(整理)大肠杆菌及其检验.

＋┃＋┃－┃－┃典型大肠杆菌
－┃＋┃－┃－┃非典型大肠杆菌
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＋┃＋┃－┃＋┃典型中间型
－┃＋┃－┃＋┃非典型中间型
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－┃－┃＋┃＋┃典型产气肠杆菌
＋┃－┃＋┃＋┃非典型产气肠杆菌
附：麦康凯琼脂平板照片
EMB平板原理及照片
生化试验:
自鉴别平板上直接挑取数个菌落分别接种三糖铁琼脂(TSI)或克氏双糖铁琼脂(KI)。同时将这些培养物分别接种蛋白胨水、半固体、pH7.2尿素琼脂、KCN肉汤和赖氨酸脱羧酶试验培养基。以上培养物均在36℃培养过夜。
TSI斜面产酸或不产酸，底层产酸，H2S阴性，KCN阴性和尿素阴性的培养物为大肠埃希氏菌。TSI底层不产酸，或H2S、KCN、尿素有任一项为阳性的培养物，均非大肠埃希氏菌。必要时做氧化酶试验和革兰氏染色。
改良EC新生霉素增菌肉汤（mEC）：EC肉汤灭菌后添加20mg/mL过滤除菌的新生霉素，使终浓度为20μg/mL。
改良山梨醇麦康凯琼脂（TC-SMAC）：山梨醇麦康凯琼脂加入过滤除菌的1%亚碲酸钾溶液，使终浓度2.5mg/L，头孢克污，使终浓度为0.05mg/L。
MUG-LST肉汤：LST肉汤中添加4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG），使终浓度为0.1g/L。
证实试验：制备O抗原悬液，稀释至与Mac Farland3号比浊管相当的浓度。原效价为1：160～1：320的O血清，用0.5%盐水稀释至1：40。稀释血清与抗原悬液在10mm×75mm试管内等量混合，做单管凝集试验。混匀后放于50℃水浴箱内，经16h后观察结果。如出现凝集，可证实为该O抗原。
附：致泻性大肠杆菌及O血清。
起散发性或暴发性出血性结肠炎
致病机理
LT、ST
定居因子
细胞毒素
定居因子
侵袭肠粘膜细胞
细胞毒素
常见ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ血清型
6、8、15、20、25、27、78、148、159
2、26、44、55、86、111、114、119、125、126、127、128、142、146、158
28、29、112、124、136、143、144、152、164、167
(3)肠侵袭性大肠杆菌（Enteroinvasive E.coli,EIEC）:EIEC的多数菌株无动力，生化反应和抗原结构均近似痢疾杆菌，应予注意。
（4）肠出血性大肠杆菌（Enterohemorrhagic E.coli,EHEC）:引起散发性或暴发性出血性结肠炎，可产生志贺氏毒素样细胞毒素。EHCO的主要菌型是O157：H7，还可有O26、OⅢ等。
观察试管的产气情况：检查倒管内是否有气泡产生,用直径为3mm的接种环将所有48±2h内产气的LST肉汤管培养物移种于EC肉汤管中。将所有接种的EC肉汤管在30min内放入带盖44.5±0.5℃水浴箱内,培养48±2h。
附：LST肉汤、EC肉汤有些什么？
EMB平板：
取其产气管的培养物划线接种于伊红美蓝(EMB)平板,36±1℃培养24±2h。
2、增菌培养
秤取25克样品放入225mL mEC中，均质。于41±1℃培养18-24小时。
3、分离
将mEC肉汤培养物10倍递增稀释。从10-4，10-5，10-6稀释度，各取0.1mL涂布于TC-SMAC平板。于36±1℃培养18~24小时。
肠毒素试验（产毒素性大肠杆菌）（LT－不耐热肠毒素，ST－耐热肠毒素）
1酶联免疫吸附试验检测LT和ST。
2双向琼脂扩散试验检测LT
3乳鼠罐胃试验检测ST
附：肠毒素试验
结果报告
综合以上生化试验、血清学试验、肠毒素试验作出报告。
大肠杆菌O157:H7的检验
出血性大肠杆菌O157:H7介绍
1、培养基制备：
（3）粘液型：常为含有荚膜的菌株。
此菌兼性厌氧，在有氧条件下生长良好，最适生长pH为6.8-8.0，所用培养基pH为7.0-7.5,若pH值低于6.0或高于8.0则生长缓慢。
附：菌落形态有什么用处？菌落形态学
生化反应
大部分菌株发酵乳糖产酸产气，并发酵葡萄糖、麦芽胞、甘露醇、木胶糖、阿拉伯胶等产酸产气。
表：引起急性腹泻的大肠杆菌
肠产毒性大肠杆菌
肠致病性大肠杆菌
