冰冻切片制作与染色过程中常见问题与处理
冰冻切片制作与染色过程中常见问题与处理
• 切片判读正确-反映真实的科学现象
• 知识结构背景
• 组织学结构的熟悉…… • 认识病理改变：炎细胞侵润、坏死、水肿、蛋白变性、纤维化、增 生、凋亡…… • 审美观、拍照角度、视野、曝光时间、对比度……
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– 常规HE染色 – 特殊染色
• 如：Masson(Thichrome staining)，油红O，尼氏染色， 台盼蓝（肥大细胞）染色
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(1) 所有切片呈阴性
1）染色未完全严格按照操作步骤进行 2）漏加一种抗体，或抗体失活 3）缓冲液内含叠氮化钠，抑制了酶的活性 4）底物中所加H2O2 量少或失活 5）复染或脱水剂使用不当
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（2）所有切片呈阳性反应，其原因：
①切片在染色过程中抗体过浓，或干片了。 ②缓冲液PH值不准确，洗涤不彻底。 ③使用已变色的显色底物溶液，或显色反 应时间过长。 ④抗体温育的时间过长。
Con. TNBS LY ZD7288
2014.4.20 TRPV1+CGRP
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L1 DRG
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ห้องสมุดไป่ตู้
4. 染色：抗体孵育和选择: 免疫组化最关 键环节
试剂公司提供标准化的试剂
• 组织固定时
– 固定液要有足够的量(固定液是组织体积的8-10倍) – 保持一定时间，快速灌注固定后，相同的固定剂再固定 2-4h（ 4℃冰箱）
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减少冰晶的形成
• 公认：未经固定的组织切片冰晶较多 • 固定后的组织切片仍然会有一定的冰晶， 为防止冰晶的形成 • 采取如下方法
冷冻切片常见问题与解决方法
冷冻切片常见问题与解决方法叶敏;刘尽国;赵兰香;张杰【期刊名称】《临床与实验病理学杂志》【年(卷),期】2013(029)009【总页数】2页(P1030-1031)【关键词】冷冻切片;取材;包埋;发白;染色【作者】叶敏;刘尽国;赵兰香;张杰【作者单位】上海市胸科医院病理科,200030;上海市胸科医院病理科,200030;上海市胸科医院病理科,200030;上海市胸科医院病理科,200030【正文语种】中文【中图分类】R361.2术中冷冻切片是目前临床病理检查中最常用的快速制片方法之一。
其是在低温下将新鲜组织冷冻至一定硬度，然后再进行切片的制片方法。
由于低温时组织细胞会损伤、组织细胞着色力差及短时间内快速出片等因素的影响，制片过程中常会出现空洞和冰晶、组织细胞变形和皱缩、切片染色背景不清晰、颜色对比不协调、发白等问题。
现将上述问题及处理方法讨论如下。
1 常见问题与解决方法［1］1.1 冷冻切片出现空洞和冰晶现象(图1) (1)原因:组织内有过多水分，脱水不过关、取材时遇到水，冷冻时间过长，组织冷冻的温度过低。
(2)对策:①取材大小、厚薄要适宜，过大、过厚影响冷冻速度。
②新鲜组织应避免遇水，取材器械干燥洁净，若组织本身带水或血较多，用滤纸把水或血吸干。
取材后需用合成胶水或OCT 作组织块包埋剂，进行包埋。
合成胶水和OCT 均具有黏稠性和渗透性，能将组织牢固地固定在冷冻头上。
③冷冻时间要短，只有速冻才能减少组织内冰晶的形成，最好将速冻头压在组织上，冻好后便可切片，对容易形成冰晶的肌肉、脑组织应采取干冰或液态氮冷冻，以减少冰晶形成。
④以冷冻切片机设置的温度(冷冻头OT 为－25 ℃，CT 为－20 ℃)为宜。
温度太低，组织容易变脆、变硬，切片易出现空洞现象。
1.2 组织破碎或形成空洞现象(图2) (1)原因:组织冷冻时间过长;组织比较硬、脆。
(2)对策:可用手贴在组织上或用嘴向组织哈气稍加温使其软化即可切出完整的切片。
冷冻切片常见问题分析与预防
冷冻切片常见问题分析与预防骆新兰收稿日期:1998 03 30作者单位:广东省人民医院病理科,广州 510080作者简介:骆新兰,男,30岁,技师冷冻切片是借助低温使组织冻结达到一定的硬度进行切片的一种方法。
它是术中诊断的一种重要方法。
但由于各种原因,影响冷冻切片的质量,拖延病理报告发出的时间,直接影响着病理诊断的及时性、准确性,间接影响着病人的预后。
归结起来有以下几方面。
1 切片不全或不能切片切片不全是指切出的切片组织切面不完整、有缺损现象;不能切片是指组织块的温度过高或过低不能制作一张完整的切片。
切片不全直接影响着冷冻报告切片的准确性。
导致切片不全或不能切片的常见的原因有几下几方面。
1 1 组织内含过多的脂肪或坏死组织 脂肪或坏死组织较一般的组织冷冻的温度要低些,当活组织达到所需的温度时,其还比较软,从而影响切片的完整性和拖延冷冻报告发出的时间。
1 2 组织块过冷 组织冷冻过度易致切片破碎或呈粉沫状,不能制作一张完整的切片。
1 3 组织块冷冻不均匀 在配合使用液氮时,组织块放入液氮时不能保持水平状态且液氮量不足的情况下,可产生此现象。
