冰冻切片制作与染色过程中常见问题与处理
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4
– 常规HE染色 – 特殊染色
? 如：Masson(Thichrome staining)，油红O，尼氏染色， 台盼蓝（肥大细胞）染色
– 免疫染色 (immunol staining)
? 免疫荧光(immunol fluorescence) ? 免疫组化(immunol histochemistry)
冰冻切片制作与染色过程中 常见的问题
夏春梅 cmxia@fudan.edu.cn
1
问题思考
? 组织是否 足够新鲜？1w以内？ ? 灌注固定液、洗液 PH值、离子浓度 是否合适？ ? 一抗是选择途径，滴度 如何确定的？ ? 是否阅读过 DATASHEET ? 保存，有效期， reactivity,
Cross-Reactivity ？ ? 对该蛋白表达和分布 有无预期的估计和了解 ? ? 是否设了 阳性和阴性对照 ？ ? 是否排除了 自发荧光？ ? 是不是判读正确？
4 sham 5 sham 6 sham
4 I/R
4 I/R+treatment
5 I/R
5 I/R+treatment
6 I/R
6 I/R+treatment
横向“block”
? 预实验时早发现趋势而不被误导，减少无效率的工作量
? 减少不同组间baseline 的影响，便于不同批次实验组间比较（背景，抗体效价，
? 选择不同的冷冻度 ? 根据不同的组织而定
– 未经固定的脑组织、肝组织： -10- -15℃左右 – 甲状腺、脾、肾、肌肉等组织： -15～20℃ – 含脂肪组织，-25℃左右 – 含大量的脂肪 -30℃
10
保持切片的完整性
? 切片破碎不全、有缺损的常见原因
– 固定不完全 – 温度设置不当 – 组织块过冷、过硬 ，则切片就容易破碎 – 组织块冷冻不够，硬度和韧度达不到，切片也同
L1 DRG
1
Con. TNBS
LY ZD7288
2014.4.20 TRPV1+CGRP
Con. LY
TNBS
ZD7288
L1 DRG
Con. TNBS
2
LY ZD7288
2014.4.20 TRPV1+CGRP
Con. LY
载玻片上标记（铅笔） ? 组织类型 ? 时间 ? 组别 ? 检测抗原类型
2
一、冰冻切片的优缺点
? 优点：
– 简便，快速，用时短
? 可以不需要对组织固定、脱水、透 明、包埋
? 组织变化不大
? 能很好保存脂肪，类脂
? 能够比较完好地保存各种抗原活性 及酶类
? 对有机溶剂或热的温度耐受能力较 差的细胞膜表面抗原 和水解酶 保存 较好。
? 缺点：
– 不容易做连续切片 – 组织不能过大-不容易冻结
或者组织冻结不均
– 不容易制作较薄的切片
– 冻结过程中容易产生水的结 晶而影响细胞的形态结构及 抗原物质的定位
– 组织结构不如石蜡切片清晰， 但是满足科研的要求
针对其缺点要注意操作条件优化，避免错误
3
二、切片制作过程中几个关键步骤
? 1. 动物取材 ? 2. 组织固定 ? 3. 切片制作 ? 4. 切片染色
盖，降低防卷板温度
12
贴片中常见问题及处理
? 载玻片粘不上切片
– 准备的载玻片温度过低 – 将载玻片置于常温即可
? 贴片时切片易碎
– 排除固定不充分等因素外 – 贴片时应注意动作轻、稳、准 – 根据切片大小，选用笔尖软硬适中、大小合适
的毛笔
根本的解决方法：多观察，多练习，熟能生巧
13
贴片方式及标记
样易粘、易碎 – 组织块带有皮肤、包膜、过大或冰晶过多 – 切片刀钝或较脏 ，切片出现刮痕，使切片不完整 – 操作手法不当，如速度不适宜
11
防止切片卷缩
? 常见原因
– 切片刀钝或粘有组织碎屑 – 防卷板位置不正确或防卷板较脏 – 静电或者气流作用 – 防卷板温度高、室温高
? 采取对策：
– 保持防卷板干净、平整、无缺损、无刮伤 – 戴口罩，以避免呼出的气流直接吹到防卷板 – 切片时间过长时，应注意间隔一会儿，盖上冷冻室
环境条件对染色影响）
? 发表、修改文章图的一致性
6
举例：不同实验时间和条件下同种一染 色方法结果差异
A
B
C
Masson staining
7
2. 标本固定应充分
? 固定的标准
– 切片冰晶少，细胞挤压变形小，切片完整，染色清晰
? 一般较多采用 组织固定后再行切片 ? 浸入法和灌注法
– 浸入法：活检、手术标本，不能进行灌注的组织固定 – 灌注法：动物实验研究
L1 DRG
