冰冻切片HE染色步骤

冰冻切片染色步骤

冰冻切片染色的步骤如下：
冰冻切片染色的步骤如下：
1.配制染色液和分化液。

根据所需的染色效果，配制染色液和分化液。

例如，
伊红染色液的配方是在95%乙醇100ml中加入1g伊红，玻璃棒搅拌均匀；
1%盐酸酒精分化液的配方是36%-38%的盐酸1ml加入75%乙醇99ml中混匀。

2.将切片放入苏木精染液中染色一定时间，根据实际需要决定染色时间。

3.自来水洗去浮色。

4.进入分化液进行分化处理。

5.自来水冲洗半小时以上，使切片蓝化。

6.过滤后加入伊红染色液染色一定时间。

7.再次自来水洗去浮色。

8.加入伊红染色液染色一定时间，使切片呈现出所需的染色效果。

9.最后进行脱水、透明、封片等处理，完成染色过程。

请注意，在进行冰冻切片染色时，应调整试剂和制片过程中各步骤的时间，所制冰冻切片应染色鲜明，结构清晰。

HE染色方法与步骤吐血整理

HE染色试剂配置A：0.5~1%的伊红酒精溶液：称取伊红Y0.5~1g，加少量蒸馏水溶解后，再滴加冰醋酸直至浆糊状。

以滤纸过滤，将滤渣在烘箱中烤干后，以95%酒精（即工业酒精，如果不怕浪费，用无水乙醇配制也可）100毫升溶解。

B：苏木素染液配方：(配制3000ml，可按比列减少)苏木精6g无水乙醇100ml硫酸铝钾150g蒸馏水2000ml碘酸钠1.2g冰醋酸120ml甘油900ml配制方法：将苏木素溶于无水乙醇，再将硫酸铝钾溶于蒸馏水，溶解后将甘油倾入一起混合，最后加入冰醋酸和碘酸钠。

C：1%盐酸酒精分化液：将1毫升浓盐酸加入99毫升70%酒精中即可。

染色流程(1)二甲苯（Ⅰ）15min(2)二甲苯（Ⅱ）15min（3）二甲苯：无水乙醇=1:12min(4)100%乙醇（Ⅰ）5min(5)100%乙醇（Ⅱ）5min(6)80%乙醇5min(7)蒸馏水5min(8)苏木精液染色5min(9)流水稍洗去苏木精液1-3s(10)1%盐酸乙醇1-3s(11)稍水洗10-30s(12)蒸馏水过洗1-2s(13)0.5%伊红液染色1-3min(14)蒸馏水稍洗1-2s(15)80%乙醇稍洗1-2s(16)95%乙醇（Ⅰ）2-3s(17)95%乙醇（Ⅱ）3-5s(18)无水乙醇5-10min(19)石炭酸二甲苯5-10min(20)二甲苯（Ⅰ）2min(21)二甲苯（Ⅱ）2min(22)二甲苯（Ⅲ）2min(23)中性树胶封固注：①第（11）、（12）步可省去，（13）步冲水时间需延长至20-30min。

②第（21）步如果不用石炭酸二甲苯，可改用无水乙醇。

*冷冻切片HE染色步骤：（1）冰冻切片固定10～30s（2）稍水洗1～2s（3）苏木精液染色（60℃）30～60s（4）流水洗去苏木精液5～10s（5）1%盐酸乙醇1～3s（6）稍水洗1～2s（7）促蓝液返蓝5～10s（8）流水冲洗15～30s（9）0.5%曙红液染色30～60s（10）蒸馏水稍洗1～2s（11）80%乙醇1～2s（12）95%乙醇1～2s（13）无水乙醇1～2s（14）石炭酸二甲苯2～3s（15）二甲苯（Ⅰ）2～3s（16）二甲苯（Ⅱ）2～3s（17）中性树胶封固。

HE染色资料介绍

普通染色又称常规染色或HE（Haematoxylin and eosin）染色。

它是病理技术中最常用的一种方法，通过它可以做出病理诊断和发现寻求别的辅助方法，以达到准确，完整的病理诊断。

一、染色目的病理学的所有切片，都必须通过一种以上的染料，通过各种不同的方法，将切片中各种不同的物质，在不同染液的作用下，将其显示出来，使之在光学显微镜下，能够完全的观看各种结构。

