核酸杂交技术全解
核酸杂交技术
核酸杂交技术是一种用于检测DNA或RNA分子的特定序列（靶序列）的技术。
本技术是通过将待测核酸序列（可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA）先转移并固定到硝酸纤维素或尼农膜上，能与膜上特定的核酸序列发生特异性互补的已知单链DNA或RNA探针用放射性核素、生物素或其他活性物质标记。
在膜上杂交时，探针通过氢键与其互补的靶序列结合，洗去未结合的游离探针后，经放射自显影或显色反应检测特异结合的探针，即可检测到未知DNA或RNA分子所在位置。
核酸扩增技术即一大类技术方法的总称，目前包括常规PCR、实时荧光PCR、等温核酸扩增技术等。
最常用的常规PCR又称多聚酶链式反应，是将DNA复制所需的原料dNTPs、耐热的DNA聚合酶、引导扩增的引物、DNA模板等加入到一个体系中，通过温度的升降来反复完成变性、退火（复性）、延伸过程25~35次，实现DNA基因的大量拷贝、扩增。
[说明]核酸分子杂交及PCR技术
![[说明]核酸分子杂交及PCR技术](https://img.taocdn.com/s3/m/cd08778f50e79b89680203d8ce2f0066f53364c4.png)
核酸的分子杂交技术一、核酸分子杂交用标记的已知DNA或RNA片段（探针）来检测样品中未知核酸序列，通过核苷酸间碱基互补的原则发生异源性结合，再经显影或显色的方法，将结合核酸序列的位置或大小显示出来。
待测的核酸序列，可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化的基因组DNA和组织细胞的RNA。
二、核酸分子杂交的分类液相杂交核算分子杂交印记杂交固相杂交原位杂交1.固相杂交：将需要杂交的一条核酸链先固定在固体支持物上，另一条核酸链游离在液体中。
2.液相杂交：参与反应的两条核酸链都游离在液体中。
常用固相杂交类型：Southern印迹杂交、Northern印迹杂、菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、组织原位杂交、夹心杂交等。
三、核酸分子杂交的基本原理1、变性：在某些理化因素的作用下，核酸双链分子碱基对的氢键断裂，疏水作用被破坏，双链螺旋或发夹结构被拆开，有规则的空间结构被破坏，形成单链分子，称为核酸的变性。
﹡引起核酸变性的因素：热、酸、碱、化学试剂（如：尿素、甲酰胺、甲醛等）。
﹡加热变性是最常用的方法，一般加热80-100℃数分钟即可使核酸分子氢键断裂，双链分开。
﹡变性的核酸分子失去了生物活性，同时理化性质也随之改变，其紫外吸收值（A260）也随之升高。
可用紫外吸收的变化来跟踪DNA的变性过程。
以A260吸收值对应温度作图，得到DNA的变性曲线或熔解曲线。
增色效应：DNA变性后对260nm紫外光收增加的现象。
DNA热变性现象双螺旋结构即发生解体，两条链分开形成无规则线团。
同时，一系列物化性质发生改变：260nm处紫外吸收值升高，粘度降低，浮力密度升高。
由于二级结构的丧失，也失去了部分或全部生物活性。
增色效应和减色效应当DNA分子加热变性后，其260nm的紫外吸收会急剧增加的现象称为增色效应。
变性DNA复性后，在260nm处的吸收值减少的现象称为减色效应。
A260值达到最大值1/2时的温度称为解链温度或熔解温度（melting temperature,Tm)，此时50%的DNA分子发生了变性。
核酸分子杂交技术基本原理
核酸分子杂交技术基本原理宝子，今天咱们来唠唠核酸分子杂交技术这个超酷的东西哦。
你知道吗，核酸分子杂交技术就像是一场超级精准的“分子相亲”呢。
核酸嘛，有DNA和RNA这两大主角。
DNA就像一个超级精密的双螺旋结构的蓝图，而RNA呢，在很多时候就像是这个蓝图的“小助手”，负责把蓝图上的信息传递出去，然后去指导各种生命活动。
那核酸分子杂交技术是怎么回事呢？简单来说，就是利用核酸的碱基互补配对原则。
碱基就像是核酸分子上的小密码，A（腺嘌呤）和T（胸腺嘧啶）或者U（尿嘧啶，在RNA里代替T）是一对，G（鸟嘌呤）和C（胞嘧啶）是一对。
就像钥匙和锁一样，它们是专门匹配的。
