核酸分子杂交技术概述
核酸分子杂交名词解释
核酸分子杂交名词解释核酸分子杂交是一种重要的分子生物学技术，用于研究核酸的结构、功能和相互作用，并在基因克隆、基因表达调控等领域具有广泛的应用。
以下是与核酸分子杂交相关的重要名词的解释：1. 核酸分子杂交（Nucleic Acid Hybridization）：指将两个不同的核酸分子（DNA或RNA）通过互补的碱基配对形成双链结构的过程。
核酸分子杂交可用于分析DNA或RNA的序列、测定基因表达水平以及检测特定的核酸序列。
2. 探针（Probe）：一条含有特定序列的标记化核酸分子，用于与目标序列进行杂交。
探针通常由放射性核素、荧光染料或酶等标记物标记，以便于在实验中检测其位置和数量。
3. 靶标（Target）：指待被杂交的目标核酸分子，它可以是DNA或RNA，含有待检测或待分析的特定序列。
靶标可以来自于生物样品，如组织、细胞或血清等。
4. 互补序列（Complementary Sequence）：两条核酸分子间相互配对的碱基序列。
在DNA分子中，腺嘌呤（A）与鸟嘌呤（G）通过双氢键相互配对，胸腺嘧啶（T）与胞嘧啶（C）相互配对；在RNA分子中，腺嘌呤（A）与尿嘧啶（U）相互配对，胸腺嘧啶（T）与胞嘧啶（C）相互配对。
5. 杂交化（Hybridization）：指探针与靶标间通过互补序列形成双链结构的过程。
杂交化通常需要一定的时间和温度条件，以保证探针和靶标的互补碱基序列能够正确配对。
6. 杂交化条件（Hybridization Conditions）：影响探针和靶标杂交的因素，包括温度、盐浓度、引物浓度、溶液pH值等。
不同的杂交化条件可选择性地控制互补序列的结合和分离，从而改变杂交的特异性和灵敏度。
7. 杂交化信号（Hybridization Signal）：当探针与靶标杂交时，由于探针上的标记物，如放射性同位素或荧光染料的发光、发射或放射活性，而产生的信号。
通过检测杂交化信号的强度和位置，可以确定探针与靶标的结合情况，以及目标序列的存在与数量。
核酸分子杂交技术
核酸分子杂交技术一、 概述前面已经介绍了核酸分子单链之间有互补的碱基顺序，通过碱基对之间非共价键（主要是氢键）的形成即出现稳定的双链区，这是核酸分子杂交的基础。
杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同源性）就可以形成杂交双链。
分子杂交可在DNA与DNA、RNA与RNA或RNA与DNA 的二条单链之间进行。
由于DNA一般都以双链形式存在，因此在进行分子杂交时，应先将双链DNA分子解聚成为单链，这一过程称为变性，一般通过加热或提高pH值来实现。
使单链聚合双链的过程称为退火或复性。
用分子杂交进行定性或定量分析的最有效方法是将一种核酸单链用同位素或非同位素标记成为探针，再与另一种核酸单链进行分子杂交。
核酸杂交技术基本上是Hall等1961年的工作开始的，探针与靶序列在溶液中杂交，通过平衡密度梯度离心分离杂交体。
该法很慢、费力且不精确，但它开拓了核酸杂交技术的研究。
Bolton 等1962年设计了第一种简单的固相杂交方法，称为DNA-琼脂技术。
变性DNA固定在琼脂中，DNA不能复性，但能与其它互补核酸序列杂交。
典型的反应是用放射性标记的短DAN或RNA 分子与胶中DNA杂交过夜，然后将胶置于柱中进行漂洗，去除游离探针，在高温、低盐条件下将结合的探针洗脱，洗脱液的放射性与结合的探针量呈正比。
该法尤其适用于过量探针的饱和杂交实验。
60年代末，Britten等设计了另一种分析细胞基因组的方法。
该法是研究液相中DNA的复性以比较不同来源核酸的复杂度，典型的方法是：从不同生物体（细菌、酵母、鱼和哺乳动物等）内分离DNA，用水压器剪切成长约450核苷酸（nt）的片段。
剪切的DNA液（含0.12mol/L 磷酸盐缓冲液或0.18mol/l Na+），经煮沸使dsDNA热变性成ssDNA。
然后冷至约60℃，在此温度孵育过程中，测定溶液一定时间内的UV260nm的吸光度（减色效应）来监测互补链的复性程度。
核酸分子杂交的概念和基本原理
核酸分子杂交的概念和基本原理
核酸分子杂交的基本原理是互补配对。
DNA由四种碱基组成，即腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）。
在DNA的双链结构中，A总是与T互补，G总是与C互补。
RNA的组成与DNA类似，但胸腺嘧啶（T）被尿嘧啶（U）取代。
1.样品制备：将待检测的核酸提取和纯化，通常使用的方法有酚/氯仿法或商用试剂盒。
2.样品标记：将一条核酸链标记上荧光物质或放射性同位素，以便于后续的检测和可视化。
标记通常使用DNA或RNA标记试剂盒来完成。
3.杂交：将待检测的样品核酸与已知碱基序列的探针核酸杂交。
探针核酸是一条已知序列的DNA或RNA，在实验中作为参照物。
杂交条件包括温度、盐浓度和时间等。
4.杂交后处理：将杂交的核酸片段进行洗脱和处理，以去除未杂交的核酸。
这可以通过水洗、盐洗或酶处理等方法来完成。
5.分析和检测：通过荧光显微镜、放射计数器或PCR等方法来检测和分析杂交的核酸。
可以测量荧光强度、放射性计数或扩增产物的数量等，以确定核酸的相互作用或特定序列的存在。
核酸分子杂交技术在生物医学研究和诊断中具有广泛的应用。
例如，它可以用于检测病毒感染、基因突变、基因表达差异以及遗传性疾病的诊断等。
此外，核酸分子杂交还可以用于基因组和转录组的分析，帮助科学家理解基因调控、进化和物种间关系等重要生物学问题。
