伍军人协会会员中曾爆发急性发热性呼吸道疾病,经研究,发现一种细菌命名为嗜肺军团菌.随后,许多有关细菌暂被列入这一属,且追溯研究发现早在1943年即有军团人员病的病例.现已提出了超过30种军团杆菌,至少19种是人类肺炎的病原.其中最常见病原体为嗜肺军团菌(占病例的85%~90%),其次是L.micdadei(占5%~10%),再次是L.bozemanii和L.dumoffii.此类细菌形态相似,具有共同的生化特征,引起类似疾病.二、疾病的范围包括：(1)无症状血清变化；(2)自限性无肺炎的流感样病态,有时叫做庞提阿克热(Pontiac fever)；(3)军团人员病为最严重和最常见到的肺炎类型；(4)局限性,罕见的软组织感染.三、军团病占需住院治疗的社区获得性肺炎的1%~8%,占致死性医院内获得性肺炎的4%左右.大多数病例为散发性,多发生于夏末和秋初.人和人之间的传播尚未得到证实.当给水系统受到污染或形成气溶胶的病原体经空调系统冷凝器的蒸发气体,或污染的淋浴喷头传播时,嗜肺军团菌则暴发流行.军团病可发生于任何年龄,但大多数人都是中年男性.已确定的危险因素包括吸烟,滥用酒精和免疫抑制,特别是由皮质类固醇引起的免疫抑制.四、军团菌是隐藏在空调制冷装置中的致病菌，随冷风吹出浮游在空气中，吸入人体后会出现上呼吸道感染及发热的症状，严重者可导致呼吸衰竭和肾衰竭。
军团菌最早是由于部队室内密闭作业，导致群体发生上呼吸道感染而得名。
军团病是一种非常严重的、有时可以致命的肺炎。
军团病是由军团杆菌引起，这种细菌产生在自然环境中，在温水里及潮热的地方蔓延。
人工供水系统有时也能为军团杆菌的大量繁殖提供生存环境。
这些系统包括淋浴器、矿泉池、喷泉以及空调设备的冷却水塔。
人们通常是由于呼吸了被军团杆菌污染的水源散发的水雾而传染上军团病的。
据估计，在美国每年都有国每年都有8000~18000人感染上军团病。
循环冷却水中嗜肺军团菌的鉴定、培养基与试剂
附录 A（规范性附录）嗜肺军团菌的鉴定A.1 总则嗜肺军团菌作为军团菌中重要检测对象，在特定情况下应进一步用生化培养和血清学试验鉴定嗜肺军团菌。
A.2 生化培养法判定嗜肺军团菌A.2.1 氧化酶试验：使用铂/铱接种环或玻璃棒，挑取待测菌落于滤纸上，加一滴氧化酶试剂，如果在30s内出现紫红色、紫罗兰或深蓝色为阳性；2min不变色为阴性。
A.2.2 硝酸盐还原试验：将待测菌接种到硝酸盐培养基上，在36℃±1℃培养1d～3d，加入甲液和乙液各一滴，观察结果。
立刻或数分钟内显红色为阳性，培养基颜色无变化为阴性。
注：本试验阴性的原因有三个：细菌不能还原硝酸盐；亚硝酸盐继续分解，生成氨和氮；培养基不适于细菌的生长。
如欲检查培养基中硝酸盐是否未被分解，可再加入锌粉少许，可使硝酸盐还原为亚硝酸盐而呈现红色。
A.2.3 尿素酶试验：将待检菌以较大量穿刺接种在尿素琼脂培养基上，36℃±1℃培养2h、4h、24h，分别观察结果，培养基变为红色为阳性,颜色不变为阴性。
A.2.4 明胶液化：将待测菌穿刺接种在明胶培养基内，于36℃±1℃培养24h±2h,取出放置于4℃±2℃冰箱内10min-30min后再观察结果，仍呈溶解状或表面溶解时即为明胶液化试验阳性；凝固不溶者为阴性。
A.2.5 马尿酸水解试验：挑取待测菌落，加到盛有0.4mL1%马尿酸钠的试管中制成菌悬液。
混合均匀后在36℃±1℃水浴中温育或36℃±1℃培养箱中培养24h。
沿着试管壁缓缓加入0.2mL茚三酮溶液，在36℃±1℃水浴中温育或36℃±1℃培养箱中放置10min后观察结果。
15min内溶液出现蓝紫色变化则为阳性；溶液无颜色变化或15min之后出现蓝紫色变化为阴性。