想象一下，我们有两条不同来源的核酸链，一条是我们已经知道一些信息的，就叫它“已知链”吧，另一条是我们想要去探究的，叫“未知链”。
当我们把它们放在合适的条件下，就像是给它们创造了一个“相亲大会”的环境。
如果未知链上有和已知链互补的序列，那些碱基就会像小磁铁一样，A去找T或者U，G去找C，然后两条链就会部分或者完全地结合在一起。
这一结合，就像是它们互相“认亲”了，我们就可以通过这个结合的情况来获取关于未知链的很多信息呢。
比如说在基因检测里，我们想要知道某个人是不是携带了某种遗传病的基因。
我们就可以用一个已知的正常基因或者突变基因的核酸片段当作“诱饵”，去和这个人的基因样本（也就是那些未知链）进行杂交。
如果能够完美结合，那就说明可能存在某种情况啦。
再说说在研究不同物种的基因关系的时候。
就像探索动物和植物之间那些神秘的基因联系。
我们可以把一个物种的基因核酸链拿出来，去和另一个物种的基因核酸链做杂交。
如果它们之间有杂交的现象，那就表示在漫长的进化过程中，它们可能有着共同的祖先或者有着基因交流的情况。
这个技术在研究病毒方面也超级厉害呢。
病毒的核酸很特别，当我们怀疑某个生物感染了某种病毒的时候，我们就可以用针对这个病毒核酸的已知链去和生物样本里的核酸进行杂交。
核酸杂交技术
核酸杂交技术(Northern Blot、Southern Blot和探针标记）
（一）Southern Blot
原理：
将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。
如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。
用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。
（二）Northern Blot
原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。
用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。
（三）探针标记技术
1 标记物：放射性和非放射性两种
放射性：
非放射性：生物素、地高辛素、荧光素2、标记方法
（1）切口平移法
（2）随机引物法
（3）末端标记法
（4）单链DNA探针标记
（5）寡核苷酸探针标记法。
核酸分子杂交技术定义
核酸分子杂交技术定义核酸分子杂交技术是一种广泛应用于生物学和医学领域的技术手段。
它利用互补配对的原理，将两个核酸链在一定条件下结合成一个双链分子。
该技术可用于分析、检测、鉴定、筛选和修饰核酸分子等方面，具有重要的实验和临床应用价值。
一、技术原理核酸分子杂交技术的原理是基于核酸互补配对的规律。
核酸是由四种碱基（腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和鳞状细胞素）组成的双链分子，两条链通过氢键相互配对形成双螺旋结构。
在核酸分子杂交技术中，将两个互补的核酸链置于一定条件下（如适当的温度、pH值和离子浓度等），使它们形成双链分子。
这个过程中，两个链之间的氢键会断裂，然后重新组合成新的氢键，形成一个更稳定的双链分子。
这个过程被称为“杂交”。
二、应用领域1. 分析基因序列核酸分子杂交技术可用于分析基因序列。
通过与已知序列相比较，可确定未知序列的位置和组成。
这种技术被广泛应用于基因组学和生物技术领域，包括基因定位、基因诊断、基因克隆和基因表达研究等方面。
2. 检测病原体核酸分子杂交技术可用于检测病原体。
该技术可以检测细菌、病毒、真菌和寄生虫等微生物的存在和数量。
与传统的细菌培养方法相比，核酸分子杂交技术具有更高的灵敏度和特异性，可以更快速和准确地诊断疾病。
3. 鉴定基因型核酸分子杂交技术可用于鉴定基因型。
通过检测DNA序列的变异，可以确定不同基因型之间的差异。
这种技术被广泛应用于疾病的遗传咨询、人类学研究和法医学等领域。
4. 筛选基因库核酸分子杂交技术可用于筛选基因库。
该技术可以通过与探针的杂交来筛选目标基因，从而快速地鉴定和克隆感兴趣的基因。
这种技术被广泛应用于基因工程、药物研发和生物产业等领域。
5. 修饰核酸分子核酸分子杂交技术可用于修饰核酸分子。
通过与修饰剂的杂交，可以将不同的化合物引入到核酸分子中，从而实现对分子结构和性质的调控。