3
Con. TNBS
LY ZD7288
2014.4.20 TRPV1+CGRP
同一载玻片上 ? 包括各个所有组 ? 染色齐性
TNBS
ZD7288
Con. LY
L1 DRG
依据科学研究的需要选择方法
5
1. 动物取材：一定要注意“平行性”
横向
纵 向
1 Control 2 Control 3 Control
1 sham 2 sham 3 sham
1 I/R
1 I/R+treatment
2 I/R
2 I/R+treatment
3 I/R
3 I/R+treatment
4 Control 5 Control 6 Control
? 好的切片制作和染色成功的关键
– 细节决定成败
? 固定、漂洗溶液PH值，成分；切片厚度、手感；抗体效价、 特异性；切片孵育时间，湿度、温度；
? 切片判读正确-反映真实的科学现象
? 知识结构背景
? 组织学结构的熟悉 …… ? 认识病理改变：炎细胞侵润、坏死、水肿、蛋白变性、纤维化、增
生、凋亡 …… ? 审美观、拍照角度、视野、曝光时间、对比度 ……
? 固定剂种类：醛类、非醛类、丙酮及醇类
– 中性缓冲液配制多种聚甲醛较为常用
? 组织固定时
– 固定液要有足够的量(固定液是组织体积的8-10倍) – 保持一定时间，快速灌注固定后，相同的固定剂再固定
2-4h（ 4℃冰箱）
8
减少冰ຫໍສະໝຸດ Baidu的形成
? 公认：未经固定的组织切片冰晶较多 ? 固定后的组织切片仍然会有一定的冰晶，
为防止冰晶的形成 ? 采取如下方法
– 速冻法：将组织置入低温环境，使组织骤然降 温
– 利用高渗溶液吸收组织水分子 ：将组织置于 20% —30%的蔗糖溶液中，置 4摄氏度冰箱足够 时间（多长时间 ? 判定？）
9
3. 切片：组织新鲜非陈旧标本 是成 败首要因素
? 低温恒冷箱冰冻切片法 ? 组织快速冷冻到一定的硬度(机器要预冷)
– 常规HE染色 – 特殊染色
? 如：Masson(Thichrome staining)，油红O，尼氏染色， 台盼蓝（肥大细胞）染色
– 免疫染色 (immunol staining)
? 免疫荧光(immunol fluorescence) ? 免疫组化(immunol histochemistry)
冰冻切片制作与染色过程中 常见的问题
夏春梅 cmxia@fudan.edu.cn
1
问题思考
? 组织是否 足够新鲜？1w以内？ ? 灌注固定液、洗液 PH值、离子浓度 是否合适？ ? 一抗是选择途径，滴度 如何确定的？ ? 是否阅读过 DATASHEET ? 保存，有效期， reactivity,
Cross-Reactivity ？ ? 对该蛋白表达和分布 有无预期的估计和了解 ? ? 是否设了 阳性和阴性对照 ？ ? 是否排除了 自发荧光？ ? 是不是判读正确？
4 sham 5 sham 6 sham
4 I/R
4 I/R+treatment
5 I/R
5 I/R+treatment
6 I/R
6 I/R+treatment
横向“block”
? 预实验时早发现趋势而不被误导，减少无效率的工作量
? 减少不同组间baseline 的影响，便于不同批次实验组间比较（背景，抗体效价，
? 选择不同的冷冻度 ? 根据不同的组织而定
– 未经固定的脑组织、肝组织： -10- -15℃左右 – 甲状腺、脾、肾、肌肉等组织： -15～20℃ – 含脂肪组织，-25℃左右 – 含大量的脂肪 -30℃
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保持切片的完整性
? 切片破碎不全、有缺损的常见原因
– 固定不完全 – 温度设置不当 – 组织块过冷、过硬 ，则切片就容易破碎 – 组织块冷冻不够，硬度和韧度达不到，切片也同
L1 DRG
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Con. TNBS
LY ZD7288
2014.4.20 TRPV1+CGRP
Con. LY
TNBS
ZD7288
L1 DRG
Con. TNBS
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LY ZD7288
2014.4.20 TRPV1+CGRP
Con. LY
载玻片上标记（铅笔） ? 组织类型 ? 时间 ? 组别 ? 检测抗原类型
2
一、冰冻切片的优缺点
? 优点：
