半乳甘露聚糖检测用于侵袭性曲霉菌早期感染诊断的研究

半乳甘露聚糖检测用于侵袭性曲霉菌早期感染诊断的研究
目的评价酶联免疫吸附试验（ELISA）检测半乳甘露聚糖（GM）抗原在侵袭性曲霉菌（IA）早期感染诊断和疗效监测中的临床价值。

方法以62例呼吸内科、重症医学科及血液内科造血干细胞移植（HSCT）患者为研究对象，针对患者连续检测，共检测标本188份。

采用ELISA法测定患者血清中GM含量，测定浓度可达0.5ng/ml。

同时对所选病例进行G实验检测和真菌培养，所得结果与GM结果联合分析。

结果以1.0为阳性界值，GM检测的敏感性为53.8%，特异性100%，诊断符合率88.7%；以0.5为阳性界值，敏感性为84.6%，特异性96.7%，诊断符合率95.2%。

G实验显示以GM0.5为阳性界值GM阳性患者血浆（1-3）-β-D-葡聚糖含量为（68.58±12.76）pg/ml，GM阴性患者血浆（1-3）-β-D-葡聚糖含量为（3.18±1.25）pg/ml，两组数据经t-检验比较具有统计学意义（P＜0.05）。

GM检测可早于真菌培养方法9d预测曲霉感染。

曲霉菌感染患者GM的连续监测显示抗曲霉菌治疗前GM水平保持在较高水平，抗真菌治疗有效患者的GM 含量呈下降趋势，无效死亡患者仍保持较高水平。

结论血清GM检测是侵袭性曲霉菌早期感染诊断和疗效监测的有用指标，与G实验联合应用判断效果更好。

标签：半乳甘露聚糖；曲霉菌；早期感染
近年来侵袭性曲霉菌感染（IA）发病率逐渐增多，已经成为免疫功能低下患者致死率高的主要原因。

有报道称在造血干细胞移植（HSCT）患者中IA的发病率为2%～26%，实体器官移植患者中的发病率为1%～15%，死亡率可达到74%～92%。

在中性粒细胞减少的患者（抗肿瘤治疗后）和使用免疫抑制剂（干细胞移植、器官移植特别是骨髓抑制）或皮质类固醇的患者，患者一旦发生曲霉菌感染，死亡率高达50%～90%。

研究开发早期、快速、准确的诊断方法对疾病的预后具有决定性的意义。

半乳甘露聚糖（GM）是曲霉菌丝壁上的热稳定多糖抗原，有一个非免疫原性甘露聚糖核心和含半乳呋喃糖基的免疫反应性侧链。

其半乳糖残基具有抗原性，目前检测该成分快速诊断曲霉菌病受到广泛关注，被称为最有前景的检测曲霉菌感染的血清学方法。

1资料与方法
1.1一般资料取自2012年1月～12月皖南医学院弋矶山医院呼吸内科、重症医学科、血液内科住院患者送检的血液、肺泡灌洗液等标本62例。

实验组32例，其中男20例，女12例，入选实验组均符合以下标准：发热（T>37.5℃），经广谱抗生素治疗4d后无效；长期中性粒细胞减少；胸部影像学检查出现新发病灶或出现肺部感染症状。

对照组30例，其中男19例，女11例，为相应科室同时期住院患者，均无深部真菌感染临床症状。

1.2诊断标准IA分3类：第1类确诊IA，第2类高度怀疑IA（也称临床诊断），第3类可疑IA，诊断标准均符合欧洲癌症治疗组织真菌病研究组（EORTC/MSG）制订的IA诊断标准[5]。

1.3样本采集患者每3～4d用真空采血管采静脉血3ml，采血后48h内完成检测。

连续检测GM抗原直到治疗后症状和体征好转、体温下降至正常后2w，或患者死亡，或排除IA诊断为止。

32例实验组共检测血清样本128份，30例对照组检测样本60份。

所有患者还同时进行影像学检查，痰或血的病原菌培养，部分患者收集支气管肺泡灌洗液进行培养及肺活检进行组织培养或病理学检查。

1.4 GM检测方法法国BIO-RAD公司的曲霉菌酶免检测试剂盒（PlateliaTM Aspergillus EIA）简述如下：分别加300μl被测血清或（质控物）到每个1.5ml 聚丙烯试管，每个试管加100μl血清处理液，用力混合或震荡以彻底混匀试管，100℃水浴3min，10000g离心10min，上清液用来检测GM抗原。

每个孔中加50μl酶结合物，然后加50μl处理过的血清标本上清液或质控物，封板37℃干燥孵育90min，洗涤5遍，每孔迅速加200μl底物显色剂，避光室温下孵育30min，每孔中加入100μl终止液，波长为450nm下测试每孔的吸光度（A值）。