这种技术被广泛应用于药物研发、生物材料和生物传感器等领域。
三、实验步骤核酸分子杂交技术的实验步骤包括样品处理、杂交反应、检测和数据分析等环节。
核酸杂交技术的原理和应用
核酸杂交技术的原理和应用介绍核酸杂交技术是一种利用互补配对原理来检测和分析核酸序列的重要技术。
它广泛应用于基因组学、遗传学、分子生物学和生物医学等领域。
本文将介绍核酸杂交技术的原理和应用，并通过列点方式详细解释。
核酸杂交技术的原理1.互补配对原理：核酸分子由碱基组成，DNA分子中的腺嘌呤（A）和胸腺嘧啶（T）以及鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C）之间可以形成互补配对，RNA 分子中的腺嘌呤（A）和尿嘧啶（U）以及鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C）之间也可以形成互补配对。
核酸杂交技术利用这种互补配对原理，根据核酸序列的互补性进行分析。
2.杂交反应：核酸杂交反应是指两条互补的核酸序列在合适的条件下发生结合。
在适当的盐浓度和温度下，核酸链会解开，使碱基的互补配对能够进行。
通过控制反应条件，可以选择性地使核酸链发生杂交反应，从而检测特定的核酸序列。
3.标记物的应用：核酸杂交技术通常需要使用标记物来检测杂交反应的结果。
常用的标记物包括放射性同位素、荧光染料和酶等。
这些标记物可以与杂交的核酸序列结合，通过测量标记物产生的放射性、荧光或酶活性变化来分析核酸杂交反应的结果。
核酸杂交技术的应用1.基因组学研究：核酸杂交技术在基因组学研究中发挥了重要作用。
通过杂交探针，可以检测到不同组织和生物体中的特定基因表达情况，从而深入研究基因调控网络和功能。
此外，核酸杂交技术还可以用于研究基因组的结构和变异。
2.遗传学分析：核酸杂交技术是遗传学分析的重要工具之一。
通过对不同个体的核酸序列进行杂交反应，可以检测到基因型差异和基因变异等关键信息。
这对于遗传性疾病的诊断和研究具有重要意义。
3.分子生物学研究：核酸杂交技术在分子生物学研究中也得到了广泛应用。
它可以用于检测、定位和分析特定核酸序列，从而揭示细胞和分子水平上的生物学过程。
例如，在研究基因表达调控、蛋白质合成和RNA修饰等方面，核酸杂交技术发挥了重要作用。
4.生物医学应用：核酸杂交技术在生物医学领域也有广泛的应用。
核酸分子杂交技术
K去除核酸表面的蛋白质
• 组织细胞内的核酸与蛋白质结合成核酸蛋白复合体 • 控制消化时间，避免细胞结构破坏和核酸从载玻 片上脱落
2、杂交过程： （1）组织或细胞的固定 理想固定液应具备： • 保持组织细胞的形态 • 对核酸无抽提，修饰与降解作用
• 不改变核酸在组织细胞内的定位
• 不阻碍核酸与探针的杂交过程 • 对杂交信号无遮蔽作用 • 理化性质稳定
（2）组织细胞杂交前的预处理
• 去垢剂（如Triton x-100和SDS）和蛋白酶
（2）比色或化学发光检测：适于非核素标记的探针
7、Southern杂交的应用 （1）酶切图谱分析 （ 2）特定基因定性和定量
（3）基因突变分析
（ 4）限制性片段长度多态性的分析
（二）Northern印迹杂交 1、基本原理和基本过程与Southern blot基本相同 2、鉴别RNA
3、探针可用DNA或RNA片段
或硝酸纤维素膜上。
5、Southern杂交 （ 1）预杂交：封闭膜上能与DNA结合的位 预杂交液 为不含DNA探针的杂交液 （2）杂交：液相中的DNA探针与膜上的待测DNA双 链DNA探针需加热变性为单链，再杂交 （3）洗膜：去除游离的放射性探针或非特异结合的 DNA
6、杂交结果检测
（1）放射自显影：适用于放射性核素标记的探针
mRNA
逆转录酶的 DNA聚合酶
互补DNA
DNA 聚合 酶
逆转录酶的 RNase H
分解mRNA
第二条CDNA链
RNA探针
1、RNA探针是单链分子，与靶序列的杂交反应效率高。 2、早期采用的RNA探针是细胞mRNA探针和病毒RNA探 针，这些RNA是在细胞基因转录或病毒复制过程中 得到标记的，标记效率不高，且受到多种因素的制 约。 3、体外逆转录可高效合成RNA，加入标记物可成为探 针 4、应用：例如，在筛选逆转录病毒人类免疫缺陷病 毒（HIV）的基因组DNA克隆时，因无DNA探针可利 用，就利用HIV的全套标记mRNA作为探针，成功地 筛选到多株HIV基因组DNA克隆。