– 简便，快速，用时短
? 可以不需要对组织固定、脱水、透 明、包埋
? 组织变化不大
? 能很好保存脂肪，类脂
? 能够比较完好地保存各种抗原活性 及酶类
? 对有机溶剂或热的温度耐受能力较 差的细胞膜表面抗原 和水解酶 保存 较好。
? 缺点：
– 不容易做连续切片 – 组织不能过大-不容易冻结
或者组织冻结不均
– 不容易制作较薄的切片
– 冻结过程中容易产生水的结 晶而影响细胞的形态结构及 抗原物质的定位
– 组织结构不如石蜡切片清晰， 但是满足科研的要求
针对其缺点要注意操作条件优化，避免错误
3
二、切片制作过程中几个关键步骤
? 1. 动物取材 ? 2. 组织固定 ? 3. 切片制作 ? 4. 切片染色
盖，降低防卷板温度
12
贴片中常见问题及处理
? 载玻片粘不上切片
– 准备的载玻片温度过低 – 将载玻片置于常温即可
? 贴片时切片易碎
– 排除固定不充分等因素外 – 贴片时应注意动作轻、稳、准 – 根据切片大小，选用笔尖软硬适中、大小合适
的毛笔
根本的解决方法：多观察，多练习，熟能生巧
13
贴片方式及标记
样易粘、易碎 – 组织块带有皮肤、包膜、过大或冰晶过多 – 切片刀钝或较脏 ，切片出现刮痕，使切片不完整 – 操作手法不当，如速度不适宜
11
防止切片卷缩
? 常见原因
– 切片刀钝或粘有组织碎屑 – 防卷板位置不正确或防卷板较脏 – 静电或者气流作用 – 防卷板温度高、室温高
? 采取对策：
– 保持防卷板干净、平整、无缺损、无刮伤 – 戴口罩，以避免呼出的气流直接吹到防卷板 – 切片时间过长时，应注意间隔一会儿，盖上冷冻室
环境条件对染色影响）
? 发表、修改文章图的一致性
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举例：不同实验时间和条件下同种一染 色方法结果差异
A
B
C
Masson staining
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2. 标本固定应充分
? 固定的标准
– 切片冰晶少，细胞挤压变形小，切片完整，染色清晰
? 一般较多采用 组织固定后再行切片 ? 浸入法和灌注法
– 浸入法：活检、手术标本，不能进行灌注的组织固定 – 灌注法：动物实验研究
L1 DRG
3
Con. TNBS
LY ZD7288
2014.4.20 TRPV1+CGRP
同一载玻片上 ? 包括各个所有组 ? 染色齐性
TNBS
ZD7288
Con. LY
L1 DRG
依据科学研究的需要选择方法
5
1. 动物取材：一定要注意“平行性”
横向
纵 向
1 Control 2 Control 3 Control
1 sham 2 sham 3 sham
1 I/R
1 I/R+treatment
2 I/R
2 I/R+treatment
3 I/R
3 I/R+treatment
4 Control 5 Control 6 Control
? 好的切片制作和染色成功的关键
– 细节决定成败
? 固定、漂洗溶液PH值，成分；切片厚度、手感；抗体效价、 特异性；切片孵育时间，湿度、温度；
? 切片判读正确-反映真实的科学现象
? 知识结构背景
? 组织学结构的熟悉 …… ? 认识病理改变：炎细胞侵润、坏死、水肿、蛋白变性、纤维化、增
生、凋亡 …… ? 审美观、拍照角度、视野、曝光时间、对比度 ……
? 固定剂种类：醛类、非醛类、丙酮及醇类
– 中性缓冲液配制多种聚甲醛较为常用
? 组织固定时
– 固定液要有足够的量(固定液是组织体积的8-10倍) – 保持一定时间，快速灌注固定后，相同的固定剂再固定
2-4h（ 4℃冰箱）
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减少冰ຫໍສະໝຸດ Baidu的形成
? 公认：未经固定的组织切片冰晶较多 ? 固定后的组织切片仍然会有一定的冰晶，
为防止冰晶的形成 ? 采取如下方法
– 速冻法：将组织置入低温环境，使组织骤然降 温
– 利用高渗溶液吸收组织水分子 ：将组织置于 20% —30%的蔗糖溶液中，置 4摄氏度冰箱足够 时间（多长时间 ? 判定？）
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3. 切片：组织新鲜非陈旧标本 是成 败首要因素
? 低温恒冷箱冰冻切片法 ? 组织快速冷冻到一定的硬度(机器要预冷)