1 4 冻头的温度不足 冷冻切片时要求冻头的温度保持在-25 ~-30 左右,冻头的温度达不到要求时,组织很快回软,也不能保证切片的完整。
1 5 组织块过大 预防与处理: 注意组织的性质。
冷冻切片的组织除了要保持新鲜外,还应注意避免组织内含过多的脂肪(脂肪组织除外)及坏死组织。
!组织大小要适中。
冷冻切片机内切片刀移动的范围有一定的限制,超出其范围时,易致切片不全。
一般情况下,冷冻切片的组织块大小1cm ∀1cm ∀0 3cm,但卵巢肿瘤及脂肪组织可稍为大些。
另外,包埋时,应将组织平放在冻头的中央。
#掌握好冷冻时间。
根据组织块的大小、性质,确定冷冻时间,一般13~17s(使用液氮者),若组织较大或脂肪组织时间可适当长些,而甲状腺、脑组织和淋巴结等冷冻的时间相对要短些。
术中冷冻切片的规范化操作及常见问题分析
术中冷冻切片的规范化操作及常见问题分析摘要】目的：优化冰冻切片技术，提高术中病理诊断的准确率。
方法：收集2014～2015年期间本院病理科冰冻切片2000余例，重新阅片，分析讨论发现的问题及原因。
结果：不规范的冰冻切片操作严重影响冰冻切片。
结论：规范化操作可以提高病理诊断的科学性、可靠性。
【关键词】冰冻切片；规范化操作；病理诊断【中图分类号】R636 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2016）06-0205-02术中冷冻切片是目前病理科最为常用的快速制片方法之一，它是借助低温冷冻将手术切除标本的组织块快速冷冻达到一定硬度进行切片的一种方法[1]。
高质量的冷冻切片对于确保术中病理诊断的科学性、可靠性具有极其重要的作用，从而有效降低术中病理诊断的风险。
1.材料与方法1.1 取材送检标本要及时、新鲜，不能沾水和放入固定液，特别是脑组织避免用生理盐水纱布包裹。
取材时尽量避开组织坏死出血区，剔除不必要的脂肪组织、毛发及钙化物等。
细小组织全取材，大组织的取材大小在1.5cm×1.5cm×0.2cm，以厚度不超过0.3cm为宜。
1.2 包埋包埋冻头使用后应用纸巾擦干净后放在冷冻切片机的冷冻台上预冷。
根据组织的特性及医生要求来确定包埋方向，囊壁组织可卷曲成团，皮肤和管腔样组织应立埋。
包埋剂应适量，大块组织可直接放置于滴加包埋剂的组织托上，再用冷冻锤压在组织块上，使其上下一起迅速制冷，既缩短冷冻的时间，又使组织块十分平整，利于切片。
小组织（如穿刺、切缘等组织）包埋时应先滴加少许包埋剂在组织托上，等包埋剂渐渐发白，再将小组织放在组织托上，再用冷冻锤压，避免应切片不完整而导致病理漏诊。
1.3 切片包埋后组织的冷冻是整个冷冻切片十分关键的步骤之一，冷冻的好坏直接影响到切片的质量。
在实践中，我们总结了不同组织的最佳冷冻温度（表1）。
冻好的组织块应先进行粗修，暴露组织的最大面后再进行切片，切片时用力均匀。
冰冻切片各流程常用方法
冰冻切片各流程常用方法下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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冷冻切片常遇到的问题及解决对策
3 冻切片机工作室温度的设置 根据器官组织形态结构和 组成成分的 不同, 切片时 要相应 调 整切片机工作室温度, 我们在进行冷 冻切片 时得到 的经验 见 表 1:
表 1 没有固定的冰冻组织适合切片的温度如下
组织
标本的切片温度
脑 肝 淋巴结 肾 脾 肌肉 甲状腺 皮肤 乳腺 含脂肪乳腺 脂肪组织
- 12 - 14 - 14 - 16 - 16 - 20 - 20 - 25 - 25 - 30 - 30以下
组织冷冻切片 是借 助低 温使组 织达 到一 定的 硬度 然后 收稿日期: 2006- 04- 10
进行切片的一 种技 术方法 [ 1]。因 其制 作过 程较 传统 的石 蜡 切片相对简便、快捷, 不需经过 固定、包埋和 切片后 温箱中 烤 干处理等实验步骤, 且能很好地保存 组织抗 原和酶 的活性 而
另外, 在切片前 修整 冷 冻组 织块 最容 易损 伤刀 刃, 最好 在急冻组织块稍冻硬以后立刻修 整, 以 减少冻 硬的包 埋剂对 刀刃的损害。组织 块冷冻 时可 根据 组织 块大 小加 入适 量的 包埋剂, 我们 用市售液 体胶 水替 代进 口包 埋剂, 切 片效 果良 好, 且经济简 便。切片后 组 织要 进行 及时 固定, 固 定的 作用 在于使蛋白变性、凝固 、沉淀, 终止或 抑制酶 活性, 保持细 胞、 组织原有的形态结构和抗原性, 此外固 定还兼 有硬化 和媒染 组织切片的效果。对于不同的组 织和抗 原成分的 组织切 片, 需选择合适的固 定剂 及适宜 的温 度和 时间。 蛋白 类抗 原用 丙酮固定, 多 糖类抗原用乙醇固定效 果比较好 [ 6] 。切 片一般 在 4 固定液 5分 钟左右。
2 切片机的温度调试 高质 量 的冷 冻切 片 机一 般有 三 个设 置温 度, 工 作 室温
冰冻切片制作与染色过程中常见问题与处理课件
详细描述
为确保组织固定时间与温度的准确控制，应 遵循以下建议：首先，根据组织类型和大小，
选择合适的固定液和浓度，并确保固定液的 新鲜性；其次，根据固定液的特性，严格控 制固定时间和温度，避免固定过度或不足； 最后，在固定过程中，保持组织的湿润和通
透性，以便更好地渗透固定液。
调整切片温度及厚度
要点一
