血管内皮细胞体外培养(赵)

血管内皮细胞体外培养1．概述血管内皮细胞（endothelial cell, EC）是衬于心，血管和淋巴管腔内表面的一种单层扁平上皮细胞。

EC极薄，厚度约为0.1～1μm，长约25～50μm，宽约10～15μm，在体内呈梭形，相邻细胞之间借少量粘合质彼此嵌合，细胞长轴与血流方向平行。

其超微结构特点是在胞质中含有的特殊颗粒，称Weibel-palade小体（内含有与凝血有关的第Ⅷ因子相关抗原）；细胞间有紧密连接的缝隙相连。

EC除了能保持血管壁内表面的光滑和通透性外，还有多种生物学功能：维持正常的血液流动性，分泌多种生物活性物质，在调节细胞生长，改变脂质代谢，维持血管壁的完整性，调节血管张力和选择性通透性以及免疫调节方面起到重要作用。

EC功能的异常，与血栓形成、动脉粥样硬化、高血压等心血管疾病及肿瘤扩散，免疫疾病都有密切关系。

体外培养中的EC形态呈"鹅卵石样"镶嵌排列，细胞长满后呈接触抑制现象。

2．培养方法EC生长在血管内表面，由于其所处的独特位置不利于观察和研究，所以体外培养EC显得特别重要，目前已有多种种属（人、牛、猪、兔、大鼠等），多种组织（脐带动脉、静脉、肺动脉、主动脉、脑毛细血管、心脏毛细血管等）的EC能在体外培养成功。

人们将培养器皿预先用明胶或纤连蛋白或胶原等粘附蛋白包被后，形成人工的EC下基质层，可促进EC的粘附与生长。

2.1 方法原理用酶消化法，酶消化＋机械刮脱法或单纯刮脱法将EC分离下来，在适宜的条件下可贴壁并长成致密单层。

2.2 介绍几种主要EC的分离2.2.1 酶消化法大血管内皮细胞的分离2.2.1.1 人脐带动、静脉（或其它大血管）a．在37℃水浴中，预热培养用的所有无菌溶液，备用。

b．在无菌条件下，取健康产妇分娩后新鲜的婴儿脐带（25cm左右，不超过6h），选择无夹痕、无扭曲、无凝血阻塞的部分，放入含有100 U/ml的青霉素和100 μg/ml链霉素的D-Hanks液中，在脐静脉或脐动脉的两端插入磨平的注射器针头用丝线扎紧，用注射器从一端注入D-Hanks液冲洗血管，直到流出的液体无血迹。

c．注入0.1%胶原酶（1型）溶液，待血管内残留的D-Hanks液流尽后，用注射器封注另一端针头，继续注入胶原酶溶液，致血管充盈，放入37℃无菌的D-Hanks液中，消化15min 后取出。

d．收集血管内酶溶液，并且注入含20%小牛血清的M199培养液（pH 7.2）冲洗血管收集合并于同一容器内，以1000r/min离心7～10min。

e．去上清液，加入20%小牛血清的M199培养液重新悬浮细胞备用。

f．其它大血管如牛主动脉，猪主动脉等，可在无菌下分离，然后用线结扎血管各分支，再依上述步骤分离EC。

2.2.2 酶消化法小血管内皮细胞的分离2.2.2.1 兔主动脉，大鼠主动脉因血管较小，分支极细，不能采用上述方法消化。

a．将动物主动脉取出后放D-Hanks中，将血管外的脂肪细组织分离干净，用丝线结扎血管一端，然后用探针顶住该端，将整条血管翻转，使内膜翻在外面。

将另一端折入腔内0.5cm，并用丝线结扎紧，以防外膜外露及避免酶液进入外膜腔内。

b．用D-Hanks液清洗干净外翻的内膜面，然后血管浸泡在含0.1%胶原酶溶液的小瓶内，盖上瓶盖在37℃水浴中轻轻摇荡消化，使EC离散下来，消化15～20min后，见酶液稍有混浊，即加入等量的含20%小牛血清的M199培养液，以终止酶的作用。