每次实验cut-off值均值必须在0.3～0.8之间，阳性对照/cut-off值均值大于2，阴性对照值/cut-off值均值小于0.4作为实验内质控。

2次连续采集样本均为阳性或者同一份标本连续两次检测均为阳性才能判断该实验结果为曲霉菌感染阳性。

将IA 刚开始治疗时所测得的GM光密度与含1ngGM标准品所测得的光密度的比值（GM指数GMI）作为基础值。

在第7d治疗结束时采血样测得的GMI与基础GMI相比较，当增加1.0时，被认为治疗失败。

在第14d治疗结束时采血样测得的GMI与基础GMI相比较，当增加1.0，被认为治疗失败。

1.5 G实验检测方法真空采血管取静脉血3ml后，混匀，3000r/min离心1min 得富含血小板血浆，分离出血浆在10min内使用，取上述富含血小板血浆0.1ml 加入装有0.9ml样品处理液中轻轻混匀后，70℃保温10min，取出后立刻放入冷水浴中3min冷却至30℃以下，即为待测血浆样品，取待测血浆样品0.2ml加入反应主剂中，轻轻混匀20s待完全溶解后用微量加样器转移至10×65mm无热原平底反应管中，立刻插入MB-80微生物快速动态检测系统中进行反应，反应结束后自动计算含量。

2结果
2.1不同界值时血清GM的结果及敏感性和特异性患者血清的GM值计算公式为被检血清A 值/cut-off均值A值。

如果以GM值1.0为阳性界值判断标准，0.8<GM值<1.0为可疑判断标准，实验组32例患者中7例阳性，阳性率21.9%，3例可疑，22例阴性。

对照组30例全部阴性。

如果以GM值0.5为阳性界值判断标准，实验组32例患者中13例阳性，阳性率40.6%，19例阴性，对照组30例中1例阳性，29例阴性。

以GM值1.0为阳性界值判断标准，曲霉菌ELISA 检测方法的敏感性为5
3.8%，特异性为100%，假阳性率为0，假阴性率为30.8%，诊断符合率为88.7%；而以GM值0.5为阳性界值判断标准，曲霉菌ELISA检测方法的敏感性为8
4.6%，特异性为96.7%，假阳性率为6.1%，假阴性率为1
5.4%，诊断符合率为95.2%。

因此以GM值0.5为阳性界值时，虽特异性有所下降，假阳性率略有升高，但敏感性和诊断符合率明显升高，假阴性明显下降。

2.2 GM 实验阳性与G实验结果以GM值0.5为阳性界值，GM阳性患者血浆（1-3）-β-D-葡聚糖含量为（68.58±12.76）pg/ml，GM阴性患者血浆（1-3）-β-D-葡聚糖含量
为（3.18±1.25）pg/ml，两组比较有统计学意义（P＜0.05）。

2.3连续监测GM值与疗效的关系GM检测同时对患者进行标本接种培养，结果显示GM检测阳性可早于真菌培养方法9天预测曲霉感染，且对13例GM 阳性患者进行抗曲霉菌治疗，9例有效，4例无效死亡。

每3～4d采集患者静脉血进行GM值测定，连续14d，发现4例治疗无效死亡患者的血清GM值居高不下或进行性升高，9例治疗有效患者的血清GM值呈现下降趋势。

3讨论
侵袭性真菌感染是指侵袭性深部组织和内部以及全身的真菌感染，包括深部组织感染和真菌血症。

近20年来，由于大剂量广谱抗生素、抗肿瘤药物及免疫抑制剂的长期应用，各种导管在体内的介入以及恶性肿瘤艾滋病等免疫功能低下患者的不断增加。

侵袭性真菌感染的发病率明显上升，在医院感染中占有重要地位，日益成为患者死亡的重要原因之一[5]。

侵袭性真菌感染临床诊断比较困难，临床表现可因感染部位不同、临床症状体征不具有特异性，而不易与细菌感染相区别。

目前GM诊断IA还存在着患者因素、实验标准、标本因素等问题，因此需要针对不同科室的患者群以及标本类型等统一实验条件，选取合适的OD值及阳性界值，使各实验室之间具有可比性。

该实验选取了呼吸内科、重症医学科、血液内科的标本，但未详细区分标本类型是血液还是肺泡灌洗液，且收集标本量较少，这在今后的实验过程中需加以改进和丰富标本量。

总之，GM检测IA具有早期、快速、敏感性高、特异性高、诊断符合率高等特点，有待于在临床实验室广泛开展，在临床诊断IA时需综合临床症状体征及其他诊断措施，达到早期诊断、早期治疗、降低病死率目的。

参考文献：
[1]Yilmaz Turay U，Yildrim Z，Turkoz Y，et e of pleural fluid C reactive protein in diagnosis of pleural of effusion[J].Respir Med，2000，94（5）：432.
[2]Anthiong PCY，Shiu SC，Tak WL，et al.Thoracoscopic management of malignant pleural effusions[J].Chest，1996，109：1234-1236.
[3]曾治平，罗江洪.侵袭性肺部真菌感染实验室诊断研究进展[J].中国老年学杂志，2010，30（16）：2391-2393.。