RTPCR和western Blot

一、RT-PCR步骤RNA提取（-70℃保存）

1. 组织剪碎加入1ml Trizol，冰上匀浆（边匀浆边暂停）

2. 转入一新EP管中（1.5ml），室温保存5min

3. 加氯仿0.2ml，振荡混合（手摇剧烈），室温放置5min

4. 10000 rpm 4℃离心15min

5. 转移上层水相（吸70%）到一新EP管中，加异丙醇0.5ml,振荡混合，室温保存10min

6. 12000rpm 4℃离心15min

7. 倒掉上清，加1ml 75%无水乙醇（4℃保存），振荡混合，10000rpm 4℃离心5min

8. 倒掉上清，室温或37℃放置20min(EP管倒置在滤纸上)使RNA沉淀干燥

9. 加20ul DEPC水至EP管中

10. 在60℃孵育3-5min(或手握3-5min),使RNA充分溶解测RNA浓度

二、上机操作

1．10ul的反应体系，冰上操作，稍后短时间离心

Template 1ul

Primer 1 3ul

Primer 2 3ul

Master 5ul

ddH2O 补至10ul

2.PCR循环:

Stage1：预变性

95℃30s

Stage2：PCR反应

95℃5s

60℃20s

40 Cycles

2.3 Western Blot检测蛋白变化

2.3.1 蛋白样品制备

2.3.1.2 裂解蛋白

1)适量组织（最好放入液氮中反复研磨成粉状）加入裂解液中。一般100mg组织加1mlRIPA+10ulPMSF

2) 将组织匀浆转入1.5ml的EP管中（eppendorf 管、离心管）。12000r/min 4℃离心15min。离心后EP管中液体分三层，提取中间无色液相，移入新的EP管中。可-80℃保存。

2.3.1.3 蛋白浓度测定及蛋白样品制备

1) 分别向5 个1.5ml 的EP 管中加入无菌水800μl；然后加入BSA（2mg/ml）标准蛋白，分别为0、1、2、4、8μl；

2) 向0.5ml 的EP 管中加入400μl无菌水，然后加入1μl 蛋白样品；

3) 向标准管和样品管中分别加入200μl和100μl 蛋白染液；

4) 上下颠倒混匀EP管中的溶液；

5) 从每管中取出200μl 混合液加入96 孔板内中；

6) 使用酶标仪测定吸光值；

7) 依据标准蛋白吸光值绘制蛋白标准曲线，然后计算出蛋白样品的浓度；

8) 制备一定质量的蛋白样品，进行Western Blot检测；

9) 蛋白样品95℃变性5min，保存在-20℃的冰箱在或直接进行SDS凝胶电泳。

2.3.2 SDS-PAGE

2.3.2.1制胶

根据配方配制所需的12%分离胶和5%浓缩胶。

2.3.2.2 灌胶

10) 清洁玻璃板，然后固定于制胶器中，用水检测是否密封，然后开始灌胶；

11) 加入12%分离胶7 ml，再加入水饱和正丁醇200 μl消泡并隔绝空气。，等一段时间后分离胶凝固，倒出正丁醇，去离子水冲洗净残留的正丁醇，加入5%浓缩胶并插入与玻璃板规格匹配的梳子；

12) 浓缩胶凝固后，小心拔出梳子，待用。

2.3.2.3 上样

将样品在95℃下变性5 min，然后加入到加样孔中，电泳槽中的缓冲液是1×Running Buffer。

2.3.2.4

90 V电压下样品被压缩到浓缩胶与分离胶的分界处，然后将电压提高为120 V，当溴酚蓝跑至玻璃板边缘处停止电泳。

2.3.3 转膜

1) 根据胶的大小裁剪PVDF膜并做好标记，使用前甲醇活化1 min；

2) 将转膜使用的滤纸、垫子、夹子以及活化好的PVDF膜浸泡在转膜缓冲液中。

3) 从电泳槽中拿出玻璃板并用切胶器撬开，去掉浓缩胶以及多余的分离胶部分，将剩下的分离胶移入转膜缓冲液中；

4) 在转膜的夹子上，先放垫子，然后滤纸，再在滤纸上放胶、最后PVDF正面盖上胶，用切胶器去除PVDF膜和胶之间的气泡，然后再盖上滤纸和垫子，合上夹子，放进转膜槽中，加适量-20℃预冷的转膜缓冲液。电压150 V转膜2-3 h，期间转膜槽需冰浴，避免转膜过程产热影响转膜效果；

5) 转膜结束后用镊子取出PVDF膜，丽春红染色，观察转膜效果，然后用1×PBS-T脱色。

6) 5%脱脂奶粉溶液封闭PVDF膜，摇床上缓慢摇动孵育1h后，倒掉脱脂奶粉溶液，1×PBS-T洗PVDF膜，5 min/次，洗三次；

2.3.4 免疫反应

1) 用一抗稀释液孵育PVDF膜，在4℃冰箱中，摇床上缓慢摇动孵育过夜；

2) 回收一抗溶液，然后用1×PBS-T洗膜，10 min/次，洗2次；

3) 将膜置于3%脱脂奶粉稀释的二抗溶液中孵育1 h，弃二抗，1×PBS-T液洗膜，10 min/次，洗3次；

2.3.5显影：

等体积混合Millipore Immobilon Western 化学发光HRP底物A液和B液，将PVDF膜浸在液体，孵育5 min，然后用保鲜膜包好，用吸水纸吸去残余液体，膜正面朝上固定在压片夹中，暗室中将感光胶片放入压片夹中，适当时间后，取出胶片放入显影机中显影。