c．收集消化后的酶溶液以1500r/min离心5min，弃上清，用20%小牛血清M199培养液重新悬浮细胞。

2.2.3 酶消化--机械刮脱法猪主动脉EC的分离a．麻醉状态下，在颈部切口，分离并剪断颈动脉，放血处死。

在无菌条件下，作胸腹联合切口，迅速打开胸腔，分离并取出胸主动脉和腹主动脉，置含D-Hanks液的培养皿中，尽量去除血管外膜的脂肪和纤维组织，然后用D-Hanks液多次冲洗血管外表及血管管腔内的凝血，再放入新装有D-Hanks的溶液中。

b．纵何剪开血管，反复冲洗干净血管内壁后，在另一无菌大培皿中，滴加薄薄一层0.125%胰蛋白酶和0.01% EDTA的混合消化液，将主动脉内膜面朝下铺在酶混合液之上。

在37℃条件下，让内膜与酶溶液充分接触并消化10～20min，再加入含少量20%小牛血清的M199培养液，以终止酶的作用。

c．把上述主动脉移至另一无菌培养皿，用小手术刀轻轻将内皮刮下。

先顺向有次序地刮内膜1～2次，然后再横向刮1～2次，用M199液将内皮细胞收集到离心管中，以1000r/min 离心7～10min，去上清，用20%小牛血清M199培养液重新悬浮细胞备用。

2.2.4 机械刮脱法血管内皮细胞的分离取长度为20cm的大血管，用D-Hanks液将血管内、外冲洗干净后，无菌条件下沿纵轴剪开，使血管内皮朝上向外暴露，再用D-Hanks液冲洗2次，然后用刮刀轻轻刮取内膜表面的内皮细胞，刮取时，动作应轻柔均匀，刮刀与表面的角度约为60℃，每处只能刮1次，不可刮血管的边缘，刮下的细胞悬浮于M199液中，以1000r/min离心7～10min，去上清，再重复洗涤1次，重新悬浮于20%小牛血清M199培养液中备用。

2.2.5 还有微血管内皮细胞的分离及干贴法分离EC等，但较少用。

2.3 EC原代培养及传代培养2.3.1 原代培养将分离好备用的EC用含100 U/ml青霉素和100μg/ml链霉素以及20%小牛血清的M199培养液（M199完全培养液）调整细胞浓度为1.5～2.0×105/ml，接种到以0.1%纤连蛋白或1%明胶包被已干燥的平皿或培养瓶中。

放37℃、5% CO2和饱和湿度的孵育箱中培养。

24h后弃去培养液，用D-Hanks液淋洗1次，以去除未贴壁或死亡的细胞，换入等量的M199完全培养液，继续孵育箱中培养。

每2～3d换M199完全培养液1次，换液时将原培养液弃掉1/2～2/3，然后加入新鲜的M199完全培养液至原来的量，6～7d后细胞可融合成单层内皮细胞，即可传代。

2.3.2 传代培养2.3.2.1 待原代培养细胞长至融合状态后，弃培养液，用预温的D-Hanks液淋洗2次，加入终浓度0.125%胰蛋白酶、0.01% EDTA混合消化液，正好形成一浅层液面将细胞复盖，室温下（20～25℃）消化1～2min。

2.3.2.2 镜下见细胞稍收缩变圆，细胞间隙增宽后，立即翻转培养瓶，弃酶液。

可再用D-Hanks液轻洗1次或直接加入新鲜M199完全培养液后，用吸水管（滴管）将细胞轻轻吹打下来，按1∶2或1∶3的比例传代。

2.3.2.3 每隔2～3d换液1次，每次换掉2/3量，待细胞长至融合状态后，再次传代。

2.4 观察结果用酶消化进行的原代培养，从动脉内膜上消化收集下来的内皮细胞，30min后即开始贴壁，呈扁平短梭形或多角形分散生长；4～6h后大部分细胞已贴壁，并开始生长，分裂，24h 后形成数量不等的细胞群，约6～7d融合成片。