肠侵袭性大肠杆菌
肠出血性大肠杆菌
感染部位
小肠
小肠
大肠
大肠
腹泻类型
水泻
水泻
痢疾样
血性腹泻
易感人群
婴儿，成人
婴儿
成人，儿童
各种年龄
分布
发展中国家(热带)
世界各地
世界各地
北美、日本
流行病学
散发或暴发婴儿腹泻及旅游者腹泻
散发或暴发婴儿腹泻
散发或暴发，常见于年龄较大儿童
致泻性大肠杆菌简介
大肠杆菌为人和动物肠道中的常居菌，一般多不致病，在一定条件下可引起肠道外感染。
某些血清型菌株的致病性强，引起腹泻，与人类疾病有关的大肠杆菌，统称为致泻性大肠杆菌（enterovirulentE. coli）。
一般包括四种：
肠毒素性大肠杆菌（ETEC）
致病性大肠杆菌（EPEC）
出血性大肠杆菌（EHEC）
稀释样品匀液根据对样品污染情况的估计,用稀释剂将样品匀液制成一系列十倍递增的样品稀释液,如10**-2、10**-3、10**-4……。从制备样品匀液至稀释完毕,全过程不得超过15min。
附：这是一种9管MPN法测定方法，什么是MPN法？
LST和EC初步筛选：
对每个样品,选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液。每个稀释度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白(月示)(LST)肉汤,每管接种1mL。将接种管置于36±1℃培养48±2h。
O157：H7
鉴定
测定LT、ST、检出定居因子血清型
血清型与临床表现
血清型测定细菌侵袭力
血清型
大肠杆菌的检验方法
SN 0169—92出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法
GB/T 4789.6—1994食品卫生微生物学检验 致泻大肠埃希氏菌检验
以SN标准方法为例，进行说明。
样品制备：
以无菌操作取25 g样品,放入装有225 mL稀释剂的灭菌均质杯内,于8000 r/min均质1～2min,制成1:10样品匀液(也可用灭菌乳钵研磨的方法代替)。
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如出现上表以外的生化反应类型,表明培养物可能不纯,应重新划线分离,必要时做
重复试验。
结果报告：
大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌,发酵乳糖产酸产气,IMViC试验为＋＋
－－或－＋－－,再根据LST肉汤阳性管数查MPN表,报告每克(毫升)样品中大肠杆菌MPN
IMViC试验为“+、+、-、-”。即为典型大肠杆菌。
抗原构造
比较复杂，主要由菌体O抗原、鞭毛H抗原、夹膜K抗原组成。
抵抗力
该菌对热的抵抗力较其他肠道杆菌强，55℃经60分钟或60℃加热15分钟仍有部分细菌存活。
在自然界的水中可存活数周至数月，在温度较低的粪便中存活更久。对磺胺类、链霉素、氯霉素等敏感，但易耐药，是由带有R因子的质粒转移而获得的。
附：肠出血性大肠杆菌O157:H7介绍。
此外，肠粘附性大肠杆菌（Enteroadhesive E.coli,EAEC）也可引起腹泻，但对其发病机理与血清型尚不了解。EAEC不侵入肠上皮细胞，不产生LT或ST，也无VT毒素。唯一特征是具有与Hep-2细胞（人喉上皮细胞癌细胞系）粘附的能力，故也称Hep-2细胞粘附性大肠杆菌。
将MR-VP培养物的剩余部分再培养48h滴加5滴甲基红溶液。如培养物变红色,为甲基红试验阳性,若变黄色则为阴性反应。
附：MR-VP试验原理及照片
3 Koser氏枸椽酸盐肉汤：于36±1℃培养96h记录有无生长。
附：枸椽酸盐利用试验原理及斜面显色照片
4 LST肉汤：于36±1℃培养48±2h,观察试管中是否产气。
形态与染色
大小0.4～0.7×1～3um,无芽胞,大多数菌株有动力。
有普通菌毛与性菌毛，有些菌株有多糖类包膜，革兰氏阴性杆菌。
附：有动力是什么意思？请看动力试验。
革兰氏阴性杆菌是什么意思？请看革兰氏染色介绍。
大肠杆菌扫描电镜照片
大肠杆菌透射电镜照片
大肠杆菌分裂照片
最新：大肠杆菌革兰氏染色照片
培养特性
1色氨酸肉汤：在36±1℃培养24±2h后,加Kovacs氏试剂0.2～0.3mL,上层出现红色为靛基质阳性反应。
附：靛基质试验原理及照片
