血管内皮细胞体外培养(赵)

血管内皮细胞体外培养

1．概述血管内皮细胞（endothelial cell, EC）是衬于心，血管和淋巴管腔内表面的一种单层扁平上皮细胞。EC极薄，厚度约为0.1～1μm，长约25～50μm，宽约10～15μm，在体内呈梭形，相邻细胞之间借少量粘合质彼此嵌合，细胞长轴与血流方向平行。其超微结构特点是在胞质中含有的特殊颗粒，称Weibel-palade小体（内含有与凝血有关的第Ⅷ因子相关抗原）；细胞间有紧密连接的缝隙相连。EC除了能保持血管壁内表面的光滑和通透性外，还有多种生物学功能：维持正常的血液流动性，分泌多种生物活性物质，在调节细胞生长，改变脂质代谢，维持血管壁的完整性，调节血管张力和选择性通透性以及免疫调节方面起到重要作用。EC功能的异常，与血栓形成、动脉粥样硬化、高血压等心血管疾病及肿瘤扩散，免疫疾病都有密切关系。体外培养中的EC形态呈"鹅卵石样"镶嵌排列，细胞长满后呈接触抑制现象。

2．培养方法EC生长在血管内表面，由于其所处的独特位置不利于观察和研究，所以体外培养EC显得特别重要，目前已有多种种属（人、牛、猪、兔、大鼠等），多种组织（脐带动脉、静脉、肺动脉、主动脉、脑毛细血管、心脏毛细血管等）的EC能在体外培养成功。人们将培养器皿预先用明胶或纤连蛋白或胶原等粘附蛋白包被后，形成人工的EC下基质层，可促进EC的粘附与生长。

2.1 方法原理用酶消化法，酶消化＋机械刮脱法或单纯刮脱法将EC分离下来，在适宜的条件下可贴壁并长成致密单层。

2.2 介绍几种主要EC的分离

2.2.1 酶消化法大血管内皮细胞的分离

2.2.1.1 人脐带动、静脉（或其它大血管）

a．在37℃水浴中，预热培养用的所有无菌溶液，备用。

b．在无菌条件下，取健康产妇分娩后新鲜的婴儿脐带（25cm左右，不超过6h），选择无夹痕、无扭曲、无凝血阻塞的部分，放入含有100 U/ml的青霉素和100 μg/ml链霉素的D-Hanks液中，在脐静脉或脐动脉的两端插入磨平的注射器针头用丝线扎紧，用注射器从一端注入D-Hanks液冲洗血管，直到流出的液体无血迹。

c．注入0.1%胶原酶（1型）溶液，待血管内残留的D-Hanks液流尽后，用注射器封注另一端针头，继续注入胶原酶溶液，致血管充盈，放入37℃无菌的D-Hanks液中，消化15min 后取出。

d．收集血管内酶溶液，并且注入含20%小牛血清的M199培养液（pH 7.2）冲洗血管收集合并于同一容器内，以1000r/min离心7～10min。

e．去上清液，加入20%小牛血清的M199培养液重新悬浮细胞备用。

f．其它大血管如牛主动脉，猪主动脉等，可在无菌下分离，然后用线结扎血管各分支，再依上述步骤分离EC。

2.2.2 酶消化法小血管内皮细胞的分离

2.2.2.1 兔主动脉，大鼠主动脉因血管较小，分支极细，不能采用上述方法消化。

a．将动物主动脉取出后放D-Hanks中，将血管外的脂肪细组织分离干净，用丝线结扎血管一端，然后用探针顶住该端，将整条血管翻转，使内膜翻在外面。将另一端折入腔内0.5cm，并用丝线结扎紧，以防外膜外露及避免酶液进入外膜腔内。

b．用D-Hanks液清洗干净外翻的内膜面，然后血管浸泡在含0.1%胶原酶溶液的小瓶内，盖上瓶盖在37℃水浴中轻轻摇荡消化，使EC离散下来，消化15～20min后，见酶液稍有混