综上所述，核酸分子杂交技术基于互补配对原理，通过使两条互补的核酸链结合，来研究DNA和RNA的相互作用和序列特征。
它是一种重要的实验技术，在生物医学研究和诊断中得到广泛应用。
核酸分子杂交技术定义
核酸分子杂交技术定义核酸分子杂交技术是一种广泛应用于生物学和医学领域的技术手段。
它利用互补配对的原理，将两个核酸链在一定条件下结合成一个双链分子。
该技术可用于分析、检测、鉴定、筛选和修饰核酸分子等方面，具有重要的实验和临床应用价值。
一、技术原理核酸分子杂交技术的原理是基于核酸互补配对的规律。
核酸是由四种碱基（腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和鳞状细胞素）组成的双链分子，两条链通过氢键相互配对形成双螺旋结构。
在核酸分子杂交技术中，将两个互补的核酸链置于一定条件下（如适当的温度、pH值和离子浓度等），使它们形成双链分子。
这个过程中，两个链之间的氢键会断裂，然后重新组合成新的氢键，形成一个更稳定的双链分子。
这个过程被称为“杂交”。
二、应用领域1. 分析基因序列核酸分子杂交技术可用于分析基因序列。
通过与已知序列相比较，可确定未知序列的位置和组成。
这种技术被广泛应用于基因组学和生物技术领域，包括基因定位、基因诊断、基因克隆和基因表达研究等方面。
2. 检测病原体核酸分子杂交技术可用于检测病原体。
该技术可以检测细菌、病毒、真菌和寄生虫等微生物的存在和数量。
与传统的细菌培养方法相比，核酸分子杂交技术具有更高的灵敏度和特异性，可以更快速和准确地诊断疾病。
3. 鉴定基因型核酸分子杂交技术可用于鉴定基因型。
通过检测DNA序列的变异，可以确定不同基因型之间的差异。
这种技术被广泛应用于疾病的遗传咨询、人类学研究和法医学等领域。
4. 筛选基因库核酸分子杂交技术可用于筛选基因库。
该技术可以通过与探针的杂交来筛选目标基因，从而快速地鉴定和克隆感兴趣的基因。
这种技术被广泛应用于基因工程、药物研发和生物产业等领域。
5. 修饰核酸分子核酸分子杂交技术可用于修饰核酸分子。
通过与修饰剂的杂交，可以将不同的化合物引入到核酸分子中，从而实现对分子结构和性质的调控。
这种技术被广泛应用于药物研发、生物材料和生物传感器等领域。
三、实验步骤核酸分子杂交技术的实验步骤包括样品处理、杂交反应、检测和数据分析等环节。
核酸的分子杂交技术及其应用
核酸的分子杂交技术及其应用1概述核酸的分子杂交(molecular hybridization)技术是目前生物化学和分子生物学研究中应用最广泛的技术之一，是定性或定量检测特异RNA或DNA序列片段的有力工具。
它是利用核酸分子的碱基互补原则而发展起来的。
在碱性环境中加热或加入变性剂等条件下，双链DNA之间的氢键被破坏(变性)，双链解开成两条单链。
这时加入异源的DNA或RNA(单链)并在一定离子强度和温度下保温(复性)，若异源DNA或RNA之间的某些区域有互补的碱基序列，则在复性时可形成杂交的核酸分子。
在进行分子杂交技术时，要用一种预先分离纯化的已知RNA或DNA序列片段去检测未知的核酸样品。
作为检测工具用的已知RNA或DNA序列片段称为杂交探针(probe)。
它常常用放射性同位素来标记。
虽然核酸分子杂交技术的应用仅有二十多年的历史，但它在核酸的结构和功能的研究中作出了重要贡献，在基因的表达调控和物种的亲缘关系研究中也发挥重要作用。
而且，随着核酸探针制备及标记技术的丰富和完善以及以不同材料为支持物的固相杂交技术的发展，使核酸分子杂交技术在分子生物学领域中的应用更加广泛。
这里我们将就分子杂交技术的几个主要过程及其应用进行介绍。
2核酸探针的制备核酸分子杂交的灵敏性主要依赖杂交探针的放射性比活度。
比活度高就可提高反应的灵敏性，减少待测样品的用量。
目前一般所用的是体外标记，这里介绍几种最常用的方法：2.1DNA的切口平移双链DNA分子的一条链有切口时，大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ可把核苷酸残基加到切口处的3’端，同时由于此酶具有5’→3’外切核酸酶活性，它还可从5’端除去核苷酸。
这样5’端核苷酸的去除与3’端核苷酸的加入同时进行，导致切口沿着DNA链移动，称切口平移(nicktranslation)。
常用于在双链DNA 上打开切口的酶为胰DNA酶Ⅰ。
由于高放射性比活度的核苷酸置换了原有核苷酸，就有可能制备比活度大于108计数/(分.μg)的32P标记的DNA探针。
核酸分子杂交
核酸分子杂交概念及特点：核酸分子杂交技术的基本原理是具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下（适宜的温室度及离子强度等）可按碱基互补配对成双链，用特异性的探针与待测样品的DNA或RNA形成杂交分子的过程。
核酸分子杂交技术主要有以下几种：Southern杂交、Northern杂交、原位杂交（ISH）、荧光原位杂交（FISH）、芯片杂交。
核酸杂交技术具有其高度特异性、灵敏性、快速等特点。
在环境监测中的应用：核酸分子杂交技可以快速检测出环境微生物中独特的核酸序列。
如对活性污泥中的特定微生物的生长速率进行测定，根据放射性强度可以定量分析特定细菌的DNA量。
在对被石油污染的土壤分析中，用核酸杂交法得到某种烃降解基因的检出率显著高于不污染样品，结果表明，污染越严重，这种降解基因的含量也越高，可用来评价中石油污染程度。
荧光原位杂交技术（FISH）是核酸原位杂交技术中应用最为广泛的技术之一。
