方法开发讲座–客户提问与回答整理

0510方法开发讲座–客户提问与回答整理

1. Auto Blend Plus 技術適用所有Waters HPLC 系統嗎?

答：目前ACQUITY Arc，ACQUITY H-Class/H-Class Bio带有此项技术。

2. 方法开发一开始是否应该考虑到色谱柱宽pH耐受性的特点？

答：是的！除非目标药物及其杂质完全是中性化合物，否则pH对它们的反相保留、峰形与分离度影响最大。一定要在方法伊始就对pH进行筛查。筛查pH3, 5, 8, 10，能够较为全面的覆盖低-高pH值，对色谱柱也会有化学耐受性的要求。好在，有完全成熟的色谱柱产品（自2005年）可以承担这个工作。

3. 2.5um色谱柱在Arc系统上的压力如何？

答：一般来说色谱柱在LC系统的压力多少影响因素较多，如色谱柱粒径、柱长、流动相组成、流速、温度等都会产生影响。针对老师提及的“2.5um色谱柱在Arc系统上的压力“ 如柱长在10cm左右，常规HPLC 条件，流速在1.0ml/min，甲醇体系压力应该在2000psi～3000psi左右

4. Auto blend plus重现性如何（不同人员配置流动相结果的重现性）？

答：采用Auto Blend Plus技术，实验人员只需配制酸碱母液，随后即可根据需要在梯度表中设置所需的pH 条件进行测试（方法开发过程中所能尝试的pH 范围取决于酸碱母液p H缓冲范围）。通过这个技术，减少了方法开发过程中pH筛选所需要反复手动配制流动相的过程。因此可以减少由于不同人员配制流动相所带来的人为误差，提高结果的重现性。

5. 我是QC分析员，对于Chen Jing老师的PPT，能具体讲一下柱子的适用性吗？

答：简要说明如下：

●XBridge C18 ——耐受性最宽（pH 1-12），通用性强，很适合作为方法开发色谱柱全面筛选pH；

或者，对于既有方法流动相比较苛刻的项目，例如：流动相pH>7、含有三乙胺、高浓度磷酸盐、柱温较高、等等。

●XBridge ShieldRP18 ——耐受性次之（pH 2-11），通用性强，还兼容100%水相。可作为方法开

发时，XBridge C18之后的第二根柱；或者，既有方法要求高水相比例、同时比较苛刻的（同上）。

●XSelect CSH C18 ——耐受性宽（pH 1-11），表面带电杂化颗粒，对碱性药物或肽有独特的峰形与

载量的优势，在甲酸体系下尤为明显。

●XSelect HSS T3 ——特色硅胶C18柱（pH 2-8），大大增强对极性分子的反相保留能力，同时还是

“平衡柱”——适用于极性范围跨度大的项目。

●CORTECS C18——实心核硅胶颗粒，其中，2.7um 4.6x150mm柱压可兼容常规HPLC系统，并提供

最高柱效。特别适用于原料药、生产中控、以及清洁验证中的分析提速。

●CORTECS C18+ ——同上，但同时有表面带电技术，对碱性药物或肽有独特的峰形与载量的优势。

●XBridge苯基柱——化学耐受性最强的苯基柱（pH 1-12）。对芳香或平面结构化合物有优势。对

于既有方法用苯基柱，如流动相条件容易造成苯基柱键合相流失的（苯基流失峰可见），可优先考虑XBridge苯基柱。

●XSelect HSS PFP ——硅胶基质全氟苯基柱。对芳香或平面结构化合物有优势。

●XSelect CSH FP ——表面带电杂化颗粒基质氟苯基柱。对于碱性的芳香/平面结构化合物有优势。更详细的色谱柱特色与优势应用，请参见沃特世UPLC/HPLC色谱柱选择卡。

6. 请问平衡一根色谱柱通常需要多长时间？多少柱体积?

答：常规反相色谱柱（不含离子对试剂时）一般5～10倍柱体积初次平衡，3～5倍柱体积梯度间再平衡。时间，则是柱体积除以所采用的流速得到的数值。

7. 想問生物鹼(Alkaloid)若有同分異構物，會建議使用鹼性條件分析嗎? 在column選擇上較推薦離子交換column還是chiral column?

答：推荐了解Waters的UPCC技术，是同分异构体分离分析的优势技术。如果要在目前的仪器平台上，首推UPLC或UHPLC，C18柱、苯基柱、氟苯基柱，后两者主要是对于芳香类/平面结构类化合物而言，色谱柱的柱效水平配置一定要高（拼的就是柱效）。生物碱，在较高pH条件下保留增强，的确对同系物的分离可能有利，值得检查高pH条件。离子交换柱要看同分异构体是否是有电荷差异，如果没有不推荐。手性柱，可以考虑，就是条件比较难摸。

8. 实验中遇到的问题：酸性标准品在色谱柱上会出现两个峰，会有怎样的可能性？除调节pH之外还可以用什么方法解决？

答：有几种可能：1/标准品就是混合物质，特别是异构体，被色谱柱分开；2/该物质在特定条件下会有化学结构态的转化，并且能够被分开。确认原因，根据项目情况选择：彻底分开，或者改变条件（包括梯度、温度、色谱柱等）使得峰合并。

9. 色谱柱差异性的选择重点是哪方面？

答：内容可以很多很深，不详细解说了。有一个简化的参考工具，是Waters的色谱柱选择图，主要比较的是色谱柱的反相保留能力和硅醇基活性，后者对于碱性分析物在中等pH条件下的保留与峰形影响很大（提供链接：/selectivitychart），这个可以用于组织方法开发时的色谱柱筛选组。如果是分析目标很特定，也可以根据分析物化学结构进行一定的推测，什么条件和色谱柱会比较合适。

10. Auto Blend plus是一个独立的模块可以直接接在e2695上吗？

Auto Blend Plus 目前仅在ACQUITY Arc，ACQUITY H-Class/H-Class Bio系统上使用，Alliance 系统暂时不配备此项功能。

11. QDa检测器是单四级杆质谱吗？其灵敏度和紫外对比如何？

QDa 检测器是一款单四级杆质谱检测器，其对紫外检测是一个良好的补充，针对一些没有紫外吸收的样品可进行定性和定量检测，同时在方法开发过程中, 可以起到快速追踪色谱峰的作用，提高方法开发效率

12. 在筛选梯度的时候，曲线1、4、8是什么意思？

在Empower软件中，梯度表条件设置时有11条曲线，分别是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11号曲线，分别代表流动相组成的变化速率。