核酸的分子杂交
3 核酸探针的标记
为确定探针是否与相应基因组DNA杂交，有必要对探针加以标记，以便在结合部位获得可识别的信号。
3.1 标记的种类
同位素： 32P、35S、3H、125I等标记探针 非同位素： 生物素、地高辛配体、荧光素等作为标记物 两者比较：后者不及前者敏感，但后者保存时间较长，无同位素污染。
有互补特定核苷酸序列的单链DNA或RNA混在一起时，其相应同源区段将会退火形成双链结构。
Home
应 用：
检测特定生物有机体之间是否存在亲缘关系； 用来揭示核酸片段中某一特定基因的存在与否、拷贝数及表达丰度。
2 核酸探针的制备
2.1 探针（Probe)的概念: 一段带有检测标记的与目的基因或目的DNA特异互补的已知核苷酸序列。
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第五节 核酸的分子杂交 Nucleic Acid Hybridization
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核酸分子杂交 把亲源关系较近的，不同生物个体来源的变性DNA或RNA单链，经退火处理形成DNA-DNA或DNA-RNA这一过程叫分子杂交。
2.2 探针的制备方法
01
02
03
PCR扩增
DNA重组技术
化学合成
长度一般以50~300bp为宜。制备方法：
2.3 探针的分类 据来源及性质不同可分为： 基因组DNA探针 cDNA探针 RNA探针 寡核苷酸探针
2.4 合成寡核苷酸探针注意原则
核酸分子杂交技术
核酸分子杂交技术
核酸分子杂交技术是一种用于检测和分析核酸特异性的分子生物学技术。
它可以检测和分
析特定的基因或基因产物，如RNA或DNA，以及其他特定的核酸分子，如转录因子、调控
因子等。
核酸分子杂交技术可以用来确定特定基因的存在、结构和功能，也可以用来检测
和鉴定病毒、细菌和其他微生物的存在。
核酸分子杂交技术的基本原理是，将两个不同的核酸分子（称为“杂交物”）混合在一起，使它们能够结合在一起。
这种结合是由特定的碱基对结合所决定的，也就是说，只有具有
相同的碱基序列的两个核酸分子才能结合在一起。
结合后的核酸分子杂交物可以被检测到，从而可以用来确定特定核酸分子的存在。
核酸分子杂交技术可以用来检测和分析特定基因的存在、结构和功能，也可以用来检测和
鉴定病毒、细菌和其他微生物的存在。
在肿瘤学研究中，核酸分子杂交技术可以用来检测
肿瘤细胞中特定基因的表达水平，从而可以帮助医生更好地诊断和治疗患者。
此外，核酸
分子杂交技术还可以用来研究基因调控，以及研究基因突变对基因表达的影响。
核酸分子杂交技术的应用非常广泛，可以用来研究基因、蛋白质和其他生物分子，以及病毒、细菌和其他微生物。
它可以用来诊断和治疗疾病，以及研究基因调控和基因突变对基
因表达的影响。
总之，核酸分子杂交技术是一种重要的分子生物学技术，在医学、生物学和其他领域都有
着广泛的应用，可以用来检测和分析特定的基因、病毒和其他微生物，并且可以用来研究
基因调控和基因突变对基因表达的影响。
核酸杂交技术
④ 探针的制备
⑤ Southern杂交 ⑥ 杂交结果的检测
限制性内切酶消化
酶切DNA样品的电泳分离
凝胶中DNA带被 转移到NC膜上
Southern印迹 凝胶中DNA 的NaOH变 性
凝胶中DNA分离带
标记 探针 杂交
探针杂交带曝光显 影
Southern杂交的应用
应用 单基因遗传病的基因诊断 基因点突变的检测 临床应用－－用于下列疾病的产前诊断 镰型细胞贫血 苯丙酮酸尿症 珠蛋白合成障碍性贫血 假肥大型肌营养不良 血友病 慢性进行型舞蹈病
核酸分子杂交 (molecular hybridization of nucleic acid)
核酸分子杂交：单链的核酸分子在合适的条 件下，与具有碱基互补序列的异源核酸形成双 链杂交体的过程。 核酸分子杂交技术：利用核酸分子杂交检测 靶序列的一类技术称核酸分子杂交技术。 核酸分子杂交技术目前应用广泛，是定性或 定量检测特异RNA或DNA序列片段的有力工具。
