核酸分子杂交与应用
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• 基因组DNA探针：有细菌、病毒、原虫、真菌、动物和人类细胞DNA探针，多为某一基 因的全部或部分序列，或某一非编码序列。
• cDNA探针：以mRNA为模板经过逆转录酶催化产生的互补于mRNA的DNA链。
2020年10月29日星期
5
四
探针的种类
• DNA探针优点： • 1、一般克隆在质粒载体中，可以无限繁殖； • 2、DNA探针不易降解 • 3、DNA的标记方法比较成熟。
牛血清白蛋白
2020年10月29日星期
12
四
标记步骤
• 3、加入除标记核苷酸外的其他三种脱氧核糖核苷酸溶液(也可以是多种标记核苷酸)， 20mmol/L溶液各1μl。 以下操作要在同位素工作室中有防护措施的情况下进行操作
• 4、加入100μCi(10μl)标记的核苷酸溶液。注：应贮存在－20oC冰箱中，使用前在室 温下放置15～30分钟融化。要尽量减少冻融次数。
大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段末 端标记法
T4DNA聚合酶标记法
2020年10月29日星期
23
四
大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段末
端标记法：
标记反应步骤： (1)在反应管中依次加入下列试剂并混匀
DNA
1μg
10xKlenow片段缓冲液
2mmol/L3种dNTP(无dATP)
[α-32P]dATP
2020年10月29日星期
13
四
标记步骤
• 5、加入无菌蒸馏水，至终体积为46.5μl，混匀 • 6、加入0.5μl稀释的DNase I溶液，混匀 • 7、加入1μl(5U)DNA聚合酶I溶液，混匀 注：以上操作均在冰浴中进行 • 8、置14～16oC水浴中保温1～2小时 • 9、加入2μl 0.5mol/L EDTA终止反应 • 10、纯化标记的DNA探针
• 切口平移法 • 标记原理：是目前实验室是最常用的一种脱氧核糖核酸探针标记法。利用大肠杆菌DNA
聚合酶1的多种酶促活性将标记的dNTP掺入新合成DNA链中使探针被标记。 带缺口(nick)的线状、超螺旋及环状双链DNA均可作为切口平移法的模板。
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四
DNase I
DNA Pol I,α-32P-dNTP
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四
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3
四
核酸探针的标记 探针(probe)是指用放射性核素或其 它标记物标记的核酸片段。
放射性标记
标
记
生物素标记
物 非放射性标记 地高辛标记
2020年10月29日星期 四
荧光素标记 4
探针的种类
• DNA探针：双链或单链DNA探针是最常用的核酸探针。长度在几百碱基对以上。DNA探针 又分为：
• 2、取200ng双链DNA溶于1μl蒸馏水中，在蜡膜上与1μl随机引物充分混匀，吸入一毛 细玻璃管中，用火封严两端。置沸水浴中30分钟并迅速置冰水浴中1分钟。将DNA转入 上述离心管中
• 3、加入1μl(5U)DNA聚合酶Klenow片段，混匀并离心，室温反应3小时以上
2020年10月29日星期
• 寡核苷酸(oligo)探针：由17～50mer组成的短探针。 • 优点： • 可根据需要人工合成相应的序列； • 因片段短，只有一个核苷酸突变，其Tm值也有明显变化，特别适用于点突变的检测 • 杂交速度快特异性强 • 缺点：所带标记物少灵敏度低；片段短杂交体不稳定
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四
探针的标记
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四
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四
标记步骤
• 1、冰浴中，在一微量离心管内顺序加入下列溶液，并混匀
20mmol/L
DTT
1μl
5mmol/L dATP、dGTP、dTTP 1μl
10x随机引物缓冲液
1μl
标记dCTP
3μl
水
1μl
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ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
标记步骤
0μCi 加水至
25μl
10xKlenow片段缓冲液
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四
单 链 DN A 探 针 的 标 记
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四
探针的标记
• 随机引物法 • 标记原理：随机引物是含有各种可能排列的寡聚核苷酸片段的混合物，可以与任何核
酸序列杂交，起到聚合酶促反应的引物作用。将待标记的探针模板与随机引物一起退 火，合成标记探针。