试验时为了避免假阴性需用标准菌株做阳性对照。
A.2.6 生化培养结果判定：氧化酶（－/弱+），硝酸盐还原（－），尿素酶（－），明胶液化（+），水解马尿酸（+），即可确定为嗜肺军团菌。
军团菌细菌分离鉴定作业指导书
军团菌细菌分离鉴定作业指导书【方法】1、标本运送和保存：军团菌抵抗力较强，但仍需尽快送实验室，以防污染菌生长。
应避免反复冻融。
水样标本应尽可能快或最好2d内送到指定实验室，不必冷冻，但应避光和防止受热，室温下贮存不得超过15d。
收到水样后应尽快进行检测，尤其对于已知含有生物防腐剂的样品，最好采样当天检测。
2、形态观察革兰染色：幼龄菌为革兰阴性短小杆菌，培养数日后可见多形性和长丝状。
革兰染色还可见菌体有空泡。
鞭毛染色可见1—2根单鞭毛和侧鞭毛，无荚膜、无芽胞。
3、培养特性观察：将待检菌接种BCYE平板、F-G平板、血平板和巧克力（色）血平板上，须置37℃，2.5%二氧化碳，需氧高湿度环境下培养37天。
如果在48小时内出现菌落或在这些培养液上均生长，则不是军团菌，如果仅在BCYE或F-G平板上生长，另外两种平板上不生长，而且至少在72小时以后出现菌落，则可能是军团菌。
在BCYE平板上4—5天可形成针尖大小的菌落，继续培养数日后菌落直径可增大至4—5mm。
菌落灰白色、圆形、湿润、有光泽、边缘透明。
呈刻花玻璃样条纹为其特征。
菌落较为黏着，并有特有的酸臭味。
在紫外线可见表面呈现白色自发荧光。
在F-G平板上培养10天才见生长，并可产生棕色色素。
4、生化反应触酶、氧化酶、β-内酰胺酶及马尿酸水解实验均阳性，不分解糖类产酸、脲酶及硝酸盐还原实验阴性。
5、气相色谱显示军团菌的细胞脂肪酸组成，易与其他细菌区别。
6、血清学检查（1）微量凝集实验：首先将军团菌标准株接种于BCYE或其他专用培养液上，35℃2.5%二氧化碳，需氧高湿度环境下培养3—4天，用0.01mol/l、pH7.4磷酸盐缓冲液（PBS）洗下菌苔，沸水浴1小时杀菌。
2000rpm离心10分钟后弃去上清液。
用含0.5%福尔马林的磷酸盐缓冲液配成悬液，使其浓度在420nm波长，光径1cm时吸光度值为0.65，即为诊断菌液。
诊断菌液在用前加石炭酸复红液1ul。
临床助理医师微生物学考点军团菌属.doc
201５年度临床助理医师微生物学考点:军团菌属嗜肺军团菌1976年在费城的退伍军人大会期间,爆发了不明原因的肺炎,从病人体内分离出了一种革兰阴性杆菌,后命名为嗜肺军团菌。
一、生物学性状1、形态染色:Ｇ—短小杆菌,多形性,有鞭毛、菌毛及微荚膜，无芽胞。
2、专性需氧,2.5－5%CO2生长良好,营养要求较高，需特殊培养基—活性炭酵母浸出液琼脂(ＢCYE),生长缓慢,3－5天可见针尖大小灰白色S型菌落。
3、抵抗力：普遍存在于天然淡水和人工水域环境中,如自来水、热水淋浴、中央空调等，故能以气溶胶的方式传播，对化学消毒剂、干燥、紫外线敏感。
二、致病性与免疫性致病机制不很明确。
主要引起军团菌病，飞沫传播，常见于夏秋季。
临床上有3种类型:流感样型、肺炎型、肺外感染型。
流感样型(旁地亚克热):轻症、发热、寒战、上感症状、无肺炎。
肺炎型（军团病）:重症、高热、咳嗽、肺炎、多器官衰竭死亡。
肺外感染型(继发感染):多脏器感染症状。
细胞免疫为主。
治疗首选红霉素。
２0１5年度临床助理医师微生物学考点:葡萄球菌属一.金黄色葡萄球菌(一)生物性状１、颜色和染色：无芽胞,无鞭毛2、培养特性:需氧或兼性厌氧。
培养营养要求不高。
属内不同菌种可产生金黄色、白色、柠檬色等脂溶性色素并使菌落着色。