该技术利用组织在冷冻状态下形成的硬度和脆性，使用锋利的刀片将其切割成薄 片。
冰冻切片技术的应用范围
冰冻切片技术主要应用于病理学诊断，尤其是对肿瘤、炎症 和其他疾病的快速诊断。
此外，冰冻切片技术也常用于科研，例如对组织结构和细胞 功能的研究。
冰冻切片的制备流程
冰冻切片的制备流程包括组织固定、包 埋、切片、染色等步骤。
详细描述
为防止切片脱落，可以尝试调整冰冻切片机 的工作温度和切片厚度，并选择合适的染色 液浓度。在制作过程中，可以尝试增加固定 时间或使用更粘稠的包埋剂来增强切片的稳 定性。
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冰冻切片制作与染色技术 优化建议
严格控制组织固定时间与温度
总结词
组织固定是冰冻切片制作过程中的关键环节， 对切片质量和染色效果有重要影响。
总结词
切片温度和厚度的调整对切片质量和染色效果具有重 要影响。
要点二
详细描述
在冰冻切片制作过程中，应根据组织类型和实验需求， 选择合适的切片机和切片刀，并调整切片温度和厚度。 一般来说，较薄的切片更容易染色和观察，但过薄的 切片可能会导致组织结构破坏和细胞丢失。同时，应 根据染液特性，选择合适的染色时间和温度，以确保 染色效果。
使用新鲜染液并定期更换
总结词
使用新鲜染液并定期更换可以确保染色结果的准确性和 可靠性。
冷冻切片方法及注意事项
一、实验前准备清理实验台及仪器。
开启冷冻切片机并将冷冻切片机预降至所需温度（- 15~-20 ℃*）。
准备好处理好的载玻片、刀片、胶水以及药品。
二、取材解剖之后迅速取出所需的新鲜组织，用干纱布或滤纸擦干后不需固定直接取材（24×24×2mm*）,以防形成冰晶造成切片中形成形状不一的空泡,使细胞内结构移位。
（注：取材中目的标本既要明确也要确保其结构的完整性，应避免不必要的脂肪及坏死组织附着;要尽量剔除毛发、硬骨或钙化物;保乳手术切缘由于脂肪组织较多,取材厚度最好不要超过3mm，厚者冰冻费时，大者难以切完整。
甲状腺及淋巴结组织要带全组织被膜并除去多余的脂肪组织。
）三、冷冻切片1、取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上冰冻，用吸热器压住组织，至包埋剂与组织冻结成白色冰体即可切片（1~3分种）。
2、将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。
3、调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5～10μm间。
4、调好防卷板。
制作冰冻切片，关键在于防卷板的调节上，这就要求操作者要细心，准确地将其调较好，调校至适当的位置。
切片时，以切出完整、平滑的切片为准。
切好的组织在干净的玻片上黏附时顺着一个方向稍微用力轻轻一带,可避免组织摊片过程中皱折,保证组织结构的完整及切片的美观。
注：①包埋剂的选用：包埋剂是对冷冻切片质量一重要影响因素，包埋剂用量要适宜，过多或过少都会影响标本冷冻质量。
常用的有三种包埋剂OCT剂、B超藕合剂以及普通胶水。
B超藕合剂适用于细胞丰富质地较嫩的组织,普通胶水或OCT剂适用于纤维丰富质地偏硬组织。
（OCT包埋剂骤冷时固化，其冷冻速度和软硬韧度与组织相近，其还具有水溶性，不影响染色等优点。
）②组织块过小：先将少量胶挤在托架上预先放在冰冻机中冷冻,约30秒钟左右待胶凝固时将小组织放上,组织周围再加一些胶,再次置于冷冻机中冷冻,这样组织被垫高,就能快速切出高质量的切片。
常规冰冻制片常见问题分析 ppt课件
每台冰冻切片机都有 一个速冻台，好的冰 冻切片机可以在几分 钟内将速冻台的温度 下 降 至 -50℃ ～ -60℃ 度之间。
冷冻锤从上面压在组 织上，可以使组织上 下两面同时冷冻
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一台冰冻切片机有多个冷冻锤
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6、液氮和急冻剂
使用液氮和急冻 剂来快速冷冻组织
7、专用冷冻机
• 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭 • “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我
笨，没有学问无颜见爹娘 ……”
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
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一、冰冻切片制片中冰晶的问题
冰晶的产生：当组织缓慢冷冻时，组织间隙的 水份凝固形成的，这时由于电解质析出，渗透压 升高，细胞内的水分子渗透到细胞外，使组织间 隙的冰晶变得更大，挤压周围组织，使组织细胞 的形态发生明显的改变，严重影响病理诊断。
1、正确选择染色试剂苏木素、伊红的配方 2、注意染色过程中的细节问题
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1、苏木素、伊红配方的选择
（1）改良Gill苏木素液：
苏木2.5克溶于乙二醇250ml中。硫酸铝铵17.6克溶于蒸馏水 730ml,以上二液充分溶调后混合，加碘酸钠0.2克，使用前加 冰醋酸20ml.