传代培养的EC，10min后贴壁，5～7d融合成单层。

2.5 内皮细胞的鉴定2.5.1 光镜检查在倒置相差显微镜下可观察到活细胞呈扁平的短梭形或多角形，大小均匀，胞核清晰，呈卵圆形。

有核的区域较无核的区域突出，细胞呈单层"鹅卵石样"或"铺路石样"镶嵌排列。

2.5.2 透射电镜检查经切片技术处理后可观察到具有特征性的细胞器（webel-palade，W-P小体），但兔及猪的EC无W-P小体。

2.5.3 第Ⅷ因子相关抗原免疫荧光检测EC用PBS冲洗干净，放入乙醇和丙酮（1∶1）溶液中固定10min，空气晾干，加入第Ⅷ因子相关抗原抗血清（兔抗人Ⅷ因子相关抗原抗血清），37℃孵育60min。

用PBS冲洗干净，晾干后加第一动物IgG荧光抗体（羊抗兔IgG荧光抗体），37℃孵育30min。

PBS冲洗干净，晾干，最后用缓冲甘油封片，在荧光显微镜下观察到EC的胞浆内呈显较强的黄绿色荧光，是鉴定体外培养EC最可靠的标志。

因第Ⅷ因子只存在于内皮细胞、巨核细胞和血小板中，其它细胞无第Ⅷ因子，但培养的猪主动脉内皮细胞也无此因子。

2.6 注意事项2.6.1 接种材料的制备血管取材的离体时间不宜过长，一般不超过6h，万一不能当时培养，则应放置4℃下保存（但不应超过24h），血管内、外表面的血迹必须充分洗净，以免残留的RBC及血液中某些因子影响EC的贴壁或生长。

2.6.2 酶消化液浓度的选择0.1%（Ⅰ型）胶原酶溶液，0.25%胰蛋白酶溶液，0.25%胰蛋白酶0.02% EDTA混合消化液，0.125%胰蛋白酶0.01% EDTA混合消化液（常用于传代），根据实验情况选定。

掌握好酶液的消化时间是内皮细胞存活的关键（原代培养）。

2.6.3 杂细胞的排除细胞传代时，加入酶消化液之后，置显微镜下观察，1～2min即可见大部分EC收缩变圆，而杂细胞（主要是成纤维细胞）仍然贴壁。

此时，立即加入M199完全培养液以终止酶的活性，然后弃去其液体，加新鲜M199完全培养液，轻轻将细胞吹打下来，传到另一培养瓶，如此经过2～3次，可得到较纯的EC。

其次有人使用含肝素的完全培养液（在液体中加入90U/ml的肝素）可使EC纯度提高。

2.6.4 EC的培养条件EC培养条件要求比较严格，培养液的pH温度，抗生素的种类和含量，血清质量和活性，ECGF的质量和含量，EC分离时所受到的创伤，孵育箱的培养条件，都对EC的生长有重要影响。

2.6.4.1 小牛或胎牛血清的质量对EC的生长影响很大，胎牛血清较小牛血清更好。

一般原代培养用20%，传代培养用10%血清，常用培养基为M199，pH 7.2为宜。

2.6.4.2 塑料培养瓶或皿较玻璃或皿更利于EC生长，培养瓶或皿铺上纤连蛋白，明胶或胶原，以利EC的贴壁生长，但应首选纤连蛋白，因它对蛋白和DNA的测定无显著影响。

2.6.4.3 EC的传代培养一般EC的传代比例是1∶2或1∶3。

如需要单次传代，扩大体外培养规模时，可以1∶20以上的比例进行传代，这样可在短期内获得大量的EC，进行冻存或实验工作，但单次传代，扩大体外培养规模，须在培养液中加入内皮细胞生长因子（endothelial cell growth factor，ECGF），只是该因子价格较昂贵。

EC经多次传代后其形态和生物学特性会有所改变，并且其生长期有限，不断衰退，故不宜作长期传代培养，一般生长期在20～30d左右，如实验需要可重复从原代建立培养。

体外培养EC用于评价抗动脉粥样硬化的药效学实验现介绍几种常用的实验方法1．保护血管内皮细胞（endothelial cells，EC）药的实验损伤学说认为，机械、化学、免疫、感染等引起EC损伤是动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）的起始因素，反复的EC损伤引起单核巨噬细胞、血小板粘附，可致AS斑块形成。