■致病性葡萄球菌菌落呈金黄色,于血琼脂平板上生长后在菌落周围还可见完全透明溶血环（B溶血)。
3、生化反应：①多数能分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖,产酸不产气。
②致病性菌株能分解甘露醇,产酸。
③触酶（过氧化氢酶)阳性,可与链球菌相区分。
4、抗原:⑴葡萄球菌A蛋白(ＳPA)：存在于细胞壁上的表面抗原，可与IgG的Fc段结合，可进行协同凝集，并具有抗吞噬等生物学活性。
⑵荚膜多糖:有利于黏附和抗吞噬。
⑶多糖抗原：具有群特异性,存在于细胞壁。
５、分类：⑴按DＮA相关性分:金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌。
⑵按有无凝固酶(血浆凝固酶)分：凝固酶阳性菌、凝固酶阴性菌。
军团菌检测方法
军团菌检测方法军团菌概况军团菌是一种环境感染性致病菌，可引起急性呼吸道传染病，即军团菌病。
军团菌分布极其广泛，医院、酒店等的供水系统、空调的冷却系统等各种水源均易于滋生、污染军团菌，并造成军团菌病传染的风险。
即与水有关的地方均可能存在军团菌。
军团菌传播、感染有以下特点：1、透过空气、水份感染，传播带季节性，超过50%病例在夏季发生。
2、滋生在医院、酒店的供水系统，通过过水龙头、浴室传播。
3、可通过空调的冷却系统，由通风口传播并感染对象。
军团菌属革兰氏阴性杆菌，专性需氧，无芽孢，无荚膜，军团菌需要半胱氨酸和铁，无半胱氨酸时，军团菌无法生长。
生化特征还有不发酵也不氧化糖类，不还原硝酸盐，氧化酶实验阴性或弱阳性，尿素酶阴性，军团菌生长的最适pH为6.9-7.0，2%-5%CO2能促进部分菌株的生长。
军团菌生长缓慢，易于被其它菌落覆盖。
军团菌的菌落颜色多样，通常呈白色、灰色、蓝色或紫色，也能显深褐色、灰绿色、深红色。
菌落整齐，表面光滑，在紫外灯下，有荧光。
目前军团菌分为64种血清型及42个种。
ISO11731水样中军团菌检测方案采样：一般用玻璃或聚乙烯等无菌容器采样。
如果水样中含有消毒剂，需在采样前或采样后加入中和剂，含氯或氧化型消毒剂可用硫代硫酸钠或硫代硫酸钾作中和剂。
水样应当天检测为佳。
样品富集：如果样品中军团菌的数目预计多于105cfu/L，直接取样涂布于GVPC平板上分离培养检测。
如果样品中军团菌的数目未知或较少时，一般采用滤膜法或离心法富集军团菌。
滤膜法：将水样以0.22μm滤膜过滤浓缩，然后加入5ml无菌水，超声波振动混匀3min后为浓缩样品。
离心法：将水样置于高速离心机中，6000g离心15min，(15℃-25℃)，弃去上清，然后加入2ml-10ml无菌水，混匀后为浓缩样品。
样品处理：将浓缩样品分三份，一份直接取样涂布于GVPC平板上分离培养。
一份酸处理：2ml浓缩液+2ml缓冲液(0.2mol/L的HCl 3.9ml+ 0.2mol/L的KCl 25ml,KOH溶液调pH2.0±0.2)，摇匀5±0.5min。
微生物检验实验室军团菌属检验标准操作规程
微生物检验实验室军团菌属检验标准操作规程1. 概述军团菌属细菌是一群病死率较高的急性呼吸道传染病的病原菌，该菌属包括45个种（60多个血清型），已从人体分离出的有嗜肺军团菌、米克戴德军团菌、波兹曼军团菌等20种。
嗜肺军团菌是军团菌属的代表种。
2. 标本类型痰等标本。
3. 鉴定3.1 形态与染色革兰阴性纤细小杆菌。
荧光显微镜下可见被荧光抗体包被的发亮菌体。
3.2 培养特性在缓冲活性炭酵母提取物琼脂（BCYE）培养基上，本菌生长缓慢，应每日观察生长情况，在BCYE 上需要3~5日方可见菌落，数日后增大到4~5mm，菌落呈灰白色，有光泽。