（2）酸化沉淀伊红液 贮 备 液 ： 伊 红 20 克 ， 蒸 馏 水 500ml, 经 充 分 溶 解 后 加 浓 盐 酸
5、购置专用冷冻机、急冻剂、专用液氮灌
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二、常规与冰冻制片中常见问题
切片染色的问题
冰冻切片免疫组化染色步骤
冰冻切片免疫组化染色步骤引言冰冻切片免疫组化染色是一种常用的实验方法，用于研究细胞和组织的分子表达。
它结合了冷冻样本的切片技术和免疫组织化学染色的原理，能够可视化特定分子在组织中的位置，从而帮助我们理解生物过程和疾病机制。
本文将介绍冰冻切片免疫组化染色的步骤和注意事项。
步骤一：样本制备1.收集组织样本，根据需要进行切割和处理。
2.快速冷冻组织样本，可用液氮或乙醚等方法冷冻，并保存在低温环境中。
步骤二：切片制备1.取出冷冻样本，将其置于切片机或切片冷冻器中。
2.进行组织切片，通常厚度为5-10微米，利用切片刀或者切片冷冻器的微调装置。
3.将切片收集在清洁的载玻片上，可以使用专门的载玻片来增强切片与载玻片间的附着力。
步骤三：固定和脱水1.将载玻片上的切片放入4%的中性缓冲福尔马林缓冲液中固定细胞和蛋白质。
2.固定15-30分钟后，用PBS或其他缓冲溶液洗涤切片，将福尔马林去除。
3.将切片脱水，使用逐渐浓度的乙醇和脱水溶液，如70%乙醇、95%乙醇和100%乙醇。
步骤四：抗原修复1.对于有些抗原，如细胞核抗原，需要进行抗原修复。
这可以通过热、酸或酶消化等方法进行。
2.一种常用的抗原修复方法是将切片置于高温或高压下进行热诱导抗原修复。
步骤五：阻断和孵育1.使用蛋白质阻断剂，如牛血清蛋白、BSA等，在切片上进行孵育，以防止非特异性结合。
2.孵育时间通常为30分钟至1小时。
步骤六：一抗孵育1.加入一抗，即特异性抗体，与切片上的靶分子结合。
2.一抗浓度和孵育时间根据实验需要和抗体质量进行优化。
步骤七：洗涤1.使用PBS或其他缓冲溶液洗涤切片，将未结合的一抗去除。
2.洗涤时间和次数根据实验要求和抗体特性进行优化。
步骤八：二抗孵育1.加入荧光标记的二抗，与一抗结合形成复合物。
2.二抗可以识别一抗的种类，常见的二抗有荧光标记的抗鼠IgG、抗兔IgG等。
步骤九：洗涤1.使用PBS或其他缓冲溶液洗涤切片，将未结合的二抗去除。
冰冻切片中常见问题分析
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6、切片皱缩或卷缩：
这也是影响切片质量的重要因素之一。常见的原因有：① 刀锋变钝。② 防卷板粘有异物，防卷板的作用是防止切 片卷缩，但若粘有异物，切片时组织会被挤压而缩在一起。 ③ 防卷板与刀锋的位置不平行、不协调。④ 组织块包埋 不完全，缺乏支撑作用。 预防与处理的方法：① 注意检查刀具，及时更换刀口， 定期磨刀。② 保持防卷板的清洁，每做一例冷冻切片， 均应将刀口及防卷板拭擦干净，防止切片的污染和切片皱 缩。③ 调整刀、防卷板的位置，保证两者平行，且防卷 板比刀锋前0.2㎜左右。④ 包埋组织应完全，没法切片者 再滴加包埋胶。
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4、染色对制片的影响：
尤以细胞核的染色最为关键，在寒冷的冬季，室温过低时， 影响核的着色，可适当加温，用以增色，苏木素的酸碱度 应适宜，经常观察其染液的ph值，过碱时应及时更换，盐 酸酒精分化适度，时间控制到位，否则易造成核着色不佳， 染色质不清晰，影响诊断的准确性。
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冰冻切片中 常见问题分析
临安人民医院
1、组织取材对制片的影响
组织取材大小：组织块大小要适宜，冷冻切片机 内切片刀移动的范围有一定的限制，超出其范围 时，易致切片不全。一般情况下，冰冻切片的组 织大小为1.5×1.5㎝,厚2㎜。但卵巢肿瘤及脂肪组 织可稍微大些。组织块过大，切片时阻力过大， 易产生皱折，刀痕，组织易崩碎，增加制片难度， 影响诊断。如需在同一标本托上放大于两块组织 时，应尽量冻成一个平面，与刀锋平齐，以防切 片不完整，发生漏诊。若送检组织过小，请预先 速冻一冷台面，再行包埋，利于制片。另外，包 埋时，应将组织平放在冻头的中央。
5、冰晶的形成对制片的影响：
此原因主要取决于组织含水量的大小，尤以组织细胞水肿， 淋巴结，纵隔肿瘤，卵巢肿瘤为甚，送检取材过程中接触 水源，速冻过程中使用的液氮时间尚未控制好，同是造成 冰晶形成的原因，其解决方法为，使用液氮时间上控制到 位，保证一次冻透标本，组织送检取材时，尽量避开水源， 如遇含水量高的标本时，应尽量用干纱布吸干水分后再行 冷冻，避免由于冰晶形成出现诊断上的失误。操作者的动 作应迅速。