例如，HE染色，好质量的切片可以清晰地显示出许多不同的结构，细胞核着蓝黑色，细胞浆着粉红色，软骨着蓝色等。

清晰的结构为诊断提供可靠的依据，因此，染色技术也是病理技术中的重要组成部分，必须不断地总结，方能提高。

如果染色不好，切片染色一团糟，红蓝不分，结构不清，层次不明，影响了镜下的观察，直接影响了临床诊断，染色结果的好坏直接关系到诊断的准确性。

二、染色的作用1．化学作用：所有的染色液中，可把它们分为两种类型，一种为酸性，另一种为碱性。

酸性染料中有染色作用的为阴离子，碱性染料中有染色作用的为阳离子，每个细胞也存在着两种物质，细胞核含的是酸性物质，细胞浆含的是碱性物质。

在染色时，细胞核中的酸性物质与苏木素染液中的阳离子发生作用，细胞浆中的碱性物质与伊红染液中的阴离子发生作用，由于反应的部位不同，结果着色有异。

2．物理作用：在染色过程中，染液中的色素微粒子浸入到被染组织的粒子间隙内，此时，因受分子的引力作用，色素微粒子被吸附而着色。

由于各种组织有不同的吸附能力和不同的吸附程度，因此就可显出来不同的颜色来。

一般来说，染色的学说还有许多，但说服力强的仅有上述两种。

但不管怎么样解释，实际上完成的每一种染色，都与上述两种学说分不开，它们的作用是相辅相成，同时存在的。

三、染色方法及步骤1．人工苏木素-伊红染色法（HE法）(1)切片浸入二甲苯中5-10min；(2)切片浸入二甲苯中5-10min；(3)100%酒精1min。

(4)100%酒精1min。

(5)95%酒精1min。

HE染色方法与步骤吐血整理

HE染色方法与步骤吐血整理染色是一种常见的实验技术，用于观察和分析生物样品中的细胞或组织结构。

HE染色是一种常用的组织和细胞染色方法，它能够同时染色细胞核和细胞质，因此得名HE（hematoxylin and eosin）染色。

下面是HE染色的步骤：1.染色前的准备工作：-选择合适的组织样品，通常是已固定和包埋的组织切片。

-准备好需要使用的试剂和设备，包括显微镜玻片、切片刀、染色盘、醇和蜡解剂、染色液和显微镜。

-将切片从包埋蜡中去蜡，并通过浸泡在蜡解剂中来溶解蜡质。

2.组织切片的处理：-将组织切片通过水洗涤，去除蜡解剂和剩余的蜡质。

-将切片通过不同浓度的醇溶液进行脱水处理，使得切片逐渐转移到无水状态。

-将脱水处理后的切片通过透明质量更好的试剂（如亚硫酸氢钠或甘油）进行透明处理，以利于细胞的观察。

3.组织切片的染色：-首先进行碱性染色，即将切片浸泡在染色盘中的伊洛酮溶液中，伊洛酮是一种天然的染色物质，能够与细胞核结构中的DNA结合，使细胞核染色为暗蓝色。

-然后进行酸性染色，即将切片浸泡在染色盘中的苏木精溶液中，苏木精是一种带正电荷的染色物质，能够与细胞质结构中的负电荷部分结合，使细胞质染色为粉红色。

4.组织切片的脱水和封片：-将染色后的切片通过不同浓度的醇溶液进行脱水处理，使得切片从水状态逐渐转移到无水状态。

-将切片在醇溶液中固定一段时间，然后转移到透明的试剂（如苏木精和二甲苯混合溶液）中进行浸泡。

- 最后将切片取出，放在显微镜玻片上，滴入固定剂（如Canada Balsam）并加盖玻片，使切片固定在玻片上。

5.显微镜观察和分析：-使用显微镜观察染色后的组织切片，并通过不同增大倍数的镜头进行详细观察。

-根据观察到的细胞和组织结构，进行分析和研究，并将观察结果记录下来。

需要注意的是，HE染色是一种简单、快速且广泛应用的染色方法，但在不同类型的组织和细胞中可能会有不同的染色效果。