3.3 生化反应大部分菌株氧化酶试验阳性，不分解糖类，动力、明胶、马尿酸钠试验阳性，触酶试验阳性，多数菌株产生β-内酰胺酶。
3.4 鉴别要点3.4.1 本菌属特征革兰阴性细小杆菌，有多形性，苏丹黑染色可显蓝黑色或蓝灰色脂肪滴。
在BCYEα平板上3~5日形成蓝灰色、有光泽的菌落。
普通琼脂平板上不生长。
3.4.2 根据在BCYEα琼脂上生长的菌落，在紫外线365nm灯光照射下产生红色荧光可推断为红色军团菌；产生蓝白色荧光，如氧化酶阳性，则为博氏和其他军团菌，如氧化酶阴性，则为杜氏、戈氏、彻氏、图森山军团菌；产生无色荧光，则根据马尿酸水解、氧化酶及其他生化反应进一步鉴定。
3.5 操作步骤3.5.1 涂片、染色革兰阴性杆菌。
3.5.2 鉴定直接荧光抗体染色，生化反应。
4.药敏参见《药物敏感性试验标准操作规程》及CLSI M100-S20最新版本文件。
5.质量控制见《质量管理程序》。
6.检验结果解释与分析本菌虽然营养要求和培养环境要求严格，但在外环境分布较广，并可长期存活，致使通过污染水源空气而传播致病。
从临床或环境标本中分离军团菌时，需先对标本作酸处理（军团菌耐酸而其他杂菌则易被酸杀灭），并使用选择性琼脂平板（在BCYEα琼脂平板上加入抗生素等抑制杂菌），以提高军团菌的检出率。
公共场所环境样品中嗜肺军团菌定量检验方法（2）
公共场所环境样品中嗜肺军团菌定量检验方法（2）公共场所环境样品中嗜肺军团菌定量检验方法1范围青岛精诚仪器仪表有限公司本标准规定了公共场所空气、水、土等不同类别环境样品中嗜肺军团菌的定量检测方法。
本标准适用于公共场所环境样品中嗜肺军团菌的定量检测，其他环境样品中嗜肺军团菌的定量检测可参照执行。
2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。
凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T18204.3公共场所卫生检验方法第3部分：空气微生物GB/T18204.5公共场所卫生检验方法第5部分：集中空调通风系统3空气中嗜肺军团菌定量检测3.1原理采用液体冲击法采样、叠氮溴乙锭（EMA）前处理结合定量聚合酶链反应(qPCR)方法定量检测室内空气和集中空调送风中存活的嗜肺军团菌。
3.2仪器和设备3.2.1微生物气溶胶浓缩器：采样流量≥100L/min，3.0μm以上粒子的捕集效率≥80%（或浓缩比≥8）。
3.2.2液体冲击式微生物气溶胶采样器：采样流量7L/min～15L/min，0.5μm以上粒子的捕集效率≥90%。
3.2.3便携式冷藏箱。
3.2.4冷冻离心机：温度4?C。
3.2.5恒温水浴锅或金属浴：温度范围50?C～99?C。
3.2.6荧光定量PCR仪：非耦合6色激发光片和6色检测滤光片通道，4°C–100°C温度范围。
3.2.7卤素灯：500W。
3.2.8涡旋震荡器：调速范围0~3000rpm。
3.3材料和试剂3.3.1酵母浸出粉。
3.3.2蒸馏水。
3.3.3EMA固体粉：5mg/管。
3.3.4无核酸酶去离子水。
3.3.5矿物油，用于减少气溶胶采样时的吸收液蒸发。
3.3.6核酸提取试剂盒：DNA产量15～30μg，A260/A280在1.7～1.9之间。
3.3.7引物：上游引物5’-GAAAATAAAGTAAAAGGGGAAGCC-3’；下游引物5’-ATCAATCAGACGACCAGTGTATTC-3’。
军团菌属检验标准操作规程
