碱裂解法原理染色体DNA比质粒DNA分子大得多
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
核酸的提取及鉴定
核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物 信息分子，是分子生物学研究的主要对象， 因此核酸的提取是分子生物学实验技术中最
重要、最基本的操作 。
一、核酸的分类
DNA (脱氧核糖核酸)
主要存在于细胞核的染色体中。 核外也有少量DNA，如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA （cpDNA），质粒DNA。
细胞器DNA－差速离心法
线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身可编码蛋 白，它们的比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度 也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各 种组分分级分离出来。
差速离心法原理
是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。 将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速 进行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层， 从而得以分离。
磁珠
磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的 物，从而达到分离目的。
（三）基因组DNA－其它方法
浓盐法：
利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离
有机溶剂抽提法：
有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用
密度梯度离心法：
利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物
（四）动物基因组DNA的提取
终浓度
0.1% 2%(W/ 1.4M （V/V）使 V) 用前加入
Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；
EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；
NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中； CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；
终浓度
PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶
的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能
和多糖结合，有效去除多糖。
（二）基因组DNA提取－ CTAB法
植物材料
CTAB法流程图
裂解液
酒精沉淀
液氮研磨
抽提
离心洗涤
DNA溶液
细胞裂解
上层溶液
干燥溶解
（二）基因组DNA的提取－ SDS法 SDS法原理
注：CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的
植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。
（二）基因组DNA的提取－ CTAB法
CTAB提取缓冲液的经典配方
组份
Tris-HCl EDTA NaCl （pH8.0） （pH8.0） 100 mM 20 mM
CTAB
β-巯基乙醇
质粒DNA－碱裂解法
碱裂解法原理
染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分 子，而质粒DNA为共价闭合环状分子； 当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共 价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象； 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉 淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相 中，从而可通过离心将两者分开。
主要方法： (1)浓盐法 利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度不同，将二者分离。 1）用1M 氯化钠提取,得到的DNP粘液 2) 与含有少量异戊醇的氯仿一起摇荡,使乳化 3) 离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相 中间，而DNA位于上层水相中 4) 用2倍体积95%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来.
组份 终浓度 Tris-HCl EDTA （pH8.0） （pH 8.0 ） 10 mM 20 mM NaCl 0.4M SDS 2%
（二）基因组DNA的提取－ SDS法
SDS法流程图 （以动物组织为例）
动物组织
抽提 离心洗涤
组织匀浆
上层溶液
干燥溶解
细胞裂解
酒精沉淀
DNA溶液
（三）基因组DNA－其它方法
SDS 是一种阴离子去垢剂，在高温（ 55 ～ 65℃）条件下能裂解细 胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸； 提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖 杂质沉淀，离心后除去沉淀； 上清液中的 DNA用酚 /氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的 DNA。
SDS法DNA提取缓冲液
质粒DNA－碱裂解法
碱裂解法流程图
对数期菌体 上清液 沉淀
溶液I充分重悬
抽提
干燥溶解
溶液II裂解
酒精沉淀
质粒DNA溶液
溶液III中和
离心洗涤
质粒DNA－煮沸法
煮沸法原理
染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分 子，而质粒DNA为共价闭合环状分子； 当加热处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共 价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象； 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉 淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相 中，从而可通过离心将两者分开。
RNA（核糖核酸）
存在于细胞质中，如mRNA, rRNA, tRNA等。
Βιβλιοθήκη Baidu
除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和噬 菌 体，其或只含DNA，或只含有RNA。
二、DNA提取的几种方法
(一） 非基因组DNA的提取 质粒DNA的提取
• 碱裂解法 • 煮沸法
线粒体、叶绿体DNA的提取 • 差速离心结合SDS裂解法
β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除
（二）基因组DNA的提取－ CTAB法
组份
CTAB提取缓冲液的改进配方
Tris-HCl EDTA NaCl （pH8.0） （pH8.0） 100 mM 20 mM 1.4M CTAB 3%(W/ V) PVP40 5%(W/ V) β-巯基乙醇 2%（V/V） 使用前加入
（二）基因组DNA的提取－ CTAB法
CTAB法原理
CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基 溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合 物。 该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂 抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离 出来。
根据细胞裂解方式的不同有：
物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法
化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法
生物方式：酶法
（三）基因组DNA－其它方法
根据核酸分离纯化方式的不同有： 吸附材料结合法：
硅质材料
高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。 快捷高效。
• • •
阴离子交换树脂