该技术结合了分子生物学的精确性和显微镜的可视性，无需单独分离出DNA或RNA，通过激发杂交探针的荧光来检测信号从而对未知的核酸序列进行检测，结果可直接在荧光显微镜下观察。
GulnurCoskuner认为FISH技术能揭示更多硝化细菌的微生物学方面的信息及它们种群的大小，更有利于改进生物脱氮系统的工艺，避免了传统的、用培养方法计数带来的偏差。
彭永臻等列举了FISH在活性污泥细菌检测，高效生物除磷（EBPR）反应器微生物群落的测定、污水处理微生物检测等方面的应用。
一、核酸分子杂交应用于物种之间亲缘关系的鉴定。
把取自两种不同生物体细胞的DNA 进行RCR扩增，并同时带上不同的放射性标记。
然后将其混合在一起，先高温解链，再低温复性。
来自两种不同生物的DNA分子单链中的互补区域就可以互补配对。
互补配对的区域越大，说明亲缘关系越近。
二、基因诊断：用带有标记的已知缺陷基因的特异性片段做探针，通过和待测样品DNA 中进行分子杂交，检测被测样品中是否含有缺陷基因。
核酸分子杂交技术
K去除核酸表面的蛋白质
• 组织细胞内的核酸与蛋白质结合成核酸蛋白复合体 • 控制消化时间，避免细胞结构破坏和核酸从载玻 片上脱落
2、杂交过程： （1）组织或细胞的固定 理想固定液应具备： • 保持组织细胞的形态 • 对核酸无抽提，修饰与降解作用
• 不改变核酸在组织细胞内的定位
• 不阻碍核酸与探针的杂交过程 • 对杂交信号无遮蔽作用 • 理化性质稳定
（2）组织细胞杂交前的预处理
• 去垢剂（如Triton x-100和SDS）和蛋白酶
（2）比色或化学发光检测：适于非核素标记的探针
7、Southern杂交的应用 （1）酶切图谱分析 （ 2）特定基因定性和定量
（3）基因突变分析
（ 4）限制性片段长度多态性的分析
（二）Northern印迹杂交 1、基本原理和基本过程与Southern blot基本相同 2、鉴别RNA
3、探针可用DNA或RNA片段
或硝酸纤维素膜上。
5、Southern杂交 （ 1）预杂交：封闭膜上能与DNA结合的位 预杂交液 为不含DNA探针的杂交液 （2）杂交：液相中的DNA探针与膜上的待测DNA双 链DNA探针需加热变性为单链，再杂交 （3）洗膜：去除游离的放射性探针或非特异结合的 DNA
6、杂交结果检测
（1）放射自显影：适用于放射性核素标记的探针
mRNA
逆转录酶的 DNA聚合酶
互补DNA
DNA 聚合 酶
逆转录酶的 RNase H
分解mRNA
第二条CDNA链
RNA探针
1、RNA探针是单链分子，与靶序列的杂交反应效率高。 2、早期采用的RNA探针是细胞mRNA探针和病毒RNA探 针，这些RNA是在细胞基因转录或病毒复制过程中 得到标记的，标记效率不高，且受到多种因素的制 约。 3、体外逆转录可高效合成RNA，加入标记物可成为探 针 4、应用：例如，在筛选逆转录病毒人类免疫缺陷病 毒（HIV）的基因组DNA克隆时，因无DNA探针可利 用，就利用HIV的全套标记mRNA作为探针，成功地 筛选到多株HIV基因组DNA克隆。
核酸的分子杂交
3 核酸探针的标记
为确定探针是否与相应基因组DNA杂交，有必要对探针加以标记，以便在结合部位获得可识别的信号。
3.1 标记的种类
同位素： 32P、35S、3H、125I等标记探针 非同位素： 生物素、地高辛配体、荧光素等作为标记物 两者比较：后者不及前者敏感，但后者保存时间较长，无同位素污染。
有互补特定核苷酸序列的单链DNA或RNA混在一起时，其相应同源区段将会退火形成双链结构。
Home
应 用：
检测特定生物有机体之间是否存在亲缘关系； 用来揭示核酸片段中某一特定基因的存在与否、拷贝数及表达丰度。
2 核酸探针的制备
2.1 探针（Probe)的概念: 一段带有检测标记的与目的基因或目的DNA特异互补的已知核苷酸序列。
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第五节 核酸的分子杂交 Nucleic Acid Hybridization
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核酸分子杂交 把亲源关系较近的，不同生物个体来源的变性DNA或RNA单链，经退火处理形成DNA-DNA或DNA-RNA这一过程叫分子杂交。
2.2 探针的制备方法
01
02
03
PCR扩增
DNA重组技术
化学合成
长度一般以50~300bp为宜。制备方法：
2.3 探针的分类 据来源及性质不同可分为： 基因组DNA探针 cDNA探针 RNA探针 寡核苷酸探针
2.4 合成寡核苷酸探针注意原则
核酸分子杂交概念解释
核酸分子杂交概念解释
核酸分子杂交是指两条核酸链（通常是DNA或RNA链）通过互相结合，形成一个稳定的双螺旋结构的过程。
这种结合是通过碱基间的氢键形成的，碱基之间的配对是高度选择性的。
DNA分子的碱基配对规则是腺嘌呤（A）与胸腺嘧啶（T）之间形成两个氢键，鸟嘌呤（G）与胞嘧啶（C）之间形成三个氢键。
核酸分子杂交在生物学和分子生物学中有许多应用，其中最为著名的是分子杂交技术（molecular hybridization technique）。
这一技术可用于检测和分析DNA或RNA 的序列相似性，以及研究基因表达、基因组结构等方面。
以下是核酸分子杂交的一些关键概念：
1. 碱基配对：核酸分子的稳定性来自于两条链之间的碱基配对。
在DNA中，A与T 形成两个氢键，G与C形成三个氢键。
RNA中的规则类似，但是T被替换为尿嘧啶（U）。
2. 选择性：核酸分子杂交的过程是高度选择性的，只有符合碱基配对规则的两条链能够结合。