因此，在进行HE染色时，需要根据具体实验要求和样品的特点，进行相应的优化和调整。

冰冻切片HE染色步骤
一、前期准备
1.准备一台离心机，一台冰冻切片机，以及一些必要的试剂。

2.准备好HE染色的染料，染色的步骤如下：第一步请准备容器，将染料加入容器，每100毫升液体添加1克染料，加入稀盐酸调节PH值为7，然后加入清水到1000毫升。

3.根据患者的病史，准备相应的脓液或活检标本，准备切片培养基，涂片器，和贴片剂。

二、冰冻切片
1.将标本放入冰冻机，调节冰冻机到适合组织切片切割的温度，一般为-30℃。

2.将冷却后的标本放入冰冻机的金属梢，使标本在梢上稳定不动。

3.在梢上的标本上调整至合适的位置，并使用钳子轻轻捏住，能稳定的切割标本。

4.将梢放入冰冻机的切割室，将刀头拉扯，然后上下拉动，从而完成组织的切割。

5.完成切割后，将切片放入保存液中，放入冰箱冷藏，保存至HE染色时使用。

三、组织贴片
1.将预先制备好的培养基，及HE染料容器加入离心机，离心至合适的转速。

2.将冷藏好的切片取出，用湿润的布蘸取适量的贴片剂，在切片表面覆盖贴片剂。

3.在贴片后的组织标本上，会见涂片器，将涂片器中加入HE染料，以及按顺序均匀地涂抹在贴片后的组织标本上。

4.将涂抹好的组织标本放入。

冷冻切片方法及注意事项

一、实验前准备清理实验台及仪器。

开启冷冻切片机并将冷冻切片机预降至所需温度（- 15~-20 ℃*）。

准备好处理好的载玻片、刀片、胶水以及药品。

二、取材解剖之后迅速取出所需的新鲜组织，用干纱布或滤纸擦干后不需固定直接取材（24×24×2mm*）,以防形成冰晶造成切片中形成形状不一的空泡,使细胞内结构移位。

（注：取材中目的标本既要明确也要确保其结构的完整性，应避免不必要的脂肪及坏死组织附着;要尽量剔除毛发、硬骨或钙化物;保乳手术切缘由于脂肪组织较多,取材厚度最好不要超过3mm，厚者冰冻费时，大者难以切完整。

甲状腺及淋巴结组织要带全组织被膜并除去多余的脂肪组织。

）三、冷冻切片1、取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上冰冻，用吸热器压住组织，至包埋剂与组织冻结成白色冰体即可切片（1~3分种）。

2、将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。

3、调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5～10μm间。

4、调好防卷板。

制作冰冻切片，关键在于防卷板的调节上，这就要求操作者要细心，准确地将其调较好，调校至适当的位置。

切片时，以切出完整、平滑的切片为准。

切好的组织在干净的玻片上黏附时顺着一个方向稍微用力轻轻一带,可避免组织摊片过程中皱折,保证组织结构的完整及切片的美观。

注：①包埋剂的选用：包埋剂是对冷冻切片质量一重要影响因素，包埋剂用量要适宜，过多或过少都会影响标本冷冻质量。

常用的有三种包埋剂OCT剂、B超藕合剂以及普通胶水。

B超藕合剂适用于细胞丰富质地较嫩的组织,普通胶水或OCT剂适用于纤维丰富质地偏硬组织。

（OCT包埋剂骤冷时固化，其冷冻速度和软硬韧度与组织相近，其还具有水溶性，不影响染色等优点。

）②组织块过小：先将少量胶挤在托架上预先放在冰冻机中冷冻,约30秒钟左右待胶凝固时将小组织放上,组织周围再加一些胶,再次置于冷冻机中冷冻,这样组织被垫高,就能快速切出高质量的切片。