军团菌属检验标准操作规程1. 概述军团菌属细菌是一群病死率较高的急性呼吸道传染病的病原菌，该菌属包括45个种（60多个血清型），已从人体分离出的有嗜肺军团菌、米克戴德军团菌、波兹曼军团菌等20种。
嗜肺军团菌是军团菌属的代表种。
2. 标本类型痰等标本。
3.鉴定3.1 形态与染色革兰阴性纤细小杆菌。
荧光显微镜下可见被荧光抗体包被的发亮菌体。
3.2 培养特性在缓冲活性炭酵母提取物琼脂（BCYE）培养基上，本菌生长缓慢，应每日观察生长情况，在BCYE上需要3~5日方可见菌落，数日后增大到4~5mm，菌落呈灰白色，有光泽。
3.3 生化反应大部分菌株氧化酶试验阳性，不分解糖类，动力、明胶、马尿酸钠试验阳性，触酶试验阳性，多数菌株产生β-内酰胺酶。
3.4 鉴别要点3.4.1 本菌属特征革兰阴性细小杆菌，有多形性，苏丹黑染色可显蓝黑色或蓝灰色脂肪滴。
在BCYEα平板上3~5日形成蓝灰色、有光泽的菌落。
普通琼脂平板上不生长。
3.4.2 根据在BCYEα琼脂上生长的菌落，在紫外线365nm 灯光照射下产生红色荧光可推断为红色军团菌；产生蓝白色荧光，如氧化酶阳性，则为博氏和其他军团菌，如氧化酶阴性，则为杜氏、戈氏、彻氏、图森山军团菌；产生无色荧光，则根据马尿酸水解、氧化酶及其他生化反应进一步鉴定。
3.5 操作步骤3.5.1 涂片、染色革兰阴性杆菌。
3.5.2 鉴定直接荧光抗体染色，生化反应。
4.药敏参见《药物敏感性试验标准操作规程》及CLSI M100-S20最新版本文件。
5.质量控制见《质量管理程序》。
6.检验结果解释与分析本菌虽然营养要求和培养环境要求严格，但在外环境分布较广，并可长期存活，致使通过污染水源空气而传播致病。
从临床或环境标本中分离军团菌时，需先对标本作酸处理（军团菌耐酸而其他杂菌则易被酸杀灭），并使用选择性琼脂平板（在BCYEα琼脂平板上加入抗生素等抑制杂菌），以提高军团菌的检出率。
军团菌对多种抗菌药物敏感，包括红霉素、利福平、氨基糖苷类抗生素、β-内酰胺抗生素、复方磺胺甲恶唑、多西环素和福喹诺酮类等。
水处理系统军团菌检测及消毒方法
水处理系统军团菌检测及消毒方法作者：范春红来源：《科技创新导报》 2012年第34期范春红（鞍山师范学院附属卫生学校化学教研室辽宁鞍山 114000）摘?要：军团病的爆发主要是由于空调水等人工水体感染军团菌引起，因此对于系统中军团菌的检测和消毒方法越来越受到人们的重视。
该文对军团菌的检测方法和消毒方法进行了综述。
关键词：军团菌检测方法消毒方法中图分类号：R372 文献标识码：A文章编号：1674-098X（2012）12（a）-0-01军团菌是一种革兰氏阴性杆菌，广泛存在于土壤、水体中，可通过含菌气溶胶的方式在空气中散布，当人体进行呼吸时，菌气进入体内引起感染，军团病的病死率高达22.8%[1]。
军团病临床病例中由嗜肺军团菌所引起的病例占军团病的80%[2]。
因此制定规范的检测方法与指标标准对该病的预防与控制具有重要意义，而且，杀灭自然及人工水体中的嗜肺军团菌是控制军团病发生的主要环节。
1?军团菌实验室检测方法军团菌人工培养条件的苛刻及其生长代谢的缓慢导致临床与环境标本检出率低下，从而造成事实上的假阴性漏检，对军团病的预防与治疗十分不利。
现有的军团菌实验室检测方法主要有以下几种。
1.1?分离培养是诊断军团菌，尤其是诊断嗜肺军团菌（LP）最准确的方法，最适培养基为BCYE培养基（即活性炭—酵母提出液琼脂）国外培养阳性率可达50%～80%，但国内还达不到这么的百分率。
培养时应用含军团菌抗体的琼脂培养及免疫放射自显影技术或克隆杂交技术，可更好地检测和计数军团菌菌落。