浅析冷冻切片常见的质量问题及处理方法
大密度投影（ Ｍ Ｉ Ｐ ） 图像上 画线 ， 重组 出单体素的曲面图像 。 曲面
重组的优点是可 以将弯 曲的肋 骨重组在一个断面 图像显示 ， 不 受周围组织的干扰［ ４ １ 。Ｖ Ｒ利用了容积 内的全部信息 ， 将扫描容 积 内投影线通过容积数据 的全 部像 素总投影 ， 以不 同灰 阶显示
浅 析冷 冻切 片 常见 的质 量 问题 及 处 理 方 法
杨 国霞
（ 中信机电制造公司总医院 ， 山西 运城 ０ ４ ３ ８ ０ １ ）
冷冻切 片是 指借助低温 条件对 尚未 固定 的手术切 除标本
组织块 快速冷冻 ， 达到一定 的硬度 之后 ， 进行切 片 的一 种制片
织块过大或偏位等 四种状况。
【 ３ ］ 姚 以刚． ６ ４ 层容积 ｃ Ｔ 对肋 骨骨折 的诊断价值 们． 中国 ｃ Ｔ和 Ｍ Ｒ Ｉ
杂志 ， ２ ０ ０ ９， ７ （ ４ ） ： ３ ９ — ４ １ ．
组３ ２ 例， 发现不完全 Ｉ 生骨折 ５ 处、 无移位的完全型骨折 ４处。 总之 。 ｌ ６层螺 旋 Ｃ Ｔ对肋 骨骨折 的诊 断价值 明显优 于 Ｄ Ｒ 胸片， 图像后处理发挥 了其优越性 。其 中 Ｖ Ｒ图像直观 ， 近似解 剖位置 ， 对肋骨 骨折 的位 置 、 数量 和移位 情况显示清楚 ， 但 对微 细骨折确诊需结合原始 薄层图像及 Ｃ Ｐ Ｒ重建 图像 ， 可检 出 Ｄ Ｒ 平片不易发现的骨折 ， 确 定骨折的部位 、 范围 、 类 型及 与周围组
参考文献
结构 ， 但Ｖ Ｒ图像对 肋骨骨皮质微 细裂 折不能确诊 。曲面重组
成像在显示肋骨骨质内在结构及微细骨皮质裂折方面有独特价 值目 ， 可多次重复重组 图像 ， 直至骨 折线显示最佳 。本组病例 均 行冠状位 和矢状位平 面重组 ， 再行 Ｖ Ｒ重组 ， 作出基本诊 断 ； 对
常规冰冻制片常见问题分析 ppt课件
脱蜡试剂的问题
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怎样使 切片染色更漂亮
1、正确选择染色试剂苏木素、伊红的配方 2、注意染色过程中的细节问题
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1、苏木素、伊红配方的选择
（1）改良Gill苏木素液： 苏木2.5克溶于乙二醇250ml中。硫酸铝铵17.6克溶于蒸馏水
730ml,以上二液充分溶调后混合，加碘酸钠0.2克，使用前加 冰醋酸20ml. （2）酸化沉淀伊红液 贮 备 液 ： 伊 红 20 克 ， 蒸 馏 水 500ml, 经 充 分 溶 解 后 加 浓 盐 酸
废液倒掉后，试剂瓶要清洗干净并且擦干。 更换试剂后要预先试染一批切片。 更换试剂时要注意不要弄错试剂摆放的顺序。 由于天气的原因，试剂容易挥发，要及时添加或更换。
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细节决定成败
在常规和冰冻切片制片过程中，切片染 色也是 比较重要的一个环节，如果这个环节没做好，也一 样地影响病理诊断，所以，我们在实际工作中除了 注重常规的组织标本的前期处理、冰冻切片的速冻 方法外，我们还要正确选择染色液的配方，并且在 染色过程中把每一个细节都做得很好，我们的切片 质量肯定会好的。
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2、 取材不能太大、太厚
组织块的大小、厚 薄决定了冷冻的速度， 太大、太厚的组织由 于冷冻时间长，难免 有冰晶的产生。所以， 取材组织块小于 1.5*1.5*0.3cm。
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取材3mm 厚
取材4mm厚
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3、使用吸水纸 可以吸干组织表面的水分
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4、样本托和打底胶预冷
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打底胶预冷
常规及冰冻切片制片中常见的 问题分析及解决方法
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常规、冰冻制片常见问题及对策