冰冻切片的免疫组化染色步骤

冰冻切片的免疫组化染色步骤
1.准备工作：
（1）准备正常组织冰冻切片，使用离心切片机将原有组织材料切成
5-10μm厚的片层，切片后立即放入凝胶剂（如冰冻液中的季铵盐）内，
紧急冷冻到-20℃；
（2）准备石蜡糊，将石蜡熔解并加入一定量的溶剂使其至流体状态；
（3）准备免疫染色的药品，比如羊抗体、抗原标记物（Biotinimidazole）、Streptavidin-HRP（HorseradishPeroxidase）等。

（1）将冰冻切片浸入石蜡糊中进行热融化处理，处理完毕后将其放
置于待用；
（2）将冰冻切片放置在明净的工作台上，用70％乙醇清洗，然后放
入PBS小规模洗涤，然后用清洗液（清水）浇上，以去除表面的乙醇；
（3）将冰冻切片浸泡在去除组织胶多聚体液中，液体里溶解蛋白质
类多聚体，以防止抗体与冰冻切片上的组织胶多聚体结合；
（4）将冰冻切片放置在明净的工作台上，用于抗体的定量涂布，将
抗体与切片表面的抗原结合；
（5）在抗体涂布完毕后，将冰冻切片置于含有PBS溶液的室温下供
2小时以上，使抗体能够与冰冻切片上的抗原结合；
（6）将冰冻切片从室温溶液中取出，放入冰冻液中，将表面的多余
抗体冲洗掉；。

HE染色操作流程

HE染色操作流程HE染色（Hematoxylin and Eosin Staining）是一种常用的组织学染色方法，用于观察和诊断组织学切片。

HE染色通过染色剂HE染料的组合，使细胞核染成紫色，胞质染成粉红色，从而揭示组织的结构与形态。

HE染色的操作流程一般包括标本处理、脱水、透明化、分解蜡和染色五个步骤。

下面将详细介绍每个步骤的具体操作。

1.标本处理：首先，将切割好的组织标本放入10%中性缓冲福尔马林进行固定，一般固定时间为24-48小时。

固定后，将组织标本转移到70%乙醇中进行离子交换，使组织中的水分逐渐去除。

2.脱水：将固定的组织标本依次转移到浓度逐渐提高的乙醇溶液中，如80%乙醇、95%乙醇和绝对乙醇，每个乙醇浓度保持15-30分钟。

这个过程称为脱水，目的是逐渐去除组织中的水分，使组织内的乙醇浓度逐渐升高。

3.透明化：将脱水后的组织标本依次转移到透明剂中，如苯并三氮唑、次氯酸、二氯甲烷等。

每种透明剂浓度和时间要根据实验需求进行调整，这个步骤的目标是使组织中的乙醇慢慢溶解，透明度增强。

4.分解蜡：将透明后的组织标本转移到蜡纸中，加热到60-65°C的融点，使固定的组织标本逐渐融化。

蜡纸是由石蜡和植物油混合而成，有助于固定和保护组织的形态。

5.染色：将脱蜡的组织标本依次转移到碱性染料（如血红素）溶液中，染10-15分钟，然后洗净；接着将组织标本转移到酸性染料（如紫杉醇）溶液中，染5-10分钟，然后洗净。

紫杉醇染料使细胞核染色成紫色，血红素染料使细胞胞质染色成粉红色。

最后用安全过滤垫将组织标本封装在玻片上，去除水分，然后用覆盖玻片进行固定。

HE染色方法与步骤吐血整理

HE染色试剂配置A：0.5~1%的伊红酒精溶液：称取伊红Y0.5~1g，加少量蒸馏水溶解后，再滴加冰醋酸直至浆糊状。

以滤纸过滤，将滤渣在烘箱中烤干后，以95%酒精（即工业酒精，如果不怕浪费，用无水乙醇配制也可）100毫升溶解。

B：苏木素染液配方：(配制3000ml，可按比列减少)苏木精6g无水乙醇100ml硫酸铝钾150g蒸馏水2000ml碘酸钠1.2g冰醋酸120ml甘油900ml配制方法：将苏木素溶于无水乙醇，再将硫酸铝钾溶于蒸馏水，溶解后将甘油倾入一起混合，最后加入冰醋酸和碘酸钠。