2 MR-VP培养基：在36±1℃培养48±2h。以无菌操作移取培养物1 mL至13mm×100mm试管中,加5％α-萘酚乙醇溶液0.6mL,40％氢氧化钾溶液0.2mL和少许肌酸结晶,振摇试管后静置2h,如出现伊红色,为VP试验阳性。
5革兰氏染色：取18h营养琼脂斜面培养物作革兰氏染色。大肠杆菌为革兰氏阴性。
大肠杆菌与非大肠杆菌生化鉴别如下：
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靛基质┃MR┃VP┃枸椽酸盐┃鉴定(型别)
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附：三糖铁琼脂(TSI)原理及照片
克氏双糖铁琼脂照片
尿素酶试验原理及照片
半固体培养基的作用？
血清学试验
假定试验：挑取经生化试验证实为大肠埃希氏菌的琼脂培养物，用致病性大肠埃希氏菌、侵袭性大肠埃希氏菌和产肠毒素大肠埃希氏菌多价O血清和出血性大肠埃希氏菌O157血清做玻片凝集试验。
当与某一种多价O血清凝集时，再与该多价血清所包含的单价O血清做试验。如与某一个单价O血清呈现强凝集反应，即为假定试验阳性。
大肠杆菌及其检验
大肠杆菌的生物学特性
简介：
大肠埃希氏菌习惯称为大肠杆菌，分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌属，并且大肠杆菌株ATCC 11775是该属的模式菌种。
附：肠杆菌科各属
大肠杆菌的不同菌株间DNA相关性为80%，而与同科的志贺氏菌属（除鲍氏志贺氏菌外）的DNA相关性可达80-87%。
大肠杆菌为人和动物肠道中的常居菌，一般多不致病，在一定条件下可引起肠道外感染。
（2）肠致病性大肠杆菌（Enteropathogenic E.coli,EPEC）:是婴儿腹泻的主要病原菌，有高度传染性，严重者可致死；成人少见。细菌侵入肠道后，主要在十二指肠、空肠和回肠上段大量繁殖。切片标本中可见细菌粘附于绒毛，导致刷状缘破坏、绒毛萎缩、上皮细胞排列紊乱和功能受损，造成严重腹泻。EPEC不产生LT或ST。有人报道，EPEC可产生一种由噬菌体编码的肠毒素，因对Vero细胞（绿猴肾传代细胞）有毒性，故称VT毒素。VT毒素的结构、作用与志贺氏毒素相似，具有神经毒素、细胞毒素和肠毒素性。鉴定EPEC可根据临床表现与血清型。
侵袭性大肠杆菌（EIEC）。
（1）肠产毒性大肠杆菌（Enterotoxigenic E. coli,ETEC）：引起婴幼儿和旅游者腹泻，出现轻度水泻，也可呈严重的霍乱样症状。腹泻常为自限性，一般2～3天即愈。营养不良者可达数周，也可反复发作。致病因素是LT或ST，或两者同时致病。有些菌株具有定居因子，常见者为O6：K15：H16、O25：K7：H42。鉴定ETEC主要测定大肠杆菌肠毒素，血清型有一定参考意义。
由于此菌合成代谢能力强，在含无机盐、胺盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。
最适生长温度为37℃，在42-44℃条件下仍能生长，生长温度范围为15-46℃。
在普通营养琼脂上生长表现3种菌落形态：
（1）光滑型：菌落边缘整齐，表面有光泽、湿润、光滑、呈灰色，在生理盐水中容易分散。
（2）粗糙型：菌落扁平、干涩、边缘不整齐，易在生理盐水中自凝。
值。
致泻性大肠杆菌的检验（
增菌
以无菌手续称取检验25g，加在225mL营养肉汤中，以均质器打碎1min或用乳钵加灭菌砂磨碎。取出适量，接种乳糖胆盐培养基，以测定大肠菌群MPN，其余的移入500mL广口瓶内，于36±1℃培养6h。挑取1环，接种于1管30mL肠道菌增菌肉汤内，于42℃培养18h。
分离
将乳糖发酵阳性的乳糖胆盐发酵管和增菌液分别划线接种麦康凯或伊红美蓝琼脂平板；污染严重的检样，可将检样匀液直接划线接种麦康凯或伊红美蓝平板，于36±1℃培养18～24h，观察菌落。不但要注意乳糖发酵的菌落，同时也要注意乳糖不发酵和迟缓发酵的菌落。
检查平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。
如有典型菌落,则从每个平板上至少挑取2个典型菌落；如无典型菌落,则从每个平板上至少挑取2个可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位,移种到营养琼脂斜面上,36±1℃培养18～24h。
附：怎样进行平板划线分离？
平板划线示例
EMB平板原理及照片
生化试验：
将斜面培养物移种到下列培养基中进行生化试验。