冰晶的问题----冰冻切片制片时如何减少冰晶 染色的问题----怎样使切片染色更漂亮 标本切开与固定----如何做好标本的切开与固
冰冻切片制作及质量控制
冰冻切片制作及质量控制冰冻切片是一种在生物组织学研究中广泛应用的技术，它可以制备出细胞和组织的高质量切片，用于后续的染色、免疫组化和显微镜观察等研究。
为了获得高质量的冰冻切片，制作过程中需要严格控制各个环节，包括样本取材、固定、冻结和切片等步骤。
同时，质量控制也是制作高质量冰冻切片的重要环节之一、下面将详细介绍冰冻切片制作及质量控制的相关内容。
1.样本取材样本取材是制作高质量冰冻切片的第一步，样本的选择和处理对后续切片的质量有重要影响。
通常情况下，应选择代表性的组织，样本必须新鲜，不宜暴露在空气中过长时间，以避免氧化和细胞坏死的发生。
此外，为了使切片更容易涂抹和切割，样本应具有一定的硬度，可以根据需要使用组织固定剂、切片缓冲液等进行处理。
2.组织固定组织固定是为了保持组织的形态结构和细胞的生物学特性，同时防止样本在切片过程中的损伤和变形。
常用的固定方法包括冷醇固定、中性缓冲福尔马林固定等。
固定时间和温度的选择需要根据不同的样本和研究要求进行优化。
3.冻结冻结是制作冰冻切片的关键步骤，它能够快速、有效地固定组织并保持组织的形态。
冻结样本时应使用冷冻剂，如液氮、干冰-酒精混合物等。
在冻结过程中，要避免组织在冻结过程中受到机械或化学损伤，因此可以使用特制的冷冻模具和刀片。
4.切片5.质量控制质量控制是确保冰冻切片质量的关键环节之一、常用的质量控制指标有切片厚度、切片完整性、目标细胞或结构的保存等。
切片厚度的一致性对于后续的显微镜观察和数据分析具有重要影响，可以使用显微镜或数字软件测量切片厚度。
切片完整性是指组织切片的连续性和无碎片断裂等情况，可以通过显微镜观察和染色评估。
目标细胞或结构的保存是评价冰冻切片质量的重要指标，可以通过免疫组化染色、细胞核染色等方法进行评估。
综上所述，制作高质量的冰冻切片需要控制好样本取材、组织固定、冻结和切片等环节，并通过质量控制手段来评估切片质量。
只有在每个环节都进行精细操作和严格控制的情况下，才能制备出适合后续研究的高质量冰冻切片。
冰冻切片制作方法与注意事项
冰冻切片制作方法与注意事项一、固定：固定即借助化学试剂是组织和细胞中的有机和无机成分凝固或沉淀，停止发生死后组织变化，尽量保持其活体状态的过程。
固定的方法有浸泡固定法，注射、灌注固定法，蒸汽固定法，本实验用的是注射、关注固定法：某些组织块由于体积过大或固定液极难流入内部或需要对整个脏器或整个动物进行固定，就可采用灌注或灌流固定法。
固定时将固定液直接注入动物的血管，经血管分支到达整个组织或全身，从二十只得到充分固定。
固定液分为单纯固定液和混合固定液。
单纯固定液有甲醛、乙醇、氯化汞、醋酸、苦味酸等，混合固定液包括Bouin液、Zenker液、Carnoy液、中性甲醛液等。
本实验用的固定液为4%甲醛（10%福尔马林）。
固定后的处理：用水配制的固定液固定后应用流水冲洗，可是组织中的固定液随时溢出和随时洗去。
对小动物和脑组织等，应以浸泡为主，即能达到冲洗的目的，又不损害组织。
【注意事项】1.固定要及时。
2.组织块的大小要合适。
3.应有足够的固定液，一般与组织块的比例为20:1，容器勿过小，组织勿过多。
4.固定时间要合适，甲醛固定液一般固定两天左右，第一天要更换一次固定液。
5.要进行促使固定，在固定期间轻轻地搅动组织或摇动容器使组织移动有利于固定液的渗透，适当提高温度也可缩短固定时间。
6.选择合适的固定液。
7.一次取材数量过多时，应对取材部位和顺序进行编号，并及时做好记录。
二、脱水脱水就是用某些溶剂逐步将组织块内的水分置换出来的过程，使用的试剂称为脱水剂。
脱水剂有非石蜡溶剂的脱水剂如乙醇、丙酮等，和脱水兼石蜡的脱水剂如正丁醇等。
本实验所用的是乙醇脱水。
乙醇是最常用的脱水剂，其优点是脱水能力强，即能与水相混合，又能与透明剂相混，并可使组织硬化，便于切片。
缺点是穿透组织的速度快，且容易使组织收缩、变脆。
为克服这一缺点，在一般脱水中，应采用循序渐进的方法，逐步升级，经一系列不同浓度的乙醇，使组织中的水分逐渐被乙醇代替。
冰冻切片技术经验总结
冰冻切片技术经验总结冰冻切片技术是一种常用于生物学研究中的技术方法，通过将生物样本或细胞固定后进行冰冻处理，并利用切片机将样本切成非常薄的薄片，从而便于观察细胞结构和组织构成等。
以下是我对冰冻切片技术的经验总结，包括样本处理、切片技巧、切片后的处理等方面。
首先，在进行冰冻切片之前，样本的处理非常重要。
首先需要选择合适的组织或细胞样本，确保其新鲜和活性，并尽量避免器官或细胞的变性和破坏。