Steinmetz等利用军团菌特异性的单克隆抗体MAb2125进行克隆印迹分析，可于2 h内在培养基上众多菌落中筛选出军团菌落。
分离培养用时比较长，操作也比较复杂，且在某些标本中还会存在着其他的物质，他们会阻止军团菌的生长，给培养带来了困难，无法观察到军团菌的完整的初期现象。
1.2?直接免疫荧光法（DFA）这种方法也是检测军团菌最常用方法。
空调系统军团菌的检验分析方法
附件公共场所集中空调通风系统卫生规范1.总则为了预防公共场所集中空调通风系统（以下简称空调系统）传播传染病，保护人体健康，依据《中华人民共和国传染病防治法》、《公共场所卫生管理条例》、《突发公共卫生事件应急条例》和《传染性非典型肺炎防治管理办法》，制定本规范。
本规范规定了公共场所空调系统的一般卫生要求、传染病流行期卫生要求、净化消毒装置卫生要求、卫生学评价和卫生管理要求。
2.适用范围本规范适用于公共场所使用的空调系统，其它场所空调系统可参照执行。
3.规范性引用文件下列文件中的条款通过本规范的引用而成为本规范的条款。
凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本规范，然而，鼓励根据本规范达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本规范。
GB/T 18883 室内空气质量标准GB 9663-9673 公共场所卫生标准GB/T 18204.1 公共场所空气微生物检验方法卫生部消毒技术规范4.术语与定义4.1 集中空调通风系统为使房间或封闭空间空气温度、湿度、洁净度和气流速度等参数达到给定的要求，而对空气进行处理、输送、分配，并控制其参数的所有设备、管道及附件、仪器仪表的总和。
4.2 空气传播性传染病以空气为主要传播途径的传染病。
4.3 空气净化采用某些技术或方法去除室内空气中的颗粒物、微生物和气态污染物。
4.4 可吸入颗粒物（PM10）能够进入人体呼吸道的空气动力学当量质量中位径为10微米的颗粒物。
5.空调系统的卫生要求5.1 一般要求5.1.1 空调系统新风量和运行参数应符合国家卫生标准和要求，新风采气口的设置应保证所吸入的空气为室外新鲜空气，新风采气口应远离建筑物排风口和开放式冷却水塔。
严禁间接从空调通风的机房、建筑物楼道及天棚吊顶内吸取新风。
5.1.2 空调系统的新风口和回风口应安装防鼠、防虫设施。
5.1.3 空调系统的过滤器（网）、表冷器、加热（湿）器、冷凝水盘应每年进行一次全面检查、清洗或更换。
水中军团菌检测(ISO)
1.适用范围本方式适用于各类环境中的样品包括饮用水、工业用水和自然界中的水及沉淀物和污泥中的军团菌测定。
2.培育基与试剂GVPC：基础琼脂：军团菌CYE琼脂基础Oxoid (CM0655B)。
添加剂：军团菌BCYE添加剂Oxoid (SR0110A)和军团菌GVPC选择性添加剂Oxoid (SR0152E)。
制备： CYE溶解在90ml蒸馏水中, 121ºC/15分钟灭菌, 冷却到50ºC, 将SR110A用10mL 50ºC无菌蒸馏水溶解后无菌加入到以上的培育基中, 混合均匀, 再无菌吸取2mLSR0152E（用10mL无菌蒸馏水溶解）加入到上述培育基中，混匀后，倾倒平板。
BCYE：基础琼脂：军团菌CYE琼脂基础Oxoid (CM0655B)。
添加剂：军团菌BCYE添加剂Oxoid (SR0110A)。
制备： CYE溶解在90ml蒸馏水中, 121ºC/15分钟灭菌, 冷却到50ºC, 将SR110A用10mL 50ºC无菌蒸馏水溶解后无菌加入到以上的培育基中, 混合均匀,倾倒平板。