低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。 适用于纯度要求高的实验。
核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物 信息分子，是分子生物学研究的主要对象， 因此核酸的提取是分子生物学实验技术中最
重要、最基本的操作 。
一、核酸的分类
DNA (脱氧核糖核酸)
主要存在于细胞核的染色体中。 核外也有少量DNA，如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA （cpDNA），质粒DNA。
细胞器DNA－差速离心法
线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身可编码蛋 白，它们的比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度 也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各 种组分分级分离出来。
差速离心法原理
是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。 将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速 进行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层， 从而得以分离。
磁珠
磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的 物，从而达到分离目的。
（三）基因组DNA－其它方法
浓盐法：
利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离
有机溶剂抽提法：
有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用
密度梯度离心法：
利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物
（四）动物基因组DNA的提取
终浓度
0.1% 2%(W/ 1.4M （V/V）使 V) 用前加入
Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；
EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；
NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中； CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；
终浓度
PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶
的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能
和多糖结合，有效去除多糖。
（二）基因组DNA提取－ CTAB法
植物材料
CTAB法流程图
裂解液
酒精沉淀
液氮研磨
抽提
离心洗涤
DNA溶液
细胞裂解
上层溶液
干燥溶解
（二）基因组DNA的提取－ SDS法 SDS法原理
注：CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的
植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。
（二）基因组DNA的提取－ CTAB法
CTAB提取缓冲液的经典配方
组份
Tris-HCl EDTA NaCl （pH8.0） （pH8.0） 100 mM 20 mM
CTAB
β-巯基乙醇
质粒DNA－碱裂解法
碱裂解法原理
染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分 子，而质粒DNA为共价闭合环状分子； 当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共 价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象； 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉 淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相 中，从而可通过离心将两者分开。
主要方法： (1)浓盐法 利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度不同，将二者分离。 1）用1M 氯化钠提取,得到的DNP粘液 2) 与含有少量异戊醇的氯仿一起摇荡,使乳化 3) 离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相 中间，而DNA位于上层水相中 4) 用2倍体积95%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来.
组份 终浓度 Tris-HCl EDTA （pH8.0） （pH 8.0 ） 10 mM 20 mM NaCl 0.4M SDS 2%
（二）基因组DNA的提取－ SDS法
SDS法流程图 （以动物组织为例）
动物组织
抽提 离心洗涤
组织匀浆
上层溶液
干燥溶解
细胞裂解
酒精沉淀
DNA溶液
（三）基因组DNA－其它方法
SDS 是一种阴离子去垢剂，在高温（ 55 ～ 65℃）条件下能裂解细 胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸； 提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖 杂质沉淀，离心后除去沉淀； 上清液中的 DNA用酚 /氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的 DNA。
SDS法DNA提取缓冲液
质粒DNA－碱裂解法
碱裂解法流程图
对数期菌体 上清液 沉淀
溶液I充分重悬
抽提
干燥溶解
溶液II裂解
酒精沉淀
质粒DNA溶液
溶液III中和
离心洗涤
质粒DNA－煮沸法
煮沸法原理
染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分 子，而质粒DNA为共价闭合环状分子； 当加热处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共 价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象； 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉 淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相 中，从而可通过离心将两者分开。
RNA（核糖核酸）
存在于细胞质中，如mRNA, rRNA, tRNA等。
Βιβλιοθήκη Baidu
除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和噬 菌 体，其或只含DNA，或只含有RNA。
二、DNA提取的几种方法
(一） 非基因组DNA的提取 质粒DNA的提取
• 碱裂解法 • 煮沸法
线粒体、叶绿体DNA的提取 • 差速离心结合SDS裂解法
β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除
（二）基因组DNA的提取－ CTAB法
组份
CTAB提取缓冲液的改进配方
Tris-HCl EDTA NaCl （pH8.0） （pH8.0） 100 mM 20 mM 1.4M CTAB 3%(W/ V) PVP40 5%(W/ V) β-巯基乙醇 2%（V/V） 使用前加入
（二）基因组DNA的提取－ CTAB法
CTAB法原理
CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基 溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合 物。 该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂 抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离 出来。
根据细胞裂解方式的不同有：
物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法
化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法
生物方式：酶法
（三）基因组DNA－其它方法
根据核酸分离纯化方式的不同有： 吸附材料结合法：
硅质材料
高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。 快捷高效。
• • •
阴离子交换树脂
低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。 适用于纯度要求高的实验。