此外，为了避免切片过程中的冷冻伤害，样本需要进行预处理。
如利用缓冲液进行洗涤、固定和去除不需要的化合物；或者使用免疫金或染色技术标记所需的组分，以便更好地观察和分析。
因此，在进行冰冻切片之前，样本处理的质量和细致程度对最终结果的影响极大，应仔细操作。
其次，切片技巧也至关重要。
冰冻切片需要使用专用的切片机械设备，该设备可以在极低的温度下将样本切割成非常薄的切片。
在进行切片操作之前，需要调整和准备切片机的各项参数，例如切片速度、角度和切片厚度等等。
合理地设置这些参数可以保证薄片的质量，减少切削过程中的机械创伤和拉伸现象，从而更好地保留细胞和组织的结构。
此外，还需要掌握适当的刀片冷却和切片角度的操作技巧，以避免切片时产生的静电和其他意外。
再次，在进行冰冻切片之后，需要进行相应的处理。
一般来说，在切片结果中，细胞和组织可能会出现不同程度的变形和染色偏移等问题。
因此，需要进行以下处理步骤来提高切片结果的质量。
首先，可以使用染色剂（如溴化乙锭）进行染色，以增加切片的对比度和可视性。
染色后，切片需要用缓冲液进行冲洗以去除多余染料。
然后，可以使用透明剂（如苯基醚、苯酚和聚丙烯醇）进行透明化，使切片更清晰透明。
最后，在将切片装载到显微镜载玻片上之前，需要使用封片剂固定和封存切片，以防水和保护切片。
总结起来，冰冻切片技术在生物学研究中扮演着重要的角色，因为它可以提供高分辨率的细胞和组织结构图像。
在进行冰冻切片之前，样本处理的质量和细致程度对最终结果的影响极大；切片技巧则需要合理地调整和准备切片机的各项参数；切片后还需要进行相应的处理步骤，以提高切片结果的质量。
冰冻切片注意事项课件
THANK YOU
冷冻温度与时间控制
总结词
详细描述
切片厚度与刀片选择
总结词
切片厚度和刀片选择直接影响到冰冻切片的观察效果和制片质量。
详细描述
应根据检查目的和组织特性选择合适的切片厚度和刀片类型。对于较软的组织，应使用较薄的切片和锐利的刀片， 而对于较硬的组织，则应使用较厚的切片和钝刀片。此外，在制作过程中要保持刀片的清洁和锋利，并及时更换 刀片。
细胞固定与透化方法的应用
总结词
详细描述
05
冰冻切片制作实例分析
实验一：冰冻切片制作过程解析
冰冻切片制作的基本原理 实验步骤详解 常见问题及解决方案
实验 二
01
不同组织样本的特点
02
制作技巧与要点
03
实例分析
实验三：染色与观察方法优化研究
染色方法的选择
观察方法的优化
实例展示
实验四：细胞结构保护与固定方法研究
度或更换刀片。
切片易碎或断裂
01
总结词
02
详细描述
03
解决方案
染色不均匀或颜色不鲜艳
总结词 详细描述 解决方案
细胞结构不清晰或模糊
总结词 详细描述 解决方案
04
冰冻切片制作技巧与经验分享
冷冻时间与温度的掌握
总结词
合适的冷冻时间和温度是冰冻切片的关 键因素，可以影响切片的品质和染色效果。
VS
详细描述
冰冻切片的冷冻时间应该根据组织的类型 和厚度来确定，一般来说，较厚的组织需 要更长的冷冻时间。同时，冷冻温度应该 控制在-20℃以下，以确保切片的质量。
切片厚度与刀片角度的调整
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11
防止切片卷缩
? 常见原因
– 切片刀钝或粘有组织碎屑 – 防卷板位置不正确或防卷板较脏 – 静电或者气流作用 – 防卷板温度高、室温高
? 采取对策：
– 保持防卷板干净、平整、无缺损、无刮伤 – 戴口罩，以避免呼出的气流直接吹到防卷板 – 切片时间过长时，应注意间隔一会儿，盖上冷冻室
L1 DRG
3
Con. TNBS
LY ZD7288
2014.4.20 TRPV1+CGRP
同一载玻片上 ? 包括各个所有组 ? 染色齐性
TNBS
ZD7288
Con. LY
L1 DRG
L1 DRG
1
Con. TNBS
LY ZD7288
2014.4.20 TRPV1+CGRP
Con. LY
TNBS
ZD7288
L1 DRG
Con. TNBS
2
LY ZD7288
2014.4.20 TRPV1+CGRP
Con. LY
载玻片上标记（铅笔） ? 组织类型 ? 时间 ? 组别 ? 检测抗原类型
? 固定剂种类：醛类、非醛类、丙酮及醇类
– 中性缓冲液配制多种聚甲醛较为常用
? 组织固定时
– 固定液要有足够的量(固定液是组织体积的8-10倍) – 保持一定时间，快速灌注固定后，相同的固定剂再固定
2-4h（ 4℃冰箱）
8
减少冰晶的形成
? 公认：未经固定的组织切片冰晶较多 ? 固定后的组织切片仍然会有一定的冰晶，
盖，降低防卷板温度
12
贴片中常见问题及处理
? 载玻片粘不上切片