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1
四
核酸分子杂交：来源相同或不同的DNA 甚至DNA与RNA分子变性后，在合适的 条件下通过碱基互补形成双链杂交体 的过程称核酸分子杂交(molecular hy bridization)。核酸分子杂交技术是 目前生物化学和分子生物学研究中应 用最广泛的技术之一，也是临床分子 检验的重要技术。
19
四
标记步骤
• 4、取10μl终止缓冲液，置－20oC保存备用
终止缓冲液
50mmol/L
Tris.Cl(pH7.5)
50mmol/L
NaCl
5mmol/L
EDTA
0.5%
SDS
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四
随机引物标记法特点
• 1、除能进行双链DNA标记外，也可用于单链DNA或RNA探针的标记。当用RNA为模板是， 操作方法同上，但必须采用反转录酶。
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四
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四
标记步骤
• 1、取1μgDNA溶于少量无菌蒸馏水中
• 2、加入μl10x切口平移缓冲液，混匀
10x切口平移缓冲液
0.5mol/L
Tris.Cl(pH7.2)
0.1mol/L 1mmol/L
MgSO4 二硫苏糖醇(DTT)
500μg/ml
• 2、标记活性高，只需25ng样品DNA，可在3小时内使40％～60％以上甚至90％的标记dN TP掺入到探针DNA链上
• 3、操作方便
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四
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四
3’末端标记 末端标记属于部分标记。特点是可得 到全长DNA片段，但标记活性不高。3’ 末端标记法包括限制酶切和聚合酶合 成两个过程，3’标记有两种方式：
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四
探针的种类
• RNA探针：可以是标记分离的RNA，也可以是重组质粒在RNA聚合酶作用下的转录产物。 其优点是：
• RNA探针为单链，复杂性低，与靶序列杂交反应效率极高 • 因不存在重复序列，因此特异性高 • 本底低 • 缺点：
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探针的种类
• cDNA探针：以mRNA为模板经过逆转录酶催化产生的互补于mRNA的DNA链。
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探针的种类
• DNA探针优点： • 1、一般克隆在质粒载体中，可以无限繁殖； • 2、DNA探针不易降解 • 3、DNA的标记方法比较成熟。
牛血清白蛋白
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标记步骤
• 3、加入除标记核苷酸外的其他三种脱氧核糖核苷酸溶液(也可以是多种标记核苷酸)， 20mmol/L溶液各1μl。 以下操作要在同位素工作室中有防护措施的情况下进行操作
• 4、加入100μCi(10μl)标记的核苷酸溶液。注：应贮存在－20oC冰箱中，使用前在室 温下放置15～30分钟融化。要尽量减少冻融次数。
大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段末 端标记法
T4DNA聚合酶标记法
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大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段末
端标记法：
标记反应步骤： (1)在反应管中依次加入下列试剂并混匀
DNA
1μg
10xKlenow片段缓冲液
2mmol/L3种dNTP(无dATP)
[α-32P]dATP
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标记步骤
• 5、加入无菌蒸馏水，至终体积为46.5μl，混匀 • 6、加入0.5μl稀释的DNase I溶液，混匀 • 7、加入1μl(5U)DNA聚合酶I溶液，混匀 注：以上操作均在冰浴中进行 • 8、置14～16oC水浴中保温1～2小时 • 9、加入2μl 0.5mol/L EDTA终止反应 • 10、纯化标记的DNA探针
• 切口平移法 • 标记原理：是目前实验室是最常用的一种脱氧核糖核酸探针标记法。利用大肠杆菌DNA
聚合酶1的多种酶促活性将标记的dNTP掺入新合成DNA链中使探针被标记。 带缺口(nick)的线状、超螺旋及环状双链DNA均可作为切口平移法的模板。
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DNase I
DNA Pol I,α-32P-dNTP