这种选择性是生物体内DNA复制和RNA转录的基础。
3. 热力学稳定性：杂交的稳定性受到环境条件的影响，尤其是温度。
高温通常会导致核酸分子的解离，而低温则有助于形成更稳定的双链结构。
4. 杂交实验：分子生物学中的分子杂交实验利用了核酸分子的互补配对性质。
例如，通过将待测的DNA或RNA与已知序列的标记分子杂交，可以用于检测目标序列的存在、测定相对丰度等。
5. 应用领域：核酸分子杂交技术在基因克隆、基因检测、DNA指纹分析等方面有广泛应用，为研究生物学和遗传学提供了重要工具。
核酸分子杂交概述
第十八章 核酸分子杂交技术概述第一节 核酸的分子结构一、核酸的化学组成组成核酸的元素有C、H、O、N、P等，其中N含量约为15%～16%，磷含量为9%～10%。
由于核酸分子中的磷含量比较恒定，因此，核酸定量测定的经典方法，是以测定磷含量代表核酸量。
核酸经水解可得到多核苷核，因此核苷酸是核酸的基本单位，核酸就是由很多单核苷酸聚合形成的多核苷酸，核苷酸可被水解产生核苷和磷酸，核苷还可进一步水解，产生戊糖和含氮碱。
因此，核酸是由含氮碱、戊糖及磷酸三种成分组成。
含氮碱（简称碱基）：核酸中的含氮碱简称碱基，是嘌呤碱（purine）与嘧啶碱（pyrimidine）的衍生物。
RNA和DNA含有的共同碱基成分是腺嘌呤（adenine,A）、鸟嘌呤（guanine,G）和胞嘧啶（cytosine, C）。
二者的区别是RNA含有尿嘧啶（uracil,U），而DNA含有胸腺嘧啶（thymine,T）。
嘌呤和嘧啶都有酮-烯醇式互变异构现象，一般生理pH条件下呈酮式。
它们的结构如下：有些核酸中含有修饰碱基（或稀有碱基），这些碱基大多是在上述嘌呤或嘧啶碱的不同部位甲基化（methylation）或进行其它的化学修饰而形成的衍生物。
例如有些DNA分子中含有5-甲基胞嘧啶（m5C），5-羟甲基胞嘧啶（hm5C）。
某些RNA分子中含有1-甲基腺嘌呤（m1A）、2，2-二甲基鸟嘌呤（m22G）和5，6-二氢尿嘧啶（DHU）等。
嘌呤碱和嘧啶碱一般多不易溶于水，对250～280nm波长的紫外光有较强的吸收，但对260nm光波的吸收能力最大。
由于碱基是核酸的基本组成成分，因此，所有的核酸（包括DNA 和RNA）其共同特点是对260nm处的紫外光有最大的吸收值。
核酸分子中碱基的克分子数与磷的克原子数相等，所以可根据核酸溶液中的磷含量及紫外光的吸收值来测定核酸量。
一般以每升核酸溶液中含1g磷原子为标准来计算核酸的吸光率，这称为克原子磷吸光率或克原子磷消光系数[ε（p）],ε(p)的计算式为：ε（p）=A/ClA为吸光度（光密度），1为比色杯内径，通常为1.0cm；C为每升核酸溶液中磷的克原子数。
核酸分子杂交技术
核酸分子杂交技术
核酸分子杂交技术是一种用于检测和分析核酸特异性的分子生物学技术。
它可以检测和分
析特定的基因或基因产物，如RNA或DNA，以及其他特定的核酸分子，如转录因子、调控
因子等。
核酸分子杂交技术可以用来确定特定基因的存在、结构和功能，也可以用来检测
和鉴定病毒、细菌和其他微生物的存在。
核酸分子杂交技术的基本原理是，将两个不同的核酸分子（称为“杂交物”）混合在一起，使它们能够结合在一起。
这种结合是由特定的碱基对结合所决定的，也就是说，只有具有
相同的碱基序列的两个核酸分子才能结合在一起。
结合后的核酸分子杂交物可以被检测到，从而可以用来确定特定核酸分子的存在。
核酸分子杂交技术可以用来检测和分析特定基因的存在、结构和功能，也可以用来检测和
鉴定病毒、细菌和其他微生物的存在。
在肿瘤学研究中，核酸分子杂交技术可以用来检测
肿瘤细胞中特定基因的表达水平，从而可以帮助医生更好地诊断和治疗患者。
此外，核酸
分子杂交技术还可以用来研究基因调控，以及研究基因突变对基因表达的影响。
核酸分子杂交技术的应用非常广泛，可以用来研究基因、蛋白质和其他生物分子，以及病毒、细菌和其他微生物。
它可以用来诊断和治疗疾病，以及研究基因调控和基因突变对基
因表达的影响。
总之，核酸分子杂交技术是一种重要的分子生物学技术，在医学、生物学和其他领域都有
着广泛的应用，可以用来检测和分析特定的基因、病毒和其他微生物，并且可以用来研究
基因调控和基因突变对基因表达的影响。
核酸分子杂交
59 59
marker 样品
转膜
凝胶
膜
滤纸 滤纸
marker 样品
Western
蛋白质 样品
聚丙烯酰胺凝胶电泳
缓冲液
marker
样品
marker 样品
一抗
二抗
X胶片 曝光
marker 样品
53 53
（二）Northern Blot
是指待测RNA样品经 电泳分离后转移到固相支 持物上，然后与标记的核 酸探针进行固-液相杂 交，检测RNA （mRNA）的方法。
➢ 样品是RNA。
➢ 电泳前，不酶切。
➢ 电泳前，样品变性。
➢ 电泳过程中，样品保 持变性状态。
➢ 电泳后，样品不再变 性，直接转膜。
2. 复性过程：
（1）单链分子间碰撞形成局部双链
（2）局部双链周围的碱基如不配对时，双链重新解离
（3）局部双链周围的碱基如配对，则形成中心序列
（4）形成完整的双链分子
13
复性过程中的碱基配对
14
Hybridization
15
❖ 具有互补序列的两条单链核酸都可互补形成双 链，如：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡 核苷酸/DNA和寡核苷酸/RNA，该特性是体外杂 交技术的基础。
EE
E
EE H
E H
DNA片段：
（最长的DNA片段控制在大约2 kb）
38
2.待测DNA样品的电泳分离
12