– 准备的载玻片温度过低 – 将载玻片置于常温即可
? 贴片时切片易碎
– 排除固定不充分等因素外 – 贴片时应注意动作轻、稳、准 – 根据切片大小，选用笔尖软硬适中、大小合适
的毛笔
根本的解决方法：多观察，多练习，熟能生巧
13
贴片方式及标记
2
一、冰冻切片的优缺点
? 优点：
– 简便，快速，用时短
? 可以不需要对组织固定、脱水、透 明、包埋
? 组织变化不大
? 能很好保存脂肪，类脂
? 能够比较完好地保存各种抗原活性 及酶类
? 对有机溶剂或热的温度耐受能力较 差的细胞膜表面抗原 和水解酶 保存 较好。
? 缺点：
– 不容易做连续切片 – 组织不能过大-不容易冻结
依据科学研究的需要选择方法
5
1. 动物取材：一定要注意“平行性”
横向
纵 向
ห้องสมุดไป่ตู้
1 Control 2 Control 3 Control
1 sham 2 sham 3 sham
1 I/R
1 I/R+treatment
2 I/R
2 I/R+treatment
3 I/R
3 I/R+treatment
4 Control 5 Control 6 Control
或者组织冻结不均
– 不容易制作较薄的切片
– 冻结过程中容易产生水的结 晶而影响细胞的形态结构及 抗原物质的定位
– 组织结构不如石蜡切片清晰， 但是满足科研的要求
针对其缺点要注意操作条件优化，避免错误
3
二、切片制作过程中几个关键步骤
? 1. 动物取材 ? 2. 组织固定 ? 3. 切片制作 ? 4. 切片染色
环境条件对染色影响）
? 发表、修改文章图的一致性
6
举例：不同实验时间和条件下同种一染 色方法结果差异
A
B
C
Masson staining
7
2. 标本固定应充分
? 固定的标准
– 切片冰晶少，细胞挤压变形小，切片完整，染色清晰
? 一般较多采用 组织固定后再行切片 ? 浸入法和灌注法
– 浸入法：活检、手术标本，不能进行灌注的组织固定 – 灌注法：动物实验研究
? 选择不同的冷冻度 ? 根据不同的组织而定
– 未经固定的脑组织、肝组织： -10- -15℃左右 – 甲状腺、脾、肾、肌肉等组织： -15～20℃ – 含脂肪组织，-25℃左右 – 含大量的脂肪 -30℃
10
保持切片的完整性
? 切片破碎不全、有缺损的常见原因
– 固定不完全 – 温度设置不当 – 组织块过冷、过硬 ，则切片就容易破碎 – 组织块冷冻不够，硬度和韧度达不到，切片也同
冰冻切片制作与染色过程中 常见的问题
夏春梅 cmxia@
1
问题思考
? 组织是否 足够新鲜？1w以内？ ? 灌注固定液、洗液 PH值、离子浓度 是否合适？ ? 一抗是选择途径，滴度 如何确定的？ ? 是否阅读过 DATASHEET ? 保存，有效期， reactivity,
Cross-Reactivity ？ ? 对该蛋白表达和分布 有无预期的估计和了解 ? ? 是否设了 阳性和阴性对照 ？ ? 是否排除了 自发荧光？ ? 是不是判读正确？
? 好的切片制作和染色成功的关键
– 细节决定成败
? 固定、漂洗溶液PH值，成分；切片厚度、手感；抗体效价、 特异性；切片孵育时间，湿度、温度；
? 切片判读正确-反映真实的科学现象
? 知识结构背景
? 组织学结构的熟悉 …… ? 认识病理改变：炎细胞侵润、坏死、水肿、蛋白变性、纤维化、增
生、凋亡 …… ? 审美观、拍照角度、视野、曝光时间、对比度 ……
4
– 常规HE染色 – 特殊染色
? 如：Masson(Thichrome staining)，油红O，尼氏染色， 台盼蓝（肥大细胞）染色
– 免疫染色 (immunol staining)
? 免疫荧光(immunol fluorescence) ? 免疫组化(immunol histochemistry)
为防止冰晶的形成 ? 采取如下方法
– 速冻法：将组织置入低温环境，使组织骤然降 温
– 利用高渗溶液吸收组织水分子 ：将组织置于 20% —30%的蔗糖溶液中，置 4摄氏度冰箱足够 时间（多长时间 ? 判定？）
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3. 切片：组织新鲜非陈旧标本 是成 败首要因素
? 低温恒冷箱冰冻切片法 ? 组织快速冷冻到一定的硬度(机器要预冷)
4 sham 5 sham 6 sham
4 I/R
4 I/R+treatment
5 I/R
5 I/R+treatment
6 I/R
6 I/R+treatment
横向“block”
? 预实验时早发现趋势而不被误导，减少无效率的工作量
? 减少不同组间baseline 的影响，便于不同批次实验组间比较（背景，抗体效价，