（一）反向点杂交
反向点杂交（reverse dot blot, RDB） • 是将多种探针固定在同一膜上，同时参与检测的 样品DNA又互不干扰， 故能一次性筛查出多种 不同的序列。 • 特点：简单、快捷、特异性强、稳定性好 • 较Northern blot省去了电泳和毛细转膜过程
（二）Southern印迹杂交
（1）DNA随机引物标记
随机引物：含有各种可 能排列顺序的寡核苷酸 片段的混合物。
DNA聚合酶ⅠKlenow片段： 保留 5’→3’DNA聚合酶 活性 , 弱 3’→5’外切酶 活 性 ， 无 5’→3’ 外 切 酶活性。
（2）DNA切口平移标记
5′ 3′
DNase I，Mg2+
核酸分子杂交
核酸分子杂交引言核酸分子杂交是一种基本的分子生物学技术，用于研究核酸的序列和结构。
通过将两个互补的核酸链合并，可以形成一个双链结构，从而确定核酸分子的完整序列。
本文将介绍核酸分子杂交的原理、方法和应用。
原理核酸分子杂交基于DNA和RNA的互补配对原理。
DNA由四种碱基组成：腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C）。
RNA与DNA的碱基配对方式类似，但胸腺嘧啶（T）被尿嘧啶（U）取代。
互补配对规则如下： - A与T（或U）互补； - G与C互补。
通过利用互补配对规则，可以将两个互补的核酸链合并成一个双链结构。
核酸分子杂交的原理是通过探针和靶标之间的互补配对，来确定目标核酸的序列和结构。
方法核酸分子杂交的方法多种多样，常见的方法包括：杂交化学、Southern杂交和Northern杂交。
1. 杂交化学杂交化学是通过化学反应将探针和靶标的核酸序列进行杂交。
常用的方法包括：- DNA-DNA杂交：将DNA探针与靶标DNA在一定条件下进行杂交，通过测量杂交后的信号来确定目标DNA序列。
- RNA-DNA杂交：将RNA探针与靶标DNA在一定条件下进行杂交，通过测量杂交后的信号来确定目标DNA序列。
2. Southern杂交Southern杂交是一种用于检测特定DNA序列的方法。
首先，将DNA样品切割成片段，并通过电泳分离这些片段。
然后，通过离心转膜将DNA迁移到膜上。
接下来，将标记有互补序列的DNA探针加入到膜上，探针与目标DNA进行互补配对。
最后，通过探针的标记物来检测目标DNA的存在与否。
3. Northern杂交Northern杂交是一种用于检测特定RNA序列的方法。
它与Southern杂交类似，但靶标是RNA而不是DNA。
首先，通过电泳分离RNA样品，并将其迁移到膜上。
然后，通过添加标记有互补序列的DNA或RNA探针，与目标RNA进行互补配对。
最后，通过探针的标记物来检测目标RNA的存在与否。
核酸分子杂交的方法及其在医学检验中的应用
核酸分子杂交的方法及其在医学检验中的应用核酸分子杂交技术及其在医学检验中的应用核酸分子杂交技术是一种技术，可以用来检测和识别特定的基因，查明个体与被研究物之间的关系。
在过去的几十年里，它已经被广泛应用于疾病诊断、环境检测和发现新基因等领域，基本上都要求快速、灵敏和特异性的检测结果，以及定性和定量的研究结果，而这一切都可以通过核酸分子杂交技术来实现。
本文综述其基本原理、步骤、优缺点以及在医学检验中的应用。
一、核酸分子杂交的基本原理核酸分子杂交技术(in situ hybridization, ISH)是一种用来识别和检测特定的基因序列的分子生物学技术，通常用于染色体分析，可以发现特定基因所在的细胞和组织。
它是根据两种相互作用的核酸分子之间结合的原理工作，即“杂交”。
在杂交反应中，一条条的核酸分子（DNA或RNA）互相结合，形成特定的结构，从而在某些非常特异的情况下进行识别。
另外，通过应用适当的荧光技术，可以直观地观察和显示杂交反应。
二、核酸分子杂交技术的步骤核酸分子杂交技术包括以下几个步骤：（1）样本准备。
样本准备是研究时的第一步，在这一步骤中研究者根据自己的研究需求，选择合适的样本。
（2）核酸分离。
在核酸分离步骤中，由于核酸是微小的，因此需要采用特殊的技术来从样本中分离出核酸，而这些技术通常是PCR，即聚合酶链反应，用于提高核酸的灵敏度。
（3）核酸杂交。