2000
1000 750 500
250 100
0.8 ~ 1％ 非变性琼脂糖凝胶
核酸分子杂交(DNADNA or DNARNA)
优点：简单、快速、可同时检测多个样品
液相杂交
指待测核酸和探针都存在于杂交液中，碱基互补 的单链核酸分子在液体中配对形成杂交分子的过程。
（一）RNA酶保护分析法
1、RNA酶保护分析法原理
RNaseA和RNaseT1专一水解杂交体系中的单 链RNA，不水解探针RNA与待测RNA互补形成 的双链RNA，使杂交分子得到保护，称RNA酶 保护分析法。
核酸分子杂交的基本原理
DNA变性
• 方法
热变性：90~100℃ 酸碱变性：常采用碱变性 化学试剂变性：尿素、甲酰胺、甲醛等
• 特点：粘度增加、密度增加、增色效应、溶 解温度(melting temperature,Tm)
DNA复性或杂交(hybridization)
• DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等
2、凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用， 将大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根离子及寡 核苷酸（<80bp)等物质分离，常用凝胶基质是 Sephadex G-50
3、微柱离心法：其原理与上述凝胶过滤柱层析法 相同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针， 而此法则是利用离心的方式来纯化探针
Biotin
Avidin
(2)探针标记物 理想标记物应具备的特性：
• 高度灵敏性 • 不影响碱基配对的特异性 • 不影响探针分子的主要理化性质 • 对酶促反应活性无影响或影响不大 • 检测方法具有高度灵敏性和高度特异性
BCIP/NBT
紫蓝色沉淀
碱性磷酸酶
抗Dig抗体 Dig
(3)探针标记方法
影响杂交的因素
核酸分子的浓度和长度
• 浓度大，复性快；分子量大，复性慢
名词解释核酸分子杂交
名词解释核酸分子杂交
核酸分子杂交是一种分子生物学技术，它可以将两个不同的核酸类型（如DNA和RNA）连接起来，以便更好地理解和控制生物体的行为和机制。
它可以用于分子诊断，如研究细菌和病毒的抗药性，检测DNA的状态等。
核酸分子杂交是一种常见的实验室技术，它可以帮助科学家们更好地理解和控制生物体的行为和机制。
它是通过利用酶来将不同核酸分子杂交成单一碱基对的。
它主要有两种方法：可催化性核酸分子杂交和不可催化性核酸分子杂交。
可催化性核酸分子杂交一般是在受体和发起者的酶的联合作用
下完成的。
受体和发起者的共同作用使得合成的核酸片段可以和模板片段自动结合，从而形成混合的碱基对。
不可催化性核酸分子杂交涉及将两种不同的核酸分子直接结合，使模板片段和合成片段形成混合碱基对。
它主要利用特殊的化学试剂，即烷基硫醇，能够与不同核酸分子结合形成一个桥接，将它们连接在一起形成一个碱基对。
核酸分子杂交技术也得到了广泛的应用，可用于检测细菌和病毒的抗药性，检测DNA的状态。
它可以帮助科学家识别致病菌的聚集蛋白，而聚集蛋白可以作为靶基因，从而获得新的抗药性菌株。
此外，核酸分子杂交技术还可用于构建和支持生物工程的项目，这些项目需要允许调整和重新组合指定的基因，以多样化产品的特性，进而提高治疗效果。
最后，核酸分子杂交技术在当今生物学界发挥着重要作用，已经成为一种基础技术。
它为科学家们提供了一种灵活的方法来控制和理解生物系统的行为和机制，从而为更好地实现治疗效果提供了有力的保障。
核酸分子杂交的方法及其在医学检验中的应用
核酸分子杂交的方法及其在医学检验中的应用核酸分子杂交技术及其在医学检验中的应用核酸分子杂交技术是一种技术，可以用来检测和识别特定的基因，查明个体与被研究物之间的关系。
在过去的几十年里，它已经被广泛应用于疾病诊断、环境检测和发现新基因等领域，基本上都要求快速、灵敏和特异性的检测结果，以及定性和定量的研究结果，而这一切都可以通过核酸分子杂交技术来实现。
本文综述其基本原理、步骤、优缺点以及在医学检验中的应用。
一、核酸分子杂交的基本原理核酸分子杂交技术(in situ hybridization, ISH)是一种用来识别和检测特定的基因序列的分子生物学技术，通常用于染色体分析，可以发现特定基因所在的细胞和组织。
它是根据两种相互作用的核酸分子之间结合的原理工作，即“杂交”。
在杂交反应中，一条条的核酸分子（DNA或RNA）互相结合，形成特定的结构，从而在某些非常特异的情况下进行识别。
另外，通过应用适当的荧光技术，可以直观地观察和显示杂交反应。
二、核酸分子杂交技术的步骤核酸分子杂交技术包括以下几个步骤：（1）样本准备。
样本准备是研究时的第一步，在这一步骤中研究者根据自己的研究需求，选择合适的样本。
（2）核酸分离。
在核酸分离步骤中，由于核酸是微小的，因此需要采用特殊的技术来从样本中分离出核酸，而这些技术通常是PCR，即聚合酶链反应，用于提高核酸的灵敏度。
（3）核酸杂交。
在核酸杂交的步骤中，首先，将抗体结合到探针中，然后将探针与样本中的核酸结合起来，形成双螺旋构型，从而实现特异性识别。
（4）信号分析。
在信号分析步骤中，需要对样本中的核酸进行鉴定，以及检测所测试的核酸是否核苷酸序列正确的特定目的。
最常见的技术是利用基因组芯片，通过它们可以对大量的基因进行组合扩增，从而识别、分析和检测出特定基因。