C：1%盐酸酒精分化液：将1毫升浓盐酸加入99毫升70%酒精中即可。

染色流程(1)二甲苯（Ⅰ）15min(2)二甲苯（Ⅱ）15min（3）二甲苯：无水乙醇=1:12min(4)100%乙醇（Ⅰ）5min(5)100%乙醇（Ⅱ）5min(6)80%乙醇5min(7)蒸馏水5min(8)苏木精液染色5min(9)流水稍洗去苏木精液1-3s(10)1%盐酸乙醇1-3s(11)稍水洗10-30s(12)蒸馏水过洗1-2s(13)0.5%伊红液染色1-3min(14)蒸馏水稍洗1-2s(15)80%乙醇稍洗1-2s(16)95%乙醇（Ⅰ）2-3s(17)95%乙醇（Ⅱ）3-5s(18)无水乙醇5-10min(19)石炭酸二甲苯5-10min(20)二甲苯（Ⅰ）2min(21)二甲苯（Ⅱ）2min(22)二甲苯（Ⅲ）2min(23)中性树胶封固注：①第（11）、（12）步可省去，（13）步冲水时间需延长至20-30min。

②第（21）步如果不用石炭酸二甲苯，可改用无水乙醇。

*冷冻切片HE染色步骤：（1）冰冻切片固定10～30s（2）稍水洗1～2s（3）苏木精液染色（60℃）30～60s（4）流水洗去苏木精液5～10s（5）1%盐酸乙醇1～3s（6）稍水洗1～2s（7）促蓝液返蓝5～10s（8）流水冲洗15～30s（9）0.5%曙红液染色30～60s（10）蒸馏水稍洗1～2s（11）80%乙醇1～2s（12）95%乙醇1～2s（13）无水乙醇1～2s（14）石炭酸二甲苯2～3s（15）二甲苯（Ⅰ）2～3s（16）二甲苯（Ⅱ）2～3s（17）中性树胶封固。

冰冻切片的HE染色

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病理HE染色流程

病理HE染色流程HE染色流程主要分为固定、脱水、清理、浸透、染色、脱色、洗涤和封片几个步骤。

下面将详细介绍每个步骤的操作。

1.固定：将取得的组织标本放入含有10%中性缓冲福尔马林中固定。

固定过程中，福尔马林可与细胞内的蛋白质发生共价结合，固定细胞组织。

2.脱水：将已固定的组织标本放入连续浓度逐渐增高的乙醇溶液（通常为70%、85%和95%乙醇）中脱水，以去除组织中的水分。

每种乙醇中的时间一般为1-2小时。

3.清理：将乙醇脱水后的组织标本放入清理剂（如苯、半乳索甘和二甲苯等）中浸泡，以溶解并除去脂类物质。

清理的时间一般为2个小时。

4.浸透：将清理后的组织标本放入浸透剂（如苯乳、半乳索甘和二甲苯等）中浸泡。

浸透剂可与标本中的清理剂互溶，并在选择性的清理脂质的同时，逐渐溶解脱水的细胞质内部结构。

浸透的时间一般为2个小时。

5.染色：将浸透后的组织标本放入酸性染料和碱性染料的混合物中浸泡。

酸性染料主要染色细胞核，如黑苦味酸铁染料；碱性染料主要染色胞质，如伊红染料。

染色的时间一般为5-15分钟。

6.脱色：将染色后的组织标本放入脱色剂（如乙醇和苯）中浸泡，以去除多余的染色剂。

脱色的时间一般为1-2分钟。

7.洗涤：将脱色后的组织标本用水流洗涤，以除去余留在标本上的脱色剂和染色剂。

8.封片：将洗涤后的组织标本放入玻璃干拭片中，用透明石蜡和玻璃片封住，以保护标本并便于观察。

以上是病理HE染色的主要步骤和操作方法。

HE染色可以清晰地显示出细胞核和胞浆的形态结构，帮助病理学家对组织样本进行诊断和评估。

虽然HE染色流程简单，但操作时需要细心和耐心，以确保染色结果的准确性和可靠性。

石蜡包埋的组织切片或冰冻切片HE染色

抗原修复工作液：9ml A＋41ml B＋450ml 水，调Ph＝6.0＋－1PV9000 两步法免疫组织化学1．石蜡切片脱蜡至水（烤箱温度56度，30分钟）二甲苯5min × 3100％乙醇5min × 290％乙醇5min × 180％乙醇5min × 1双蒸水 5min × 2PBS 浸泡5min 。