在核酸杂交的步骤中，首先，将抗体结合到探针中，然后将探针与样本中的核酸结合起来，形成双螺旋构型，从而实现特异性识别。
（4）信号分析。
在信号分析步骤中，需要对样本中的核酸进行鉴定，以及检测所测试的核酸是否核苷酸序列正确的特定目的。
最常见的技术是利用基因组芯片，通过它们可以对大量的基因进行组合扩增，从而识别、分析和检测出特定基因。
三、核酸分子杂交技术的优缺点（1）优点核酸分子杂交技术有很多优点，如：（1）操作简单，容易实现自动化，可以提高生产效率；（2）能够检测出对特定基因的非常特异性的序列；（3）可以测定大量基因，使得研究者可以更容易地进行基因组学研究；（4）技术可以检测出胞内和蛋白质的体外表达；（5）核酸分子杂交技术的发展使得药物研发有了新的思路和突破，可以更加准确高效地展开新药的研发。
核酸的杂交 名词解释
核酸的杂交名词解释核酸的杂交：基因工程的重要运用方式引言：核酸作为生物体内重要的遗传物质，承载了生命的基本信息。
近年来，随着基因工程的迅猛发展，核酸的杂交技术成为了科学研究和应用领域中不可或缺的一部分。
本文将从定义、原理、应用和前景等方面来解释核酸的杂交。
一、核酸的杂交定义：核酸的杂交（Nucleic acid hybridization）是指不同的核酸分子之间通过碱基互补配对形成双链结构的过程。
这种结合是通过核酸中碱基间的氢键作用来实现的。
二、核酸的杂交原理：核酸的杂交是基于两根核酸链之间碱基的互补配对。
在DNA杂交中，腺嘌呤（A）与胸腺嘧啶（T）之间形成两个氢键，而鸟嘌呤（G）与胞嘧啶（C）之间形成三个氢键。
通过这种碱基的互补配对，可以使两根核酸链通过双链结构相连。
在RNA杂交中，腺苷酸与尿嘧啶酸之间形成两个氢键，而胸腺苷酸与鸟嘌酸之间形成三个氢键。
由于RNA的单链性，使得RNA的核酸杂交相对于DNA更加灵活。
三、核酸的杂交应用：1. 基因检测：核酸的杂交技术可以鉴定特定的基因序列是否存在于样本中，从而实现基因的检测。
例如，可以通过核酸的杂交来检测特定病原体的DNA或RNA是否存在于患者的体液中，实现疾病的早期诊断和治疗。
2. 基因克隆：核酸的杂交是基因克隆技术中的核心步骤之一。
通过将目标基因与载体DNA进行杂交，可以使目标基因与载体DNA相连，从而形成重组DNA。
之后，通过转化等方法将重组DNA导入宿主细胞，实现基因的克隆。
3. 基因表达：核酸的杂交技术可以用于基因的表达调控。
通过将适当的核酸序列引入细胞内，与细胞内的特定核酸序列杂交，可以干扰或激活特定基因的表达，进而调控细胞的功能。
4. 基因组学研究：核酸的杂交技术在基因组学研究中发挥着重要作用。
通过核酸杂交技术，可以进行基因组的比较和分析，揭示基因的分布和功能。
四、核酸的杂交前景：核酸的杂交技术在医学、农业、环境监测等领域具有广阔的应用前景。
分子生物技术—核酸分子杂交技术
一、核酸分子杂交基本原理
(二) 核酸分子杂交基本原理
• 根据核酸变性和复性的原理,不同来源的DNA 变性后,若这些异源DNA之间存在某些相同序 列的区域,在退火条件下则可形成DNA-DNA 异源双链;或将变性的单链DNA与RNA经复 性处理可以形成DNA-RNA杂合双链。这种 不同来源的单链核酸分子在合适的条件下,通 过碱基互补形成双链杂交体的过程称为核酸分 子杂交
三、核酸分子杂交相关技术
（一）传统核酸分子杂交技术
2.Northern杂交
• 对RNA的检测也可以利用与DNA检测 相同的印迹技术来分析。与 Southern 印迹杂交的方法类似,只是变性剂不同
• Southern杂交中使用的使DNA变性的 试剂为NaOH。因为NaOH会水解 RNA的2-羟基基团,所以Northern杂 交中使RNA変性的试剂为甲基氧化汞 、乙二醛或甲醛
• 斑点杂交和狭缝杂交都是将被检标本 点到膜上烘烤固定。不需电泳和转膜 过程,整个操作过程简便、快速
• 缺点是无法判断核酸片段的大小,也无 法判断样品溶液中是否存在着不同的 靶序列,多用作核酸定性或半定量分析 而且便于杂交条件的摸索
三、核酸分子杂交相关技术
（二）核酸原位杂交
• 原位杂交是将核酸分子杂交技术与组 织细胞化学和免疫组织化学结合起来 的一种杂交方法,其基本原理及探针的 标记方法与传统核酸分子杂交技术相 同
三、核酸分子杂交相关技术
（一）传统核酸分子杂交技术