三、核酸分子杂交技术的优缺点（1）优点核酸分子杂交技术有很多优点，如：（1）操作简单，容易实现自动化，可以提高生产效率；（2）能够检测出对特定基因的非常特异性的序列；（3）可以测定大量基因，使得研究者可以更容易地进行基因组学研究；（4）技术可以检测出胞内和蛋白质的体外表达；（5）核酸分子杂交技术的发展使得药物研发有了新的思路和突破，可以更加准确高效地展开新药的研发。
分子生物技术—核酸分子杂交技术
一、核酸分子杂交基本原理
(二) 核酸分子杂交基本原理
• 根据核酸变性和复性的原理,不同来源的DNA 变性后,若这些异源DNA之间存在某些相同序 列的区域,在退火条件下则可形成DNA-DNA 异源双链;或将变性的单链DNA与RNA经复 性处理可以形成DNA-RNA杂合双链。这种 不同来源的单链核酸分子在合适的条件下,通 过碱基互补形成双链杂交体的过程称为核酸分 子杂交
三、核酸分子杂交相关技术
（一）传统核酸分子杂交技术
2.Northern杂交
• 对RNA的检测也可以利用与DNA检测 相同的印迹技术来分析。与 Southern 印迹杂交的方法类似,只是变性剂不同
• Southern杂交中使用的使DNA变性的 试剂为NaOH。因为NaOH会水解 RNA的2-羟基基团,所以Northern杂 交中使RNA変性的试剂为甲基氧化汞 、乙二醛或甲醛
• 斑点杂交和狭缝杂交都是将被检标本 点到膜上烘烤固定。不需电泳和转膜 过程,整个操作过程简便、快速
• 缺点是无法判断核酸片段的大小,也无 法判断样品溶液中是否存在着不同的 靶序列,多用作核酸定性或半定量分析 而且便于杂交条件的摸索
三、核酸分子杂交相关技术
（二）核酸原位杂交
• 原位杂交是将核酸分子杂交技术与组 织细胞化学和免疫组织化学结合起来 的一种杂交方法,其基本原理及探针的 标记方法与传统核酸分子杂交技术相 同
三、核酸分子杂交相关技术
（一）传统核酸分子杂交技术
3. 斑点杂交与狭缝杂交
• 将RNA或DNA变性后直接点样于硝酸 纤维素膜或尼龙膜上,再采用特定的探 针进行杂交这种方法称为点杂交
• 若采用狭缝点样器加样后杂交,则称为 狭缝杂交
• 斑点杂交与狭缝杂交的区别是点样形 状的不同
核酸分子杂交的名词解释
核酸分子杂交的名词解释核酸分子杂交是一种利用生物学原理实现物种间遗传信息交互的技术，它既是一种有效的基因组学研究方法，也是认识有机体的基础研究的技术，在生物医学研究中发挥着重要作用。
核酸分子杂交是指两个不同的核酸分子发生特定的相互作用，使它们的特征与相应的基因终端段产生特定的结合关系，从而获得特定的结果。
核酸分子杂交可以使两个不同的物种间的基因特征进行精准的互相作用。
核酸分子杂交是一种特殊的基因转移方式，它可以把某一物种所携带的基因特征转移到另一物种体系中，从而获得新型的有机体特征。
例如，人类可以通过把一些先进的基因特征转移到谷子种子中，来改良谷子产量和品质等。
核酸分子杂交的实现需要各种技术方法，包括聚合酶链式反应（PCR），核酸外切酶特异剪切，蛋白结合基因疏水的酶切，抑制剪接酶的介导，DNA断片构建和连接技术，以及质粒、质粒和细胞内DNA 断片的迁移、裂解等技术。
核酸分子杂交的应用非常广泛，它可以应用于基因组分析、疾病的预防、检测和治疗、品种改良、新药研究和毒物分解等多个领域。
在基因组研究中，可以利用核酸分子杂交技术对宿主和病原体之间的基因特征进行比较，从而获得重要的研究信息。
在疾病的预防、检测和治疗方面，核酸分子杂交可以帮助医学研究人员发现疾病机理，以便找到合适的治疗方法。
当核酸分子杂交有效地检测出某种疾病时，可以及早进行处理，以防止疾病的恶化。
此外，核酸分子杂交还可以应用于品种改良、新药研究和毒物分解等领域。
在品种改良中，可以利用核酸分子杂交来选择出更加抗逆的品种；在新药研究中，可以通过核酸分子杂交来快速发现新的药物活性物质等。
此外，核酸分子杂交还可以帮助毒物分解，从而达到净化环境的目的。
总之，核酸分子杂交是一种重要的生物学原理，在生物医学研究领域具有重要作用，它可以应用于基因组研究、疾病的预防、检测和治疗、品种改良、新药研究和毒物分解等多个领域。
因此，核酸分子杂交是一项极具前瞻性的技术，它为医学研究和药物发现提供了重要的科学依据，是未来科学研究和应用发展的重要方向。
《核酸分子杂交技术》课件
核酸分子杂交原理
互补配对
核酸分子通过互补配对原理相 结合，碱基之间形成稳定的氢 键。
熔解
通过改变温度，使两条核酸分 子解开，断裂氢键，分离出单 链。
探针结合
利用互补配对原理，核酸探针 与目标核酸结合，形成稳定的 双链结构。
核酸探针的制备
1
设计探针序列
根据目标核酸序列设计探针，考虑碱基
合成探针
2
互补性和特异性。
《核酸分子杂交技术》 PPT课件
核酸分子杂交技术是一种重要的实验技术，能够研究DNA和RNA的结构、功 能以及相互作用。让我们一起探索这门神奇的科学吧！
什么是核酸分子杂交技术
1 定义
核酸分子杂交技术是指通过核酸探针与目标 核酸的互补碱基配对作用实现的一种检测、 分离和研究方法。
2 原理
该技术利用核酸分子的碱基互补性特点，使 探针与目标核酸发生相互结合，从而实现目 标分子的检测和定位。
利用合成技术合成目标序列的核酸探针。
3
标记探针
通过化学反应或酶标记等方法，将探针 标记上荧光剂或放射性示踪剂。
应用领域
遗传研究
核酸分子杂交技术在遗传研究中 起到了至关重要的作用，帮助人 们了解遗传信息的传递和变异。
医学诊断
通过核酸分子杂交技术，可以检 测病原体和基因突变，用于疾病 的早期诊断和治疗。
法医分析
核酸分子杂交技术用于法医学领 域的DNA鉴定和犯罪现场的分析， 提供了重要的法律证据。
核酸分子杂交技术的优势