或陈老师方法：二甲苯室温2次，20min/次；100％、90％、70％乙醇各5min；PBS 5min 2．抗原修复微波预热抗原修复液（工作液）至沸腾。

取预热预热抗原修复液浸泡切片于株型容器中，放入微波炉中，中火， 5～10min，有修复液损失后，补充预热抗原修复液，继续，持续到10min左右。

取出容器，于室温等到修复液自然冷却 20～30min。

3．3％过氧化氢室温孵育5～10min， PBS冲洗，2min ×3；3％过氧化氢室温孵育5～10min，PBS冲洗，2min ×3；血清封闭15～30min，PBS洗一次；4．滴加一抗工作液（1：100），37度2h，或4度过夜，PBS洗，2min ×3；5．滴加检测试剂，室温或37度孵育30～60min，PBS洗2MIN×3，接DAB显色约20min （室温，镜下观察），5．滴加试剂1，室温20min，PBS洗，2min ×36．滴加试剂2，室温20min，PBS洗，2min ×37．DAB显色5～20min，镜下观察，适时终止。

8．自来水洗，复染（苏木素，90s，自来水冲洗，15min），脱水，透明，封片。

复染；苏木素，室温 30s，自来水冲洗，15min（如需要可0.1%HCL分色，0.1%氨水/PBS返兰）脱水：70％乙醇，5min × 190％乙醇5min × 1100％乙醇5min × 2透明：二甲苯，10min× 2封片：中性树脂。

he染色方法及步骤

he染色方法及步骤HE 染色啊，这可是病理实验里常用的染色方法呢！它就像是给细胞和组织化了个美美的妆，让我们能更清楚地看清它们的模样。

首先呢，得准备好切片。

这切片就像是一张等待上色的画布。

然后把切片放进二甲苯里，让它好好泡个澡，把上面的脏东西都洗掉。

接下来就是染色的关键时刻啦！把切片放进苏木精溶液里，这苏木精就像是神奇的魔法药水，能把细胞核染得蓝蓝的，就像给细胞核戴上了一顶蓝色的小帽子。

染完之后，再用水冲洗一下，把多余的苏木精冲掉。

然后呢，把切片放进盐酸酒精里分化一下，让细胞核的颜色更加清晰、分明。

再用水冲洗干净。

这时候，该伊红上场啦！伊红就像是给细胞穿上了一件红色的外衣，让细胞质变得红红的。

把切片放进伊红溶液里泡一泡，然后再冲洗干净。

经过这么一番折腾，切片就像是化好了妆的美人，变得格外动人啦！你想想啊，这就好像是给细胞举办了一场盛大的化妆舞会。

细胞核穿着蓝色的礼服，细胞质穿着红色的裙子，在显微镜下翩翩起舞。

染完色后，还要把切片进行脱水、透明。

就像是给化好妆的美人再喷上一层定妆喷雾，让妆容更加持久。

最后呢，用中性树胶封片，把这美丽的画面永远地保存下来。

HE 染色方法虽然看起来步骤挺多，但只要我们认真细心地去做，就一定能染出漂亮的切片。

这就像是我们做一件事情，只要有耐心，肯下功夫，就一定能做好。

而且啊，HE 染色对于病理诊断来说可是非常重要的呢！医生们通过观察染色后的切片，就能判断出细胞有没有病变，病情严不严重。

所以说呀，HE 染色可真是个神奇的技术呢！它让我们能更深入地了解细胞的世界，为医学研究和临床诊断提供了重要的帮助。

你说，这是不是很厉害呢？。

HE染色的步骤及方法

HE染色的步骤及方法HE染色（hematoxylin and eosin staining）是一种广泛应用于组织学研究与临床病理学中的常规染色方法，用于显示组织和细胞的形态结构、特征和组织的组织学构造。