3. 斑点杂交与狭缝杂交
• 将RNA或DNA变性后直接点样于硝酸 纤维素膜或尼龙膜上,再采用特定的探 针进行杂交这种方法称为点杂交
• 若采用狭缝点样器加样后杂交,则称为 狭缝杂交
• 斑点杂交与狭缝杂交的区别是点样形 状的不同
《核酸分子杂交技术》课件
核酸分子杂交原理
互补配对
核酸分子通过互补配对原理相 结合，碱基之间形成稳定的氢 键。
熔解
通过改变温度，使两条核酸分 子解开，断裂氢键，分离出单 链。
探针结合
利用互补配对原理，核酸探针 与目标核酸结合，形成稳定的 双链结构。
核酸探针的制备
1
设计探针序列
根据目标核酸序列设计探针，考虑碱基
合成探针
2
互补性和特异性。
《核酸分子杂交技术》 PPT课件
核酸分子杂交技术是一种重要的实验技术，能够研究DNA和RNA的结构、功 能以及相互作用。让我们一起探索这门神奇的科学吧！
什么是核酸分子杂交技术
1 定义
核酸分子杂交技术是指通过核酸探针与目标 核酸的互补碱基配对作用实现的一种检测、 分离和研究方法。
2 原理
该技术利用核酸分子的碱基互补性特点，使 探针与目标核酸发生相互结合，从而实现目 标分子的检测和定位。
利用合成技术合成目标序列的核酸探针。
3
标记探针
通过化学反应或酶标记等方法，将探针 标记上荧光剂或放射性示踪剂。
应用领域
遗传研究
核酸分子杂交技术在遗传研究中 起到了至关重要的作用，帮助人 们了解遗传信息的传递和变异。
医学诊断
通过核酸分子杂交技术，可以检 测病原体和基因突变，用于疾病 的早期诊断和治疗。
法医分析
核酸分子杂交技术用于法医学领 域的DNA鉴定和犯罪现场的分析， 提供了重要的法律证据。
核酸分子杂交技术的优势
1 高度特异性
通过合理设计探针序列， 核酸分子杂交技术能够高 度特异地检测目标核酸。
2 灵敏度高
核酸分子杂交技的特点。
3 广泛应用
核酸分子杂交技术在基础 研究、生物医学、农业科 技等领域均有广泛应用。
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DNA片段复杂性
合适的复性温度 适当的离子强度
重点提示
分子杂交：指具有一定同源序列的
两条核酸单链（DNA或RNA），在 一定条件下按碱基互补配对原则经 过退火处理，形成异质双链的过程。 利用这一原理，就可以使用已知序 列的单链核酸片段作为探针，去查 找各种不同来源的基因组DNA分子
中的同源基因或同源序列。
核酸分子杂交 (molecular hybridization of nucleic acid)
核酸分子杂交：单链的核酸分子在合适的条 件下，与具有碱基互补序列的异源核酸形成双 链杂交体的过程。 核酸分子杂交技术：利用核酸分子杂交检测 靶序列的一类技术称核酸分子杂交技术。 核酸分子杂交技术目前应用广泛，是定性或 定量检测特异RNA或DNA序列片段的有力工具。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
杂交的特异性。
（二）探针的长度
1.DNA和RNA探针 DNA探针通常为400～500个碱基 2. 寡核苷酸探针 探针的最小长度取决于其靶序列的复杂性
（三）核酸探针的标记
1. 探针标记物的选择
（1）放射性标记 （2）非放射性标记 根据标记物掺入情况可分为均匀标记和 末端标记探针。
不同标记类型探针的比较：
一、核酸探针
核酸探针指能与靶核酸序列发生 碱基互补杂交，并能由其标记被特异 性检测的核酸分子。
（一）常用探针的种类
寡核苷酸探针
DNA探针
探针的种类 RNA探针
基因组DNA探针
cDNA探针
1. DNA探针 最常用的核酸探针 三大优点：
① 这类探针大多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，制备 方法简便； ② DNA探针相对不易被降解，一般DNA酶活性能有效地
32P-标记的DNA
切口最终位置
(3) DNA的末端标记
1) DNA的5′末端标记
条件是有5’-OH存在，人工合成寡核苷酸最常用；双链 DNA需用碱性磷酸酶切除5’-P后再标记 5′p-HO-CpGpTpA……3′ 碱性磷酸酶
5′HO-CpGpTpA……3′
T4噬菌体多核苷酸激酶 [γ -32P]-ATP
（1）DNA随机引物标记