1 高度特异性
通过合理设计探针序列， 核酸分子杂交技术能够高 度特异地检测目标核酸。
2 灵敏度高
核酸分子杂交技的特点。
3 广泛应用
核酸分子杂交技术在基础 研究、生物医学、农业科 技等领域均有广泛应用。
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逆转录酶的 DNA聚合酶
互补DNA
DNA 聚合 酶
逆转录酶的 RNase H
分解mRNA
第二条CDNA链
RNA探针
1、RNA探针是单链分子，与靶序列的杂交反应效率高。 2、早期采用的RNA探针是细胞mRNA探针和病毒RNA探 针，这些RNA是在细胞基因转录或病毒复制过程中 得到标记的，标记效率不高，且受到多种因素的制 约。 3、体外逆转录可高效合成RNA，加入标记物可成为探 针 4、应用：例如，在筛选逆转录病毒人类免疫缺陷病 毒（HIV）的基因组DNA克隆时，因无DNA探针可利 用，就利用HIV的全套标记mRNA作为探针，成功地 筛选到多株HIV基因组DNA克隆。
（3）标记方法 体内标记法：将核素标记的化合物作为合成
代谢的底物，在细胞合成代谢时使 核素掺入到新
合成的核酸分子中，如3H-胸苷可掺入到DNA中，
3H-尿苷可掺入到RNA中
体外标记法：
化学标记法：标记物分子上的活性基团与
探针分子上的某些基团反应，
标记物直接结合到探针分子上
酶促标记法：标记物预先标记核苷酸，然 后利用酶促法将标记的核苷酸 掺入到探针上
随机引物法
其原理是随机引物能与各种单链DNA模板结合，
作为合成新链的引物，在DNA聚合酶的催化下， 按53方向合成一新的DNA链，其核苷酸序列与 模板DNA完全互补。另一单链DNA模板同样合成 一条新的完全互补的DNA链。合成时，带放射性
核素标记的核苷酸掺入到新合成的DNA分子中
随机引物法所具有的优点：
4、待测样品为总RNA或mRNA
Northern印迹与Southern 印迹的不同点
1、变性：RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保
持RNA处于变性膜：RNA转膜前不需变性和中和处理,Southern 印迹时，DNA转膜前需进行碱变性及中和处理 3、靶核酸为RNA
三、 核酸分子杂交的方法 按待测核酸是否固定在固相支持物上分：
• 固-液相杂交
膜上印迹杂交
原位杂交
• 液相杂交
RNA酶保护分析法
核酸酶S1保护分析法
限制性酶切割
限制片段 琼脂糖电泳
DNA分子
带有DNA片段的凝胶
用缓冲液转移DNA 至膜（尼龙膜或硝酸 纤维素滤膜）上
凝胶 滤膜
转膜 吸附有DNA 片段的膜
寡核苷酸探针
利用寡核苷酸自动合成仪，可很简单地合成制 备寡核苷酸探针(如15～50bp)， 寡核苷酸探针的优点： ①短的探针比长探针杂交速度快，特异性强。 ②可以在短时间内大量制备。 ③在合成中进行标记制成探针。 ④可合成单链探针，避免了用双链DNA探针在杂 交中自我复性，提高杂交效率。 ⑤寡核苷酸探针可以检测小DNA片段 。
3、离子强度： （1）低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂 交率增加 （2）高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，当进 行序列不完全同源的核酸分子杂交时，必须维持杂交 反应液中较高的盐浓度和洗膜溶液的盐浓度
4、甲酰胺： （1）甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值，能降低杂交 液的温度，低温时探针与待测核酸杂交更稳定，当待 测核酸与探针同源性不高时，加50%甲酰胺溶液在 35~42 ℃杂交 （2）如待测核酸序列与探针同源性高时，则用水溶 液在68℃杂交
• 对酶促反应活性无影响或影响不大
• 检测方法具有高度灵敏性和高度特异性
（3）标记物种类 • 核素标记物：32p、35s、3H • 非核素标记物 半抗原：生物素、地高率 配体：生物素是亲和素的配体 荧光素：异硫氰酸荧光素、罗丹明等 化学发光探针：标记物与某种底物反应发光， 如生物素酰化的碱性磷酸酶 可使发光底物发光
同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针，而此
法则是利用离心的方式来纯化探针
二、影响杂交的因素
1、核酸分子的浓度和长度：
浓度越大，复性速度越快
分子越大，复性速度越慢
单链探针，浓度增加，杂交效率增加
双链探针，浓度控制在0.1~0.5μg,浓度过高影响杂
交效率
2、温度： （1）DNA/DNA杂交，适宜温度较Tm值低20~25℃ （2）RNA/DNA或RNA/RNA杂交，加甲酰胺降低 Tm值 （3）用寡核苷酸探针杂交，适宜温度较Tm值低5℃
（二）探针的标记 1、理想标记物应具备的特性：
• 高度灵敏性
• 不影响碱基配对的特异性
• 不影响探针分子的主要理化性质
• 对酶促反应活性无影响或影响不大
• 检测方法具有高度灵敏性和高度特异性
2、标记物 （ 1） 理想标记物应具备的特性：
• 高度灵敏性
• 不影响碱基配对的特异性
• 不影响探针分子的主要理化性质
杂交、显影
Southern 印迹杂交的技术流程
（一）Southern印迹杂交 1、待测核酸样品的制备 （1）裂解或破碎细胞 （2）抽取纯化基因组DNA （3）限制酶消化DNA为大小不同的DNA片段
2、待测DNA样品的电泳分离 （1）琼脂糖浓度：分离大片段用低浓度胶
分离小片段用高浓度胶