HE染色的主要步骤包括固定、脱水、透明、浸染、洗涤、脱色、洗涤、著色、酸洗、洗涤和封片等。

下面将详细介绍每个步骤的具体方法。

1.固定：将待染的组织标本放入含有4%至10%的缓冲醛（如10%的中性缓冲醛）中固定。

固定的时间一般为24至48小时，具体时间根据组织的大小和种类而定。

2.脱水：在固定后，将组织标本转移到带有不同浓度的乙醇溶液中进行脱水。

脱水的目的是逐渐将水分从组织中溶解掉，以便更好地进行后续处理。

常用的乙醇浓度为70%、80%、95%、绝对乙醇和绝对乙醇。

3.透明：将脱水的组织标本转移到透明剂中，如苯酚、甘油等。

透明的目的是去除残留的乙醇，并将标本与石蜡相容，以便进行后续处理。

4.浸染：将透明的组织标本转移到硬化的石蜡中，通过加热使其温度达到融点，使组织与石蜡充分浸透。

通常情况下，标本需要浸染多次以确保充分浸透。

5.洗涤：将浸染好的组织放入清洁的容器中，用去离子水或缓冲液轻轻洗涤，以去除未浸透的石蜡。

6. 脱色：将洗净的组织标本放入xylene或但醇溶液中进行脱色，以去除标本中的石蜡。

脱色时间视标本的大小和种类而定，通常为30分钟至1小时。

7.再洗：将脱色的组织标本用去离子水或缓冲液轻轻洗涤，以去除残留的脱色剂。

8. 著色：将洗净的组织标本置于染色剂中进行著色。

HE染色中，常用的染色剂为血红和嗜酸性染料安伊汀（Eosin）。

组织标本一般需在血红染色剂中浸泡2至5分钟，然后脱水，再在安伊汀染色剂中浸泡2至5分钟。

也可根据需要调整具体的染色时间。

9.酸洗：将著色好的组织标本用弱酸性缓冲液进行酸洗，以去除过量的染色剂。

酸洗时间一般为几秒钟至几分钟。

10.再次洗涤：将经酸洗的组织标本用去离子水或缓冲液轻轻洗涤，以去除残留的酸洗液。

HE染色步骤

常规HE染色步骤（1）二甲苯（Ⅰ）5-10 min(2) 二甲苯（Ⅱ）5-10 min(3) 95%乙醇（Ⅰ）1-3 min （4）95%乙醇（Ⅱ）1-3 min （5）80%乙醇 1 min （6）蒸馏水 1 min （7）苏木精液染色5-15 min(8 ) 流水稍洗去苏木精液1-3 s(9) 1%盐酸乙醇1-3 s(10) 稍水洗10-30 s(11)促蓝液返蓝10-30 s(12) 流水冲洗10-15 min （13）蒸馏水过洗1-2 s(14) 0.5%曙红液染色1-3 min(15) 蒸馏水稍洗1-2 s(16) 80%乙醇稍洗1-2 s(17) 95%乙醇（Ⅰ）3-5min(18) 95%乙醇（Ⅱ）3-5 min(19) 无水乙醇5-10 min(20) 无水乙醇5-10 min(21) 二甲苯（Ⅰ）3-5 min(22) 二甲苯（Ⅱ）2-5 min(23) 二甲苯（Ⅲ）3-5 min(24) 中性树胶封固结果：细胞浆红色，细胞核蓝紫色。

一、操作方法及步骤：①取材，未能固定的组织取材，不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整，最好为24×24×2mm。