随机引物：含有各种可 能排列顺序的寡核苷酸 片段的混合物。
DNA聚合酶ⅠKlenow片段： 保留 5’→3’DNA聚合酶 活性 , 弱 3’→5’外切酶 活 性 ， 无 5’→3’ 外 切 酶活性。
（2）DNA切口平移标记
5′ 3′
DNase I，Mg2+
dATP，dGTP， dTTP
G-C含量越多 A-T含量越多 Tm值越高 Tm值越低
（2）溶液的离子强度
低离子强度 高离子强度 Tm值越低 Tm值越高
（3）pH值
pH值5-9 pH<4, pH>11 Tm值变化不明显 不利于氢键形成
（4）变性剂
干扰碱基堆积力和氢键的形成
3.复性 变性DNA经过一定处理重新形成双螺旋的过程。 影响复性速度的因素： DNA浓度 DNA片段的大小
2.探针标记方法的选择 制备探针步骤：
探针标记
清除未标记的核酸探针 检测探针标记效率
核酸探针的标记方法
(1) DNA切口平移标记法 (2) DNA随机引物标记法 (3) DNA的末端标记 (4) cDNA探针的标记 (5) 寡核苷酸探针的标记 (6) 单链DNA探针的标记 (7) RNA探针的标记
第四章
核酸杂交技术
目 录
第一节 核酸分子杂交的概念
一、核酸探针
二、分子杂交信号检测
第二节 经典的核酸分子杂交技术
一、固相杂交
二、液相杂交
目 录
第四节 影响杂交信号检测的因素
一、探针的选择
二、探针的标记方法
三、探针的浓度 四、杂交率 五、杂交温度 六、杂交的严格谨性 七、杂交反应时间 八、杂交促进剂
第一节
核酸分子杂交的概念
变性
退火
复性
核酸分子杂交的基本原理
1、变性（denaturation）
定义：在一定的条件下，双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，
形成无规则线团，双链解链成为单链。
2、融解温度 (Melting Temperature, Tm)
定义：在DNA热变性时，其A260的升高达最大值一半时的温度。 影响Tm的因素： （1）DNA碱基的组成
被抑制；
③ DNA探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择， 如缺口平移法、随机引物法、PCR标记法等，能用于 放射性核素和非放射性物质标记。
2.RNA探针
• 优点：杂交效率高，稳定性高，非特异性 杂交较少，未杂交探针可用RNase 降解， 减少本底的干扰。 • 缺点：易降解，标记方法复杂 。
3.寡核苷酸探针 寡核苷酸探针一般由17～50个核苷酸组成。 优势：可以区分仅仅一个碱基差别的靶序列； 缺陷：寡核苷酸不如长的杂化核酸分子稳定， 需优化杂交和洗脱条件以保证寡核苷酸探针
二、分子杂交信号检测
（一）放射性标记探针检测 1、放射自显影 2、液体闪烁计数法 （二）非放射性标记探针的杂交检测 1、酶促显色检测 2、荧光检测 3、化学发光检测 4、多探针检测
优点 缺点
可以准确定量；灵 放射性探 敏度高；本底低； 易于除去旧探针, 针 重新杂交新探针 对人体危害小；稳 非放射性 定，可供长时间内 持续使用；检测过 探针 程快；可同时进行 不同标记探针的杂 交；本底较低
短半衰期的探针需临用 前制备；放射性递减使 探针降解；放射性物质 对人体有害；费用贵 灵敏度不如放射性探针； 杂交条件受报告基团的 限制；重新杂交新探针 比较困难
DNA聚合酶I [α-32P]-dCTP
3′ 5′ DNA 酶 Ⅰ ： 在 双 链 DNA 上 随 机 打开 若 干 个单 链 缺 口 ， 产 生 3’-OH 端。 大肠杆菌 DNA 聚合酶Ⅰ ： 5’→3’DNA 聚 合 酶 活 性 ； 5’→3’ 外 切 核酸酶活性。
32P-部分标记的
变性
单链DNA片段 切口原始位置
5′32p-O-CpGpTpA……3′
37℃，反应10min, γ -32P-ATP 需150 μ ci/反应
2)
5′ 3′
DNA的3′末端标记
3′ 5′ 限制性内切酶 3′ 完整双链DNA
5′
5′ 3′
5′
3′
5′末端突出的 3′ 5′ DNA Klenow DNA聚合酶 [α -32P]-dNTP 其他3 种dNTP 3′ 3′末端标记的 5′ DNA 变性 3′ 32P-末端标记的 5′ 单链DNA探针