（ 2）凝胶电泳：凝胶具有分子筛效应，大分子
（2）比色或化学发光检测：适于非核素标记的探针
7、Southern杂交的应用 （1）酶切图谱分析 （ 2）特定基因定性和定量
（3）基因突变分析
（ 4）限制性片段长度多态性的分析
（二）Northern印迹杂交 1、基本原理和基本过程与Southern blot基本相同 2、鉴别RNA
3、探针可用DNA或RNA片段
Southern印迹的常用方法
（1）毛细管虹吸印迹法
利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中
的DNA转移到固相支持物上。 其基本原理是： 容器中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl和柠檬
酸钠，上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤
纸桥、滤纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动，
同时带动凝胶中的DNA片段垂直向上运动，凝
DNA探针的主要优点
①这类探针多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖， 取之不尽，制备方法简便。
②DNA探针不易降解（相对RNA而言），一般能有 效抑制DNA酶活性。 ③DNA探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选 择，如缺口平移，随机引物法，PCR标记法等， 能用于同位素和非同位素标记
cDNA探针
cDNA（complementary DNA）是指互补于mRNA 的DNA分子。
变性
复性
DNA-DNA 杂交双链分子
二、核酸分子杂交的 探针
（一）探针的种类
1、根据组成分类 • 基因组DNA探针
• cDNA探针
• RNA探针
• 寡核苷酸探针
2、标记物
放射性同位素标记法 35S
如32P、3H、
非放射性同位素标记法 如金属、半抗原、 荧光素
3、标记的方式 体内标记法 体外标记法
1、能进行双链DNA、单链DNA或RNA探针的标记 2、操作简单方便，避免因DNaseI处理浓度掌握不 当所带来的一系列问题 3、标记活性高，标记活性可达108cpm/µ gDNA以 上 4、可直接在低熔点琼脂糖溶液中进行标记
PCR标记法：将标记的核苷酸作为PCR反
应的底物，以待标记的DNA为模板，经
DNA泳动慢,小分子DNA泳动快，
大小 相同的分子处于同一条带 （ 3）分子量标准：经HindⅢ消化的λDNA，杂 所用分子量标准可用核素标记
3、凝胶中核酸的变性（碱变化） 凝胶置于NaOH溶液中使DNA变性断裂为较短的 单链 DNA,中性缓冲液中和凝胶中的缓冲液
4、Southern印迹
指将电泳分离的DNA片段转移到一定的固
相支持物上的过程。
（1）固相支持物的选择 理想的固相支持物应具备的特性： ①具有较强结合核酸分子的能力 ②不影响与探针的杂交反应 ③与核酸分子结合稳定牢固
④具有良好的机械性能
非特异吸附少
常用的固相支持物 ①硝酸纤维素膜：优点是吸附能力强，杂交信号本 底低。缺点是DNA分子结合不牢固 ②尼龙膜：优点是结合单链，双链DNA的能力比硝酸 纤维素膜强；缺点：杂交信号本底高 ③化学活化膜：优点：DNA与膜共价结合；对不同 大小的DNA片段有同等结合能力；缺点：结合能 力较上述两种膜低
PCR反应，标记的核苷酸掺入到新合成的DNA分
子中
（三）探针的纯化
1、乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀DNA片段，可
去除dNTP和蛋白质
2、凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用，将
大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根离子及寡核苷
酸（<80bp)等物质分离，常用凝胶基质是Sephadex G-50
3、微柱离心法：其原理与上述凝胶过滤柱层析法相
2、杂交过程： （1）组织或细胞的固定 理想固定液应具备： • 保持组织细胞的形态 • 对核酸无抽提，修饰与降解作用
• 不改变核酸在组织细胞内的定位
• 不阻碍核酸与探针的杂交过程 • 对杂交信号无遮蔽作用 • 理化性质稳定
（2）组织细胞杂交前的预处理
• 去垢剂（如Triton x-100和SDS）和蛋白酶
胶中的DNA片段移出凝胶而滞留在膜上
。
（2）电转法
利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到固相 支持物上。
（3）真空转移法 此法原理与毛细管虹吸法相同，只是以滤
膜在下，凝胶在上的方式将其放置在一个真 空室上，利用真空作用将转膜缓冲液从上层 容器中通过凝胶和滤膜抽到下层真空室中， 同时带动核酸片段转移到凝胶下面的尼龙膜
5、核酸分子的复杂性： （1）核酸的复杂性是指存在于反应体系中不同顺序 的总长度 （2）Cot½与反应体系中核酸复杂性成正比
（3）两个DNA样品浓度绝对一致时，变性后的相对 杂交率取决于DNA的相对复杂性
6、非特异性杂交反应： （1）杂交前封闭非特异性杂交位点，减少其对探针 的非特异性吸附 （2）常用的封闭物有两类：即非特异性DNA和高分 子化合物。如鲑精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts 溶液或脱脂奶粉