BCYE-Cys：基础琼脂：军团菌CYE琼脂基础Oxoid (CM0655B)。
添加剂：不含L-半胱氨酸的军团菌BCYE添加剂Oxoid (SR0175A)。
制备： CYE溶解在90ml蒸馏水中, 121ºC/15分钟灭菌, 冷却到50ºC, 将SR175A用10mL 50ºC无菌蒸馏水溶解后无菌加入到以上的培育基中, 混合均匀,倾倒平板。
酸缓冲液配制：A液 HCl（10mL 1M的HCl加入到40mL的蒸馏水中） 39mlB液 KCl 溶解在1L无菌蒸馏水中) 250mlA, B液混合后用1M 的KOH调剂pH至±,室温下的保质期一个月.血平板(BA)革兰氏染色液军团菌乳胶凝集试剂盒Oxoid（DR0800M）。
3.设备及容器ø90mm无菌培育皿。
集中空调送风中嗜肺军团菌的测定原始记录
有限公司
集中空调送风中嗜肺军团菌的测定原始记录
年 月 日颁布
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项目编号
温度（℃）
湿度（RH%）
检测依据
公共场所集中空调通风系统卫生规范 WS 394-2012 附录 G 集中空调送风中嗜肺军团菌检验方法 公共场所卫生检验方法 第 5 部分：集中空调通风系统 GB/T 18204.5-2013 9 空调送风中嗜肺军团菌
复核：
BCYE-CYE 平板 35-37℃培养 2 天
氧化酶 （-/弱+）
生化试验
硝酸盐 尿素酶 还原（-） （-）
明胶液 水解马 化（+） 尿酸
血清学 实验
结果 报告
备注
日期：
年月日
- -J156
有限公司
集中空调送风中嗜肺军团菌的测定原始记录（续表）
年 月 日颁布
第 页共 页
样品编号
分析：
CO2 培养 35-37℃ 培养 10 天
仪器名称
生化培养箱
仪器型号
仪器编号
检验步骤
1、样品的酸处理：对采样后的吸收液 GVPC 液体培养基和酵母提取液原液各取 1ml，分别加入盐酸氯化钾溶液（0.01mol/L）充分混合，调 PH 至 2.2，静置 15min。 2、样品的接种与培养：在酸处理后的 2 种样品中分别加入 1mol/L 氢氧化钾溶液，中和至 PH 为 6.9，各取悬液 0.2-0.3ml 分别接种 GVPC 平板。
菌落 无可疑菌落 有可疑菌落 无可疑菌落 有可疑菌落 无可疑菌落 有可疑菌落 无可疑菌落 有可疑菌落 无可疑菌落 有可疑菌落 无可疑菌落 有可疑菌落 无可疑菌落 有可疑菌落 无可疑菌落 有可疑菌落 无可疑菌落 有可疑菌落 无可疑菌落 有可疑菌落 无可疑菌落
嗜肺军团菌检测标准
嗜肺军团菌检测标准一、引言嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）是一种革兰氏阴性杆菌，是人类军团病的主要病原体。
军团病是一种由吸入含有嗜肺军团菌的气溶胶引起的急性呼吸道传染病。
为确保公共卫生安全，准确、快速地检测嗜肺军团菌成为防控军团病的关键环节。
本文将详细介绍嗜肺军团菌的检测标准，以期为相关领域提供有益的参考。
二、样本采集与处理1.样本采集：采集疑似军团病患者呼吸道分泌物、痰液、支气管肺泡灌洗液等样本。
采样时应遵循无菌操作原则，避免污染。
2.样本处理：将采集到的样本立即送至实验室，进行处理。
处理过程中，应对样本进行匀浆、离心等操作，以提取细菌。
三、实验室检测1.细菌培养：将处理后的样本接种于选择性培养基上，如BCYE培养基。
在35-37℃、5%二氧化碳环境下培养3-10天，观察菌落形态。
2.生化试验：对疑似菌落进行生化试验，如氧化酶试验、尿素试验、马尿酸盐试验等，以初步鉴定嗜肺军团菌。