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核酸探针的标记 探针(probe)是指用放射性核素或其 它标记物标记的核酸片段。
放射性标记
标
记
生物素标记
物 非放射性标记 地高辛标记
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荧光素标记 4
探针的种类
• DNA探针：双链或单链DNA探针是最常用的核酸探针。长度在几百碱基对以上。DNA探针 又分为：
• 2、取200ng双链DNA溶于1μl蒸馏水中，在蜡膜上与1μl随机引物充分混匀，吸入一毛 细玻璃管中，用火封严两端。置沸水浴中30分钟并迅速置冰水浴中1分钟。将DNA转入 上述离心管中
• 3、加入1μl(5U)DNA聚合酶Klenow片段，混匀并离心，室温反应3小时以上
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• 寡核苷酸(oligo)探针：由17～50mer组成的短探针。 • 优点： • 可根据需要人工合成相应的序列； • 因片段短，只有一个核苷酸突变，其Tm值也有明显变化，特别适用于点突变的检测 • 杂交速度快特异性强 • 缺点：所带标记物少灵敏度低；片段短杂交体不稳定
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探针的标记
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标记步骤
• 1、冰浴中，在一微量离心管内顺序加入下列溶液，并混匀
20mmol/L
DTT
1μl
5mmol/L dATP、dGTP、dTTP 1μl
10x随机引物缓冲液
1μl
标记dCTP
3μl
水
1μl
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ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
标记步骤
0μCi 加水至
25μl
10xKlenow片段缓冲液
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单 链 DN A 探 针 的 标 记
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探针的标记
• 随机引物法 • 标记原理：随机引物是含有各种可能排列的寡聚核苷酸片段的混合物，可以与任何核
酸序列杂交，起到聚合酶促反应的引物作用。将待标记的探针模板与随机引物一起退 火，合成标记探针。
2020年10月29日星期
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核酸分子杂交：来源相同或不同的DNA 甚至DNA与RNA分子变性后，在合适的 条件下通过碱基互补形成双链杂交体 的过程称核酸分子杂交(molecular hy bridization)。核酸分子杂交技术是 目前生物化学和分子生物学研究中应 用最广泛的技术之一，也是临床分子 检验的重要技术。
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四
标记步骤
• 4、取10μl终止缓冲液，置－20oC保存备用
终止缓冲液
50mmol/L
Tris.Cl(pH7.5)
50mmol/L
NaCl
5mmol/L
EDTA
0.5%
SDS
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随机引物标记法特点
• 1、除能进行双链DNA标记外，也可用于单链DNA或RNA探针的标记。当用RNA为模板是， 操作方法同上，但必须采用反转录酶。
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标记步骤
• 1、取1μgDNA溶于少量无菌蒸馏水中
• 2、加入μl10x切口平移缓冲液，混匀
10x切口平移缓冲液
0.5mol/L
Tris.Cl(pH7.2)
0.1mol/L 1mmol/L
MgSO4 二硫苏糖醇(DTT)
500μg/ml
• 2、标记活性高，只需25ng样品DNA，可在3小时内使40％～60％以上甚至90％的标记dN TP掺入到探针DNA链上
• 3、操作方便
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3’末端标记 末端标记属于部分标记。特点是可得 到全长DNA片段，但标记活性不高。3’ 末端标记法包括限制酶切和聚合酶合 成两个过程，3’标记有两种方式：
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探针的种类
• RNA探针：可以是标记分离的RNA，也可以是重组质粒在RNA聚合酶作用下的转录产物。 其优点是：
• RNA探针为单链，复杂性低，与靶序列杂交反应效率极高 • 因不存在重复序列，因此特异性高 • 本底低 • 缺点：
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探针的种类