②取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻。

小组织的应先取一支承器，滴上包埋剂让其冷冻，形成一个小台后，再放上细小组织，滴上包埋剂。

③将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。

④调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5～10um间。

二、冰冻切片时的注意事项：①防卷板及切片刀和持刀架上的板块应保持干净，需经常用毛笔挑除切片残余和用柔软的纸张擦。

有时需要每切完一张切片后就用纸擦一次。

因为这个地方是切片通过和附贴的地方，如果有残余的包埋剂粘于刀或板上，将会破坏甚至撕裂切片，便切片不能完整切出。

②多例多块组织同时需做冰冻切片时，可各自放于不同的支承器上，于冷冻台上冻起来，然后依据不同的编号，依序切片，这样做既不费时也不会乱。

HE染色方法与步骤吐血整理

HE染色试剂配置A：0.5~1%的伊红酒精溶液：称取伊红Y0.5~1g，加少量蒸馏水溶解后，再滴加冰醋酸直至浆糊状。

以滤纸过滤，将滤渣在烘箱中烤干后，以95%酒精（即工业酒精，如果不怕浪费，用无水乙醇配制也可）100毫升溶解。

B：苏木素染液配方：(配制3000ml，可按比列减少)苏木精6g无水乙醇100ml硫酸铝钾150g蒸馏水2000ml碘酸钠1.2g冰醋酸120ml甘油900ml配制方法：将苏木素溶于无水乙醇，再将硫酸铝钾溶于蒸馏水，溶解后将甘油倾入一起混合，最后加入冰醋酸和碘酸钠。

C：1%盐酸酒精分化液：将1毫升浓盐酸加入99毫升70%酒精中即可。

染色流程(1)二甲苯（Ⅰ）15min(2)二甲苯（Ⅱ）15min（3）二甲苯：无水乙醇=1:12min(4)100%乙醇（Ⅰ）5min(5)100%乙醇（Ⅱ）5min(6)80%乙醇5min(7)蒸馏水5min(8)苏木精液染色5min(9)流水稍洗去苏木精液1-3s(10)1%盐酸乙醇1-3s(11)稍水洗10-30s(12)蒸馏水过洗1-2s(13)0.5%伊红液染色1-3min(14)蒸馏水稍洗1-2s(15)80%乙醇稍洗1-2s(16)95%乙醇（Ⅰ）2-3s(17)95%乙醇（Ⅱ）3-5s(18)无水乙醇5-10min(19)石炭酸二甲苯5-10min(20)二甲苯（Ⅰ）2min(21)二甲苯（Ⅱ）2min(22)二甲苯（Ⅲ）2min(23)中性树胶封固注：①第（11）、（12）步可省去，（13）步冲水时间需延长至20-30min。

②第（21）步如果不用石炭酸二甲苯，可改用无水乙醇。

*冷冻切片HE染色步骤：（1）冰冻切片固定10～30s（2）稍水洗1～2s（3）苏木精液染色（60℃）30～60s（4）流水洗去苏木精液5～10s（5）1%盐酸乙醇1～3s（6）稍水洗1～2s（7）促蓝液返蓝5～10s（8）流水冲洗15～30s（9）0.5%曙红液染色30～60s（10）蒸馏水稍洗1～2s（11）80%乙醇1～2s（12）95%乙醇1～2s（13）无水乙醇1～2s（14）石炭酸二甲苯2～3s（15）二甲苯（Ⅰ）2～3s（16）二甲苯（Ⅱ）2～3s（17）中性树胶封固。

冰冻切片免疫荧光染色步骤

冰冻切片免疫荧光染色步骤
冰冻切片免疫荧光染色步骤：
(1)冰冻切片取出，室
温放置使其干燥后，用冷丙酮于4C固定10分钟。

( 2)切片用
0.01MPBS清洗后加入
1.2%双氧水作用30 分钟，以除去非特异染色。

( 3)
0.01M PBS清洗，3次X1分钟。

( 4)
0.3%Triton X-100作用30 分钟。

(5)加入以抗体稀释液(含1%BSA勺
0.01M PBS，pH
7.4)稀释至工作浓度的一抗，4C过夜。

( 6)
0.01M PBS清洗，3次X1分钟。

(7)加入荧光抗体TRITC-lgG( 1: 100)或FITC-lgG( 1: 100),室温孵育2 小时。

( 8)
0.01M PBS清洗，3次X1分钟。

( 9)缓冲甘油封片，荧光xx 下观察。

对照组:
采用空白对照:
除用
0.01MK PBS代替一抗外，其余程序与实验组相同载玻片处理步骤：（1 ）硫酸浸泡过夜。

（2）自来水冲洗干净后双蒸水冲洗3 遍。

（3）晾干后在
0.1%明胶中快速浸泡后取出。

室温晾干或37 C烤干备用。