3.分子生物学检测：采用PCR（聚合酶链式反应）等分子生物学技术对疑似菌落进行核酸检测，以确定嗜肺军团菌的存在。
PCR检测具有较高的灵敏度和特异性，可用于嗜肺军团菌的快速诊断。
四、结果判定与报告根据实验室检测结果，结合患者临床表现和流行病学史，进行综合判断。
如细菌培养、生化试验和分子生物学检测结果均符合嗜肺军团菌特征，可判定为嗜肺军团菌感染。
检测报告应包括患者信息、样本信息、检测方法和结果等内容。
五、质量控制与注意事项1.质量控制：实验室应建立严格的质量控制体系，包括定期校准检测设备、验证检测方法的准确性、参加室间质评等，以确保检测结果的准确性和可靠性。
2.注意事项：在样本采集、运输、处理和检测过程中，应严格遵守生物安全规范，防止交叉感染和实验室感染。
同时，实验室人员应具备相应的专业技能和生物安全意识，确保检测工作的顺利进行。
六、总结与展望本文详细介绍了嗜肺军团菌的检测标准，包括样本采集与处理、实验室检测、结果判定与报告以及质量控制与注意事项等方面。
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军团菌属检验标准操作规程
1. 概述
军团菌属细菌是一群病死率较高的急性呼吸道传染病的病原菌，该菌属包括45个种（60多个血清型），已从人体分离出的有嗜肺军团菌、米克戴德军团菌、波兹曼军团菌等20种。
嗜肺军团菌是军团菌属的代表种。
2. 标本类型
痰等标本。
3.鉴定
3.1 形态与染色革兰阴性纤细小杆菌。
荧光显微镜下可见被荧光抗体包被的发亮菌体。
3.2 培养特性在缓冲活性炭酵母提取物琼脂（BCYE）培养基上，本菌生长缓慢，应每日观察生长情况，在BCYE上需要3~5日方可见菌落，数日后增大到4~5mm，菌落呈灰白色，有光泽。
3.3 生化反应大部分菌株氧化酶试验阳性，不分解糖类，动力、明胶、马尿酸钠试验阳性，触酶试验阳性，多数菌株产生β-内酰胺酶。
3.4 鉴别要点
3.4.1 本菌属特征革兰阴性细小杆菌，有多形性，苏丹黑染色可显蓝黑色或蓝灰色脂肪滴。
在BCYEα平板上3~5日形成蓝灰色、有光泽的菌落。
普通琼脂平板上不生长。
3.4.2 根据在BCYEα琼脂上生长的菌落，在紫外线365nm 灯光照射下产生红色荧光可推断为红色军团菌；产生蓝白色荧光，如氧化酶阳性，则为博氏和其他军团菌，如氧化酶阴性，则为杜氏、戈氏、彻氏、图森山军团菌；产生无色荧光，则根据马尿酸水解、氧化酶及其他生化反应进一步鉴定。
3.5 操作步骤
3.5.1 涂片、染色革兰阴性杆菌。
3.5.2 鉴定直接荧光抗体染色，生化反应。
4.药敏
参见《药物敏感性试验标准操作规程》及CLSI M100-S20最新版本文件。
5.质量控制
见《质量管理程序》。
6.检验结果解释与分析
本菌虽然营养要求和培养环境要求严格，但在外环境分布较广，并可长期存活，致使通过污染水源空气而传播致病。
从临床或环境标本中分离军团菌时，需先对标本作酸处理（军团菌耐酸而其他杂菌则易被酸杀灭），并使用选择性琼脂平
板（在BCYEα琼脂平板上加入抗生素等抑制杂菌），以提高军团菌的检出率。
军团菌对多种抗菌药物敏感，包括红霉素、利福平、氨基糖苷类抗生素、β-内酰胺抗生素、复方磺胺甲恶唑、多西环素和福喹诺酮类等。
7.临床意义
军团菌是一种以肺部感染为主的全身性疾病，嗜肺军团菌是军团菌病的病原菌，可通过空气传播进入肺脏，临床表现多种多样。
易于侵犯患有慢性器质性疾病、免疫功能低下的病人。
也可从河水、空调的冷却水、浴室和雾化器等处分离到，为医院感染的主要致病菌之一。
8.鉴定流程。