浊，即加入等量的含20%小牛血清的M199培养液，以终止酶的作用。

c．收集消化后的酶溶液以1500r/min离心5min，弃上清，用20%小牛血清M199培养液重新悬浮细胞。

2.2.3 酶消化--机械刮脱法猪主动脉EC的分离

a．麻醉状态下，在颈部切口，分离并剪断颈动脉，放血处死。在无菌条件下，作胸腹联合切口，迅速打开胸腔，分离并取出胸主动脉和腹主动脉，置含D-Hanks液的培养皿中，尽量去除血管外膜的脂肪和纤维组织，然后用D-Hanks液多次冲洗血管外表及血管管腔内的凝血，再放入新装有D-Hanks的溶液中。

b．纵何剪开血管，反复冲洗干净血管内壁后，在另一无菌大培皿中，滴加薄薄一层0.125%胰蛋白酶和0.01% EDTA的混合消化液，将主动脉内膜面朝下铺在酶混合液之上。在37℃条件下，让内膜与酶溶液充分接触并消化10～20min，再加入含少量20%小牛血清的M199培养液，以终止酶的作用。

c．把上述主动脉移至另一无菌培养皿，用小手术刀轻轻将内皮刮下。先顺向有次序地刮内膜1～2次，然后再横向刮1～2次，用M199液将内皮细胞收集到离心管中，以1000r/min 离心7～10min，去上清，用20%小牛血清M199培养液重新悬浮细胞备用。

2.2.4 机械刮脱法血管内皮细胞的分离

取长度为20cm的大血管，用D-Hanks液将血管内、外冲洗干净后，无菌条件下沿纵轴剪开，使血管内皮朝上向外暴露，再用D-Hanks液冲洗2次，然后用刮刀轻轻刮取内膜表面的内皮细胞，刮取时，动作应轻柔均匀，刮刀与表面的角度约为60℃，每处只能刮1次，不可刮血管的边缘，刮下的细胞悬浮于M199液中，以1000r/min离心7～10min，去上清，再重复洗涤1次，重新悬浮于20%小牛血清M199培养液中备用。

2.2.5 还有微血管内皮细胞的分离及干贴法分离EC等，但较少用。

2.3 EC原代培养及传代培养

2.3.1 原代培养将分离好备用的EC用含100 U/ml青霉素和100μg/ml链霉素以及20%小牛血清的M199培养液（M199完全培养液）调整细胞浓度为1.5～2.0×105/ml，接种到以0.1%纤连蛋白或1%明胶包被已干燥的平皿或培养瓶中。放37℃、5% CO2和饱和湿度的孵育箱中培养。24h后弃去培养液，用D-Hanks液淋洗1次，以去除未贴壁或死亡的细胞，换入等量的M199完全培养液，继续孵育箱中培养。每2～3d换M199完全培养液1次，换液时将原培养液弃掉1/2～2/3，然后加入新鲜的M199完全培养液至原来的量，6～7d后细胞可融合成单层内皮细胞，即可传代。

2.3.2 传代培养

2.3.2.1 待原代培养细胞长至融合状态后，弃培养液，用预温的D-Hanks液淋洗2次，加入终浓度0.125%胰蛋白酶、0.01% EDTA混合消化液，正好形成一浅层液面将细胞复盖，室温下（20～25℃）消化1～2min。

2.3.2.2 镜下见细胞稍收缩变圆，细胞间隙增宽后，立即翻转培养瓶，弃酶液。可再用D-Hanks液轻洗1次或直接加入新鲜M199完全培养液后，用吸水管（滴管）将细胞轻轻吹打下来，按1∶2或1∶3的比例传代。

2.3.2.3 每隔2～3d换液1次，每次换掉2/3量，待细胞长至融合状态后，再次传代。

2.4 观察结果

用酶消化进行的原代培养，从动脉内膜上消化收集下来的内皮细胞，30min后即开始贴壁，呈扁平短梭形或多角形分散生长；4～6h后大部分细胞已贴壁，并开始生长，分裂，24h 后形成数量不等的细胞群，约6～7d融合成片。传代培养的EC，10min后贴壁，5～7d融合成单层。

2.5